1、第五章第五章 pcr技術(shù)原理技術(shù)原理 定義：定義： pcr技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction)，是通過模擬體內(nèi)，是通過模擬體內(nèi) dna 復(fù)制的復(fù)制的 方式，在體外選擇性地將方式，在體外選擇性地將 dna 某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò) 增出來的技術(shù)。增出來的技術(shù)。n pcr技術(shù)技術(shù):pcr概念的提出概念的提出1983，kary mullis引物引物引物引物mullis最初使用的dna聚合酶是大腸桿菌 dna 聚合酶 i 的klenow片段。不耐高溫。heat-stable polymerase is vital to the eas

2、e of the processthermus aquaticustaq dna多聚酶的發(fā)現(xiàn)多聚酶的發(fā)現(xiàn)1988年年saiki 等從溫泉等從溫泉（ hot spring）中分離）中分離的一株水生嗜熱桿菌的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱中提取到一種耐熱dna聚合酶。聚合酶。 此酶具有以下特點(diǎn)此酶具有以下特點(diǎn)： 耐高溫，耐高溫， 在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。新酶。 大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)度(2.0kb)。 酶命名

3、為酶命名為taq dna多聚酶多聚酶(taq dna polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被。此酶的發(fā)現(xiàn)使被pcr廣泛應(yīng)用。廣泛應(yīng)用。 在在 1989 年，年，science 將將pcr中的中的taq dna多聚酶命多聚酶命 名為當(dāng)年的風(fēng)云分子名為當(dāng)年的風(fēng)云分子 (molecule of the year) 722.pcr反應(yīng)過程：反應(yīng)過程：1個(gè)個(gè)pcr循環(huán)循環(huán) 模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈模板：?jiǎn)捂溁螂p鏈dna 引物：引物：16-30 bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸 dna聚合酶：耐熱的聚合酶：耐熱的dna聚合酶聚合酶 底物：四種脫氧三磷酸核苷底物：四種脫氧三磷酸核苷 （dntp: datp、dttp

4、、dctp、dgtp) 3.pcr基本要素基本要素4.pcr反應(yīng)程序反應(yīng)程序9496 30-3 預(yù)變性（使模板預(yù)變性（使模板dna充分變性）充分變性）94 30 變性變性50-60 30-1 復(fù)性（使引物與模板充分退火）復(fù)性（使引物與模板充分退火）72 n(按按1擴(kuò)增擴(kuò)增1kb計(jì)算）延伸計(jì)算）延伸 72 3-7 總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整）4-10 保存保存 25-35個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán)1）復(fù)性和延伸復(fù)性和延伸溫度溫度 復(fù)性的溫度是復(fù)性的溫度是 pcr 擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在 50-60 之間。具體的溫度主要由引物的之間。具體的溫度主要由

5、引物的 tm 值決定值決定（低于（低于tm 值值2-3 ）。）。 延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72 。如果復(fù)性的溫度很高，。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法法 pcr 。2）反應(yīng)）反應(yīng)時(shí)間時(shí)間 變性一般使用變性一般使用 30 秒鐘，如果模板的秒鐘，如果模板的 g+c 含量較高，或含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。 復(fù)性時(shí)間有復(fù)性時(shí)間有 30 秒種一般是足夠的。秒種一般是足夠的。 延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大

6、小決定，一般采用 1kb 用用 1 分分鐘來保證充足的時(shí)間。鐘來保證充足的時(shí)間。 3）循環(huán)）循環(huán)次數(shù)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為 2535 次。次。 平臺(tái)效應(yīng)（平臺(tái)效應(yīng)（plateau effect）：）：pcr 擴(kuò)增過程后期出現(xiàn)擴(kuò)增過程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。 原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dntp 和和 dna 聚合聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低酶的穩(wěn)定性或活性降低 ，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用

7、，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底。徹底。 4）pcr 反應(yīng)液的配制反應(yīng)液的配制 最后加入最后加入 dna 聚合酶。聚合酶。 早期的早期的 pcr 儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。熱啟動(dòng)（熱啟動(dòng)（hot start）pcr操作方式可較好解決非特異操作方式可較好解決非特異性擴(kuò)增的問題。性擴(kuò)增的問題。 mgcl2， 50mm k+ 引物設(shè)計(jì)的一般原則引

8、物設(shè)計(jì)的一般原則 長(zhǎng)度：至少長(zhǎng)度：至少 16bp ，通常為，通常為 18-30bp。 更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性。更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增的特異性，但會(huì)提高擴(kuò)增的有效性。 引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的引物的解鏈溫度：兩個(gè)引物之間的 tm 值差異最好在值差異最好在 2-5 。 對(duì)于小于對(duì)于小于 20 個(gè)堿基的引物其個(gè)堿基的引物其 tm 值可用簡(jiǎn)易公式計(jì)算，即值可用簡(jiǎn)易公式計(jì)算，即 tm=4（g+c）+2（a+t）。）。 對(duì)于對(duì)于 14-70 個(gè)核苷酸的引物可用個(gè)核苷酸的引物可用 以下公式計(jì)算。以下公式計(jì)算。 tm=81.5+16.6（1gk+）+0.41（g+c）%

9、-（675/n） n 表示引物的核苷酸數(shù)目，表示引物的核苷酸數(shù)目， k+ 表示單價(jià)離子即鉀離子的濃度表示單價(jià)離子即鉀離子的濃度 避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的 3端）。端）。 g+c 含量：盡量控制在含量：盡量控制在 40% 至至 60% 之間，之間， 4 種堿基的分布應(yīng)種堿基的分布應(yīng) 盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及 t 在在 3 末末 端的重復(fù)排列。端的重復(fù)排列。 引物的引物的 3 末端最好是末端最好是 g 或或 c ，但不要，但不要 gc 連排。連排。1. 長(zhǎng)

10、片段長(zhǎng)片段dna的的pcr擴(kuò)增擴(kuò)增常規(guī)常規(guī)pcr長(zhǎng)度為長(zhǎng)度為2kb以下。以下。長(zhǎng)片段長(zhǎng)片段pcr擴(kuò)增存在的問題：擴(kuò)增存在的問題：（1）隨著擴(kuò)增片段的延長(zhǎng)，擴(kuò)增效率降低）隨著擴(kuò)增片段的延長(zhǎng)，擴(kuò)增效率降低（2）高溫會(huì)損壞模板）高溫會(huì)損壞模板dna和和pcr產(chǎn)物產(chǎn)物（3）高溫下其他二價(jià)離子的存在會(huì)促進(jìn)）高溫下其他二價(jià)離子的存在會(huì)促進(jìn)dna的裂解的裂解（4）長(zhǎng)片段）長(zhǎng)片段dna分子的變性比短片段困難，分子的變性比短片段困難，dna聚合聚合酶與模板酶與模板dna的趨近和接合變得困難的趨近和接合變得困難（5）錯(cuò)配堿基的摻入導(dǎo)致）錯(cuò)配堿基的摻入導(dǎo)致dna聚合酶的作用不能正常聚合酶的作用不能正常發(fā)揮，從而限制

11、產(chǎn)物的長(zhǎng)度發(fā)揮，從而限制產(chǎn)物的長(zhǎng)度二、二、pcr的類型的類型改進(jìn)：改進(jìn)： (1)改進(jìn)緩沖體系改進(jìn)緩沖體系 (2) 采用混合采用混合dna聚合酶聚合酶 主體使用擴(kuò)增效率高，延伸能力強(qiáng)的主體使用擴(kuò)增效率高，延伸能力強(qiáng)的2. pcr擴(kuò)增未知擴(kuò)增未知dna片段片段1).染色體步查（移）（染色體步查（移）（chromosome walking ）：）： 是指從生物基因組或基因組文庫(kù)中的是指從生物基因組或基因組文庫(kù)中的已知序列出已知序列出發(fā)發(fā)，逐步獲得，逐步獲得與其相鄰的未知序列的核苷酸組成與其相鄰的未知序列的核苷酸組成的方的方法和過程。法和過程。2) . 反向反向pcr(inverse pcr) 一種簡(jiǎn)

12、單的擴(kuò)增已知序列周邊序列的方法。一種簡(jiǎn)單的擴(kuò)增已知序列周邊序列的方法。擴(kuò)增原理：擴(kuò)增原理：步驟：步驟：首先首先用已知片段內(nèi)部沒有的限制性內(nèi)切酶切割模板用已知片段內(nèi)部沒有的限制性內(nèi)切酶切割模板 dna ，再再將酶切后的將酶切后的 dna 片段連接成環(huán)狀分子，片段連接成環(huán)狀分子，最后最后根據(jù)已知片段兩端的序列設(shè)計(jì)引物，根據(jù)已知片段兩端的序列設(shè)計(jì)引物， pcr擴(kuò)增鄰近的擴(kuò)增鄰近的dna 片段。片段。3) .利利用接頭用接頭的的pcr步驟：步驟： ( (1) )基因組基因組dnadna的限制性內(nèi)切酶酶切，的限制性內(nèi)切酶酶切，（2 2）接頭與限制性內(nèi)切酶片段的連接，）接頭與限制性內(nèi)切酶片段的連接，（3

13、3）已知序列側(cè)翼未知序列的）已知序列側(cè)翼未知序列的pcrpcr擴(kuò)增（利用分別擴(kuò)增（利用分別根據(jù)已知序列和接頭序列設(shè)計(jì)的引物）。根據(jù)已知序列和接頭序列設(shè)計(jì)的引物）。 4).（1）熱不對(duì)稱交錯(cuò)）熱不對(duì)稱交錯(cuò)pcrtail-pcr的基本原理：的基本原理： 利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物（個(gè)嵌套的特異性引物（簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱sp1，sp2，sp3），用它們分別和），用它們分別和1個(gè)具有低個(gè)具有低tm值的短值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（arbitrary degenerate prime，ad，約，約14bp）相組合，根據(jù)）相組合，根據(jù)引物的長(zhǎng)短引物的長(zhǎng)短和

14、和特異性的差異特異性的差異設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)不對(duì)稱不對(duì)稱的溫度循環(huán)的溫度循環(huán)，通過分級(jí)反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物。，通過分級(jí)反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物。第一次反應(yīng)包括第一次反應(yīng)包括5次高特異性、次高特異性、1次低特異、次低特異、10次較低特異性反應(yīng)次較低特異性反應(yīng)和和12個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。5次高特異性反應(yīng)，使次高特異性反應(yīng)，使sp1與已知與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1次低特異性的反次低特異性的反應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使次較低特異性反應(yīng)使2種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行種

15、引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12次超級(jí)循環(huán)。次超級(jí)循環(huán)。 第二次反應(yīng)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋第二次反應(yīng)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過倍作為模板，通過10次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異產(chǎn)次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。物含量極低。第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的pcr反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)，反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)， 通過上述通過上述3次次pcr反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。sp1，sp2，sp3隨機(jī)引

16、物隨機(jī)引物 （2）不對(duì)稱）不對(duì)稱pcr 3.3.與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的pcr擴(kuò)增擴(kuò)增 rt-pcr（reverse transcriptase-pcr,rt-pcr): 又稱反轉(zhuǎn)錄又稱反轉(zhuǎn)錄pcr, 是以反轉(zhuǎn)錄的是以反轉(zhuǎn)錄的cdna作模板所進(jìn)行的作模板所進(jìn)行的pcr， 可對(duì)基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析?？蓪?duì)基因的表達(dá)和序列多態(tài)性分析。聚合酶聚合酶cdnapcr擴(kuò)增aaanaaaana逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 t t tntcdna第一鏈第一鏈mrna1）cdna末端的快速擴(kuò)增（末端的快速擴(kuò)增（rapid amplification of cdna end,race) (a) 5race

17、：gsp3設(shè)計(jì)引物，合成cdna第一鏈aaaaa.aaaanpoly(a)尾ttttt .tttt5apaaaaa.aaaanttttt .tttt5用rnase降解模板mrna,純化cdna第一鏈ttttt .tttt5- - -ttttt .ttttgsp1auapgsp2(b) 3race特異性引物與接頭引物對(duì)cdna的pcr擴(kuò)增2)差異顯示差異顯示pcr:(differential display reverse transcriptase-pcr,ddrt-pcr)使用使用3端的錨定引物（端的錨定引物（t12mn），通過反轉(zhuǎn)錄過程，可以將），通過反轉(zhuǎn)錄過程，可以將整個(gè)整個(gè)mrna群體

18、在群體在cdna水平水平上，分成大致相等但序列結(jié)構(gòu)上，分成大致相等但序列結(jié)構(gòu)不同的不同的12亞份群體，這一過程亞份群體，這一過程叫差異顯示反轉(zhuǎn)錄叫差異顯示反轉(zhuǎn)錄(ddrt).錨定引物的通式是錨定引物的通式是oligo(dt)12mn，m：a、c、g；n：a、c、g、t共有共有12種種oligo(dt)12mn引物。引物。4.pcr產(chǎn)生產(chǎn)生dna指紋指紋1）多重）多重pcr(multiplex pcr)： 設(shè)計(jì)多對(duì)引物，在同一個(gè)設(shè)計(jì)多對(duì)引物，在同一個(gè)pcr反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增一份增一份dna樣本中幾個(gè)不同靶區(qū)域的樣本中幾個(gè)不同靶區(qū)域的dna片斷，這片斷，這一過程稱之為多重一過程

19、稱之為多重pcr. 使用使用隨機(jī)選擇隨機(jī)選擇的核苷酸作為的核苷酸作為pcr反應(yīng)體系中的引物，在反應(yīng)體系中的引物，在較低較低的復(fù)性溫度的復(fù)性溫度下下(36)進(jìn)行進(jìn)行pcr。由于非特異性引物與模板上的。由于非特異性引物與模板上的多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合而不是與某一限制性位點(diǎn)特異性結(jié)合，因此經(jīng)過多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合而不是與某一限制性位點(diǎn)特異性結(jié)合，因此經(jīng)過pcr擴(kuò)增反應(yīng)后可以產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)后可以產(chǎn)生多個(gè)pcr產(chǎn)物。經(jīng)凝膠電泳可以將上產(chǎn)物。經(jīng)凝膠電泳可以將上述多個(gè)述多個(gè)pcr反應(yīng)產(chǎn)物分離，這樣多態(tài)性的產(chǎn)物通常稱為隨機(jī)擴(kuò)反應(yīng)產(chǎn)物分離，這樣多態(tài)性的產(chǎn)物通常稱為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性增多態(tài)性dna(random ampificati

20、on polymorphic dna,rapd)2）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（random ampification polymorphic dna,rapd ）是針對(duì)基因組是針對(duì)基因組dna的限制性酶切片斷進(jìn)行選擇性的限制性酶切片斷進(jìn)行選擇性pcr擴(kuò)增而建立擴(kuò)增而建立dna指紋的技術(shù)。指紋的技術(shù)。1）基因組）基因組dna的限制性內(nèi)切酶酶切，的限制性內(nèi)切酶酶切，2）（與酶切片段末端相對(duì)應(yīng)的）接頭與酶切）（與酶切片段末端相對(duì)應(yīng)的）接頭與酶切dna片段的連接，片段的連接，3）（含有接頭序列和酶切位點(diǎn)序列及延伸序列的）引物對(duì)連接）（含有接頭序列和酶切位點(diǎn)序列及延伸序列的）引物對(duì)連接產(chǎn)物作產(chǎn)物

21、作pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增。3）擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（aflp,amplified fragment length polymorphism）gaattccaattgttaaaattgaattctaatgcaatttaatgaattcmnvmnvaatt核心 酶切 延伸序列 位點(diǎn) 序列7.實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量pcr( real-time pcr)常規(guī)常規(guī)pcr技術(shù)：技術(shù)：對(duì)對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析進(jìn)行定量及定性分析定量定量pcr技術(shù)：技術(shù)：對(duì)對(duì)pcr擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析進(jìn)行定量及定性分析（1）原理：）原理： 通過特定設(shè)計(jì)的通過特定設(shè)計(jì)的pcr儀器來儀器來實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)檢測(cè)pcr擴(kuò)擴(kuò)增過程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量增過程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積數(shù)量，可以很好，可以很好的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱為實(shí)時(shí)的推算模板的起始濃度，這種工作方式稱為實(shí)時(shí)定量定量pcr。域值域值：將熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所：將