1、1實驗十二液相色譜儀的使用 實驗時間：2004年12月25日第三組：周煒學(xué)號：02321013 一、實驗?zāi)康?（一）掌握WatersHPLC的基本結(jié)構(gòu)及工作原理； （二）了解WatersHPLC的性能特點及應(yīng)用范圍； （三）熟悉WatersHPLC的操作步驟。 二、基本結(jié)構(gòu)及工作原理 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。高效液相色譜法包括四種基本類型：分配色譜（PC）、吸附色譜（AC）又稱液固色譜（LSC）、離子交換色譜（IEC）、尺寸排斥色譜（SEC）又稱凝膠色譜（GC）。

2、 （一）基本結(jié)構(gòu)及工作流程 高效液相色譜儀可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)；進(jìn)樣系統(tǒng)；分離系統(tǒng)；檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：梯度淋洗裝置；自動進(jìn)樣裝置；數(shù)據(jù)處理器等。其結(jié)構(gòu)示意圖如下。 首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。 （二）分配色譜法的基本原理 分配色譜法是四種高效液相色譜法中應(yīng)用最廣的一種，它的原理類似于溶劑萃取。一般將分配色譜分為液液分配色譜（LLPC）和化學(xué)鍵合相分配色譜（CBPC）兩類

3、。本實驗采用化學(xué)鍵合相分配色譜法。 1.液液分配色譜法 在液-液色譜中，流動相和固定相都是液體，它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，還是離子型的和非離子型的化合物。液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。 2.化學(xué)鍵和相分配色譜法 化學(xué)鍵合固定相是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對液相色譜法迅

4、速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計，約有3/4以上的分離問題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。 三、性能特點及應(yīng)用范圍 （一）高效液相色譜儀的特點及應(yīng)用范圍 高效液相色譜儀是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、

5、操作自動化的特點。 1.分離效率高：使用新型填充物,粒度可小于50微米,每米色譜柱的塔板數(shù)達(dá)5000以上。 2.分離速度快：采用高壓輸液泵，流動相壓力高達(dá)300千克力/厘米2以上,流速遠(yuǎn)比經(jīng)典液相色譜法為快，分離速度可與氣相色譜法相比。 3.靈敏度高：流出液流經(jīng)紫外或熒光等檢測器，可直接檢出低至10-1310-10克的物質(zhì)。 4.應(yīng)用范圍廣：可以測定高沸點、熱不穩(wěn)定等不宜于用氣相色譜法測定的大分子量的化合物。環(huán)境中的一些致癌物質(zhì)如黃曲霉毒素、多環(huán)芳烴以及除莠劑、殺蟲劑等都可以用高效液相色譜法進(jìn)行快速、靈敏的分析測定。大氣飄塵的多環(huán)芳烴從兩環(huán)的萘至五環(huán)的苯并(a)芘等10多種化合物，在半小時內(nèi)便

6、可分離測定。應(yīng)用紫外檢測器可以檢知含量為纖克米3級的多環(huán)芳烴。 正是因為高效液相色譜法具有如此多的優(yōu)點，所以又被稱為現(xiàn)代液相色譜法、高雅液相色譜法、高速液相色譜法。 作者： 化學(xué)小朋友 2005-4-8 13:24 回復(fù)此發(fā)言 2實驗十二液相色譜儀的使用 （二）WatersHPLC各部件的性能特點 WatersBreezeHPLC系統(tǒng) 是一套在簡潔、高性能、可靠性和價位平實之間取得平衡的，能廣泛適用同時易用的HPLC系統(tǒng)。此外，本系統(tǒng)是非常靈活的，可以定制部件來適應(yīng)用戶的應(yīng)用需求。Breeze系統(tǒng)的部件列表如下。 最低計算機(jī)需求 Intel賽揚600MHz或更高，256MB內(nèi)存，有PCI插槽和

7、足夠空間以便插入BusLAC/E卡 微軟WindowsXP專業(yè)版，8GB硬盤，sVGA顯示器，4xCD-ROM驅(qū)動器 1.44MB軟驅(qū)，3.5英寸 支持微軟WindowsXP專業(yè)版的打印機(jī) 儀器控制 適用于單系統(tǒng) 1500系列HPLC泵 2487雙波長紫外/可見檢測器 2414示差折光檢測器 717plus自動進(jìn)樣器 1500系列柱溫箱 BusSAT/IN（采集Waters檢測器的數(shù)據(jù)） 采集 最多五個檢測器通道 數(shù)據(jù)能力 處理（LC&GPC），報告和存儲數(shù)據(jù)結(jié)果 數(shù)據(jù)輸出格式 PDF,EMF,AIA,ASCII,e-mail 1.Breeze軟件 適用于無需二極管陣列檢測器的用戶；集泵、檢測

8、器、進(jìn)樣器的實用功能于一身；易用的界面，方便的儀器控制，最低的培訓(xùn)要求，提高使用效率。 2.1500系列色譜泵 Waters1500HPLC系列包括等度和高壓梯度色譜系統(tǒng)，其中梯度系統(tǒng)包括三種規(guī)格：1525分析型，1525低流量型和1525EF分析兼半制備型。整體式HPLC系統(tǒng)，使用靈活方便；專利非圓齒輪技術(shù)，具有極佳的耐用性和輸液穩(wěn)定性；汲取Waters技術(shù)精華，具有高流速精度。 3.717plus自動進(jìn)樣器 全電子設(shè)計的自動進(jìn)樣器，高精度、高可靠性； 進(jìn)樣針內(nèi)、外清洗設(shè)計，最大程度降低交叉污染； 樣品室溫度控制選件，保證熱不穩(wěn)定樣品之完整性。 4.2475雙掃描熒光檢測器 全新設(shè)計，優(yōu)化信

9、號強(qiáng)度，降低散射光，減少池體擴(kuò)散，大大提高檢測靈敏度； 激發(fā)和發(fā)射波長均可掃描，允許自動增益優(yōu)化； 波長編程功能設(shè)計，允許不同保留時間的化合物使用不同波長檢測，優(yōu)化各個被測物的檢測靈敏度； 在線波長準(zhǔn)度確認(rèn)及增強(qiáng)安全性設(shè)計，符合嚴(yán)格的法規(guī)要求。 5. 6.XTerra色譜柱 XTerra色譜柱使用的雜化顆粒技術(shù)突破了化學(xué)的極限。廣泛適用于分析、制備領(lǐng)域。雜化顆粒技術(shù)利用有機(jī)/無機(jī)雜化顆粒來發(fā)揮硅膠和聚合物基質(zhì)填料的優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)填料的弱點，為研究者優(yōu)化分離速度、分離度、pH選擇性、色譜柱壽命及上樣量提供了強(qiáng)有力的工具。雜化顆粒填料具有分離效率高、峰形優(yōu)異、穩(wěn)定性好、PH范圍寬(1-12)及規(guī)

10、格齊全等特點。XTerra色譜柱提供了HPLC分離速度與分離度的最佳組合，為研究者提供最寬范圍的分離鍵合相、色譜柱規(guī)格以及顆粒度。XTerra填料目前提供2.5m，3.5m，5m和10m四種粒徑及MSC18，MSC8，RPC18，RPC8和苯基五種鍵合相。 四、實驗內(nèi)容及操作步驟 （一）儀器、試劑及色譜條件 1.儀器：WatersHPLC、熒光檢測器、25L微量進(jìn)樣器。 2.試劑：萘標(biāo)液（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；200mg/L）、甲醇（分析純）。 3.色譜條件 （1）C18色譜柱：長15cm、內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5m； （2）流動相（甲醇）：1mL/min； （3）熒光檢測器：280/334nm

11、。 （二）參數(shù)設(shè)置及操作步驟 1.準(zhǔn)備工作 （1）流動相：過濾（0.45m濾膜）、按比例混合、超聲510min除氣泡； （2）使用前（后）沖洗：進(jìn)樣口（load、inject）、泵、柱、檢測器； （3）標(biāo)樣、樣品：都需要過濾。 2.開機(jī)及測試樣品 （1）先打開色譜儀、檢測器；后打開電腦及軟件； （2）選project、usename； （3）managebreeze看system，連接情況； （4）viewmethod設(shè)參數(shù)：如波長、流速（1.0）、溶劑（甲醇：水）等；保存； （5）檢查：流動相放好、使用A泵或B泵； （6）灌注、沖洗：用流動相充分浸潤泵，排除氣泡； （7）平衡系統(tǒng)：equil

12、ibrate選擇方法、平衡20min左右； 作者： 化學(xué)小朋友 2005-4-8 13:24 回復(fù)此發(fā)言 3實驗十二液相色譜儀的使用 （8）進(jìn)樣：makesingleinjection、next、取樣、出現(xiàn)對話框后、在load注入、馬上移到inject、拔出進(jìn)樣器；2min后將inject撥回load；停止按stop。 3.數(shù)據(jù)處理 （1）設(shè)定processparameter：finddata在channel中選一個數(shù)據(jù)、點review、點guide、選start、選峰的范圍（用鼠標(biāo)拉）、next、next、在peak1命名、next、next、選external給processparamet

13、er起名（可以是儀器參數(shù)的方法名或重新起名）、finish、保存； （2）設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)：finddata中選所有要做標(biāo)準(zhǔn)曲線的點、右鍵altersample、把unknown改為standard、點edit中component、點edit中copy、選過程方法、填寫每個點的濃度、OK、保存； （3）做標(biāo)準(zhǔn)曲線：finddata中選所有要做標(biāo)準(zhǔn)曲線的點、右鍵process、選過程方法、選clear、OK、右鍵viewas中result、選所有要做標(biāo)準(zhǔn)曲線的點（看時間、是剛剛生成的）、右鍵review、點校正曲線、查看信息； （4）定量分析：finddata中選樣品點、右鍵process、選過

14、程方法、選useluo、OK、右鍵viewas中result、選數(shù)據(jù)點（看時間、是剛剛生成的）、右鍵review。 （三）注意事項 1.流動相過濾、配比、超聲除氣須嚴(yán)格按操作規(guī)程； 2.打開、關(guān)閉泵時，要控制流動相的流量以多次小幅度增減，以保護(hù)色譜柱； 3.做完實驗后，要用甲醇（水）交替沖洗整個流路（包括進(jìn)樣口） 五、實驗記錄及數(shù)據(jù)分析 表一：標(biāo)準(zhǔn)曲線： 濃度(mg/L) 峰面積 0.64 92159 1.6 230361 6.4 981788 表二：未知樣測定： 未知樣濃度(mg/L) 峰面積 第一次 3.467 525835 第二次 3.002 453696 第三次 3.691 56063

15、5 平均值 3.387 513389 六、實驗討論 （一）高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法及氣相色譜法的比較 高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點。 高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較： 高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。 高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加

16、料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cmmin-1。例如分離苯的羥基化合物，7個組分只需1min就可完成。對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長約170cm，柱徑0.9cm，流動相速度為30cm3h-1，需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分。 高效液相色譜法與氣相色譜法比較： （l）氣相色譜法分析對象只限于分析氣體和沸點較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20。對于占有機(jī)物總數(shù)近80的那些高沸點、熱穩(wěn)定性差

17、、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。 (2)氣相色譜采用流動相是惰性氣體，它對組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運載作用。而高效液相色譜法中流動相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭。因此，流動相對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。 (3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。 總之，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜優(yōu)點，并用現(xiàn)代化手段加以改進(jìn)，因此得到迅猛的發(fā)展。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。 高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的