1、http: / www. ahs. ac. cn E-mail: yuanyixuebao園藝學(xué)報 2014, 41 (7) : 1418 T426Acta Horticulturae Sinica狗薔薇細胞分裂素氧化酶基因RcCKX5 的克隆及表達分析王 玲，高 彬，溫 超，郗 琳，劉鳳欒，馬男，趙梁軍*（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)觀賞園藝與園林系，北京100193）摘 要：利用RACE技術(shù)從狗薔薇(Rosa canina)類根體中克隆得到1個細胞分裂素氧化酶基因cDNA 全長，命名為 RcCKX50 序列分析表明，RcCKX5 cDNA全長 1 815 bp, 5' UTR 104 bp ORF

2、 1 626 bp, 3' UTR 85 bp,編碼541個氨基酸，具有CKX家族典型的FAD (黃素腺喋吟二核甘酸)結(jié)合域和 CK (細胞分裂 素)結(jié)合域。氨基酸序列多重比對和系統(tǒng)進化樹分析顯示RcCKX5與可可TcCKX5親緣關(guān)系最近，與擬南芥AtCKX5、烏拉爾圖小麥TuCKX5同源性較高。熒光定量PCR分析表明，狗薔薇 RcCKX5在其根、 莖、葉、花、果實中均有表達，根中相對表達量最高，花和果實中相對表達量較高。在狗薔薇類根體形成發(fā)育過程中RcCKX5的相對表達量不斷升高，21 d時達到最高，隨后稍有下降，表明其可能參與了類 根體的形成。6-BA處理結(jié)果表明RcCKX5能夠快

3、速響應(yīng)6-BA的誘導(dǎo)，表達量顯著上調(diào)，2.5 mg L-1 6-BA 處理120 h時，RcCKX5的相對表達量達到最高峰。關(guān)鍵詞：狗薔薇；類根體；細胞分裂素氧化酶；表達分析中圖分類號：S 685.12 文獻標志碼：A文章編號：0513-353X( 2014) 07-1418-09Isolation and Expression Analysis of Cytokinin Dehydrogenase Gene RcCKX5 in Rosa caninaWANG Ling ， GAO Bin， WEN Chao， XI Lin ， LIU Feng-luan， MA Nan， and ZHAO

4、Liang-jun* ( Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture， China Agricultural University ， Beijing 100193， China)Abstract： Protocorm-like bodies( PLBs) is a new protocol of efficient regeneration， and the development of rhizoids is a critical stage of PLB regeneration. Recent res

5、earches showed that cytokinin regulated the formation of rhizoids. Here， we isolated the full length cDNA of a gene encoding cytokinin dehydrogenase from rhizoids of Rosa canina， named RcCKX5. Sequence analysis indicated thatRcCKX5 consisted of 1 815 bp with ORF of 1 626 bp, 5' UTR of 104 bbp3&#

6、39; UTR of 85 bpencoded 541 amino acids. The deduced amino acids possessed conserved domains of CKX fam，ilyFAD-binding domain and cytokinin-bining domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis showed that RcCKX5 had the highest similarity with TcCKX5 from Theobroma cacao. Real-time

7、PCR analysis indicated that expression level of RcCKX5 in root was the highes，t and expression level in flower and fruit was high.收稿日期：2014 £3 T2;修回日期：2014 £5-06基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31171993 )* 通信作者Author for correspondence ( E-mail ： Zhaolj5073 )7期王 玲等：狗薔薇細胞分裂素氧化酶基因RcCKX5 的克隆及表達分析1429Expressio

8、n level of RcCKX5 keep increasing all along the formation of rhizoids， reached the highest peak in the twenty-first day， then decreased slightly. This indicated RcCKX5 might be involved in rhizoids formation. RcCKX5 was significantly and rapidly induced by 6-BA， expression level of RcCKX5 reached hi

9、ghest with the concentration of 2.5 mg L-1 and tim e of 120 h.Key words： Rosa canina； rhizoid； cytokinin dehydrogenase； expression analysis類原球莖(protocorm-like body, PLB)再生途徑是一種高效的、具有一定普遍性的再生體系，可作為良好的遺傳轉(zhuǎn)化體系用于月季等薔薇屬植物的育種開發(fā)和研究工作(Tian et al.， 2008； Guo &Zhao， 2011)。植物的再生，如器官發(fā)生和體胚發(fā)生，都受激素水平的影響，多種激素之間平

10、衡互作共同調(diào)節(jié)植物的離體再生。已有研究表明生長素和細胞分裂素對PLB再生起著重要的作用(張建甫 等，2011; Gao et al., 2013)。狗薔薇(Rosa canina)的PLB是由葉片經(jīng)愈傷組織形成類根體， 類根體根尖再膨大萌發(fā)而形成的。因此，類根體階段是PLB再生體系的關(guān)鍵階段，是影響再生效率的重要因素，對類根體的研究有助于對 PLB的深入研究和利用。有研究發(fā)現(xiàn)，在類根體誘導(dǎo)過程中 添加激動素(Kinetin, KT)會降低類根體的發(fā)生率，細胞分裂素能夠負調(diào)控類根體的形成( Gao et al., 2013)。但關(guān)于細胞分裂素如何調(diào)控類根體形成，還有待進一步研究。細胞分裂素氧化酶

11、(Cytokinin dehydrogenase CKX)是目前已知的唯一能夠催化天然細胞分裂 素發(fā)生不可逆降解的酶，是降解內(nèi)源細胞分裂素(Cytokinin , CK)的關(guān)鍵酶。該酶以分子氧為氧化 劑，催化CK的N6上不飽和側(cè)鏈裂解使其徹底喪失活性(Hare & van Staden, 1994)。CKX是下調(diào) 內(nèi)源細胞分裂素水平的關(guān)鍵酶，很多研究發(fā)現(xiàn)過表達CKX 的轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)源細胞分裂素水平與對照相比明顯下降(Galuszka et al，. 2001； Kope?ny et al.， 2006； Werner et al.， 2006)。目前，關(guān)于細胞分裂素氧化酶的研究多集中于

12、擬南芥和禾本科植物中，如玉米、水稻等。擬南芥中已得到7個CKX基因(Werner et al., 2003)、玉米中已發(fā)現(xiàn)13個CKX基因(Gu et al., 2010)。 不同的CKX蛋白之間都具有高度保守的FAD結(jié)合域和CK結(jié)合域，在功能方面具有一定的相似性。CKX基因廣泛存在于植物體內(nèi)各個部位，但不同成員的表達特性存在一定差異。擬南芥CKX基因均在根和芽中大量表達。CKX參與調(diào)節(jié)植物多種生長發(fā)育過程。CKX能夠調(diào)節(jié)擬南芥根和芽的生 長發(fā)育(Ferreira & Kieber， 2005； Riefler et al.， 2006)。細胞分裂素可正調(diào)控莖分生組織而對根有抑制作用(

13、Hewelt et al., 1994; Kuderova et al., 2008) , CK缺乏會抑制莖分生組織且促進根的生長發(fā)育。過表達擬南芥CKX 基因的煙草和擬南芥表現(xiàn)出植株矮化、莖的生長受抑制，主根增長、側(cè)根增多、根系擴大等表型(Laplaze et al., 2007)。另外，CKX能調(diào)控生殖器官發(fā)育(Igarashi et al., 2009)、種子形成和作物產(chǎn)量(Ashikari et al., 2005; Bartrina et al., 2011)等。CKX還與植物衰老(Mytinova et al., 2010)及逆境反應(yīng)(Mytinova et al., 2010;

14、Mackova et al., 2013)有關(guān)。本試驗中利用RACE技術(shù)分離得到狗薔薇細胞分裂素氧化酶基因RcCKX5的cDNA全長，分析其在不同組織和類根體發(fā)育過程中的表達特性，以及響應(yīng)6-BA處理的表達情況，揭示該基因的功能和特性，探索細胞分裂素如何參與調(diào)控類根體形成，為研究激素對PLB發(fā)生發(fā)育的影響及進一步優(yōu)化這一再生體系提供理論參考。1 材料與方法1.1 材料試材為狗薔薇(Rosa canina) ，來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園。取一年生莖段消毒滅菌，以其單芽莖段為外殖體接種于 MS培養(yǎng)基上（含 6-BA 1.0 mg L-1 , NAA 0.004 mg L-1 , GA3 0.1 mg

15、 L-1 ）, 通過腋芽誘導(dǎo)獲得組培苗并繼代擴繁，置于人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)。溫度 25 C, 16 h光照/8 h黑暗， 光照強度100 120 wmol -2 m-1。類根體誘導(dǎo)參照Tian等（2008）的方法。將狗薔薇組培苗葉片接種于添加2.5 mg L-1 6-BA的類根體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（即MS + 1.5 mg L-1 2,4-D）上，置于人工培養(yǎng)室分別暗培養(yǎng)處理 0、4、8、16、24、72和120 h;另外將組培苗葉片分 別接種于添加6-BA 0、0.025、0.1、0.25、1.0、2.5和5.0 mg L-1的類根體誘導(dǎo)培養(yǎng)基（即 MS + 1.5 mg L-1 2,4-D）上，置于人

16、工培養(yǎng)室暗培養(yǎng)處理24 h。收集材料，液氮冷凍，置于-80 C保存待用。1.2 狗薔薇 RcCKX5 的克隆采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司，下同）從狗薔薇類根體中提 取總RNA,用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄使用Superscript! reverse transcriptase （Invitrogen）進行，合成 cDNA 第 1 鏈。根據(jù)GenBankh發(fā)表的南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米Zea may§、烏拉爾圖小麥Triticum urartu）、可可（Theobroma cacao）的CKX5保守氨基

17、酸序列和核甘酸序列，通過 Primer Premier 5 軟件設(shè)計簡并引物RcCKX5-F1和RcCKX5-R1 （表1）,以cDNA為模板進行PCRT增。PC阪應(yīng) 條件為：94 C 5 min; 94 30 sC, 60 C 30 s, 72 C 1 min, 35個循環(huán)；72 C 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段并連接到載體pMD18-T （大連寶生物工程有限公司），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5% （北京全式金生物技術(shù)有限公司），進行 Ampicillin抗性篩選及陽性克隆鑒定，RcCKX5 中間片段。表 1 引物名稱及對應(yīng)序列Table 1 Primer n

18、ames and corresponding sequences引物名稱相應(yīng)序列Primer name Corresponding sequenceRcCKX5-F1 CGGCCTGGGCCAGTTYGGNATHATRcCKX5-R1 AGCCAGGGGTGGGGNAVNTCCCARcCKX5-F2 AACAACTGGAGGTCATCTTTCTRcCKX5-R2 GGATCAATGGAGGAGATATTGACAGGGT full-RcCKX5-FCTGCCTCAAGATTTTGCTTCATTCCfull-RcCKX5-RTACATCCCTCCCTAAGTTTGTTGCTq-RcCKX5-F A

19、CGAGGGAGTGTTCAAGGGCAq-RcCKX5-R GTTTCGTCCCCGGAATCCAAAG18Sr-F CGCTACACTGATGTATTCAACGAGC18Sr-R ACAATAATCCTTCCGCAGGTTCACC進行DNA測序，（北京中科希林生物科技有限公司, 采用RACE試劑盒（大連寶生物工程有限公司）擴增RcCKX5的3,與5'序列。根據(jù)所得到 的中間片段序列設(shè)計3'特異性引物RcCKX5-F2 （表1）,擴增得到3'端序列；再設(shè)計5'特異性引物RcCKX5-R2 （表1）,擴增得到5'端序列。 DNAMAN 6.0 軟件拼接所

20、獲得序列，分別在5'端和3'端非翻譯區(qū)設(shè)計特異性引物 full-RcCKX5-F 和 full-RcCKX5-R （表 1），進 行校正，反應(yīng)條件為：94 5 min； 94 30 s，60 30 s， 72 2 min， 35個循環(huán)；72 10min。擴增得到含開放閱讀框的cDNA全長， 測序。1.3 序列生物信息學(xué)分析禾I用NCBI的ORF Finder,對 RcCKX5的cDNA序列開放閱讀框進行查找；利用 NCBI網(wǎng)站的 BLAST程序搜索相似性序列；利用蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測軟件（ http： //protparam/預(yù) 測該蛋白質(zhì)的分子量和等

21、電點；使用ClustalX 1.81軟件進行多重序列比對；采用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，用自展法（Bootstrap）進行1 00歐重復(fù)測試，數(shù)字表示不同節(jié)間的進化距離。1.4 基因表達特性分析根據(jù)所得cDNA序列設(shè)計一對基因特異性引物q-RcCKX5-F和q-RcCKX5-R （表1）,以18SrRNA作為內(nèi)參基因，其特異性引物為18Sr-F和18Sr-R （表1）。將相應(yīng)材料提取RNA并消化，采用FastQuantRT Kit (With gDNase)(天根生化科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈，進行熒光定量PCR分 析。熒光定量 PCR采用 KAPA SYBR FAST U

22、niversal 2 x qPCR Master Mix (KAPA ),按其說明書配 制反應(yīng)體系，每個處理重復(fù)3次，在ABI StepOne Plus儀器上進行擴增分析。2 結(jié)果與分析2.1 狗薔薇 RcCKX5 基因全長的獲得禾I用RACE的方法，從狗薔薇中分離得到 RcCKX5cDNA全長(圖1)。該基因cDNA全長1 815 bp, 5' UTR 104 bpORF 1 626 bp, 3' UTR 85 bp編碼541 個氨基酸，GenBank錄號為 KF964496, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明，RcCKX5編碼的氨基酸序列具有CKX家族的兩個特征結(jié)構(gòu)域：FAD (黃素

23、腺喋吟二核甘酸)結(jié)合域和CK結(jié)合域。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測其分子量為 60.0 kD,等電點為5.41。圖 1 RcCKX5 基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence of RcCKX5 cDNA and deduced amino acid sequence2.2 RcCKX5 編碼的氨基酸序列的生物信息學(xué)分析將RcCKX5編碼的氨基酸序列與GenBank±其他植物的CKX5同源蛋白序列一一擬南芥AtCKX5 (NP_177678.2)、玉米 ZmCKX5 (NP_001185958.1)、烏拉爾圖小麥 TuCKX5 (EMS58043.

24、1)、 可可TcCKX5 (EOY14870.1)進行多重序列比對，結(jié)果(圖2)顯示RcCKX5與其他CKX5氨基酸序列具有較高的同源性，有多個保守區(qū)域。RcCKX5與可可TcCKX5的同源性高達80.2%,與擬南芥AtCKX5、烏拉爾圖小麥TuCKX5和玉米ZmCKX5的同源性也分別達到了 73.4%、63.8%和49.7%。Rd7KX 5 TaCKX5 A(C KX5 TwCkXS ZmCKX5 Consensu1；RE 區(qū) X5 TeCKXS AtCKX5 TuKX5 ZmC'KX? (notisciih usT9 : T.三同五平EL；L1 tBHe E.； N EE, , ：

25、-R中工T雷；f7172 才 甘6，白白 1 I.SWI £<JQAF!b"<?GTT $2HF|VGGT LSN1GISG OAFr16416016116175FkKX5 ,IeCKN5 A1CK.X5 TuCKK5 ZmCKXS ('on5jCiBii 日AICKX5 IuCKX5 ZinCKXS Inymigg I p 3wtd)I 1 vgt I snai Df ligj>qi*av c dvvtq £r . J ,239517 311 M同 U ，42左。叫8 3a6 4( K) 428圖2 RcCKX5氨基酸序列同其他物種CK

26、X5氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of RcCKX5 with CKX5 from other species47046415X4745<G為了分析RcCKX5與其他CKX同源蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系，將其與其他13種植物CKX同源蛋 白進行多重序列比對，并用 MEGA 4.0構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖3）顯示RcCKX5與可可TcCKX5 的親緣關(guān)系最近，其次與擬南芥 AtCKX5、烏拉爾圖小麥TuCKX5親緣關(guān)系較近，而與單子葉的玉 米ZmCKX5和石斛蘭DsCKX1的進化關(guān)系相對較遠。圖3 RcCKX

27、5推測蛋白同其他物種 CKX同源蛋白的系統(tǒng)進化樹分析圖中數(shù)字代表進化距離Fig. 3 The phylogenetic tree of RcCKX5 and CKX proteins from other speciesNumber in the figure represent evolutionary distance.2.3狗薔薇RcCKX5組織表達特性分析花、花、如圖4所示，狗薔薇 RcCKX5在根、莖、葉、 果實中均有表達，在根中的表達量最高，在 果實中表達量次之，在葉和莖中表達量最低，其中在根中的表達量是在莖中的8.7倍。2.4狗薔薇RcCKX5在類根體誘導(dǎo)過程中的 表達情況從圖5

28、和圖6中可以看出，接種葉片后類 根體的誘導(dǎo)過程開始之后，RcCKX5的表達量 逐漸增高，21 d時表達量最高，為0 d的20.2 倍，隨后有所下降，28 d時表達量為0 d的16.7 倍。分析類根體誘導(dǎo)過程中RcCKX5的表達情況可以發(fā)現(xiàn)，14 21龍間葉片形成的愈傷 組織開始分化形成類根體，RcCKX5的表達量 迅速增高達到最高峰，類根體成熟后表達量下 降，這說明RcCKX5的表達與類根體的發(fā)生呈 現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，RcCKX5可能參與了類根體的 發(fā)生。圖4 RcCKX5基因在狗薔薇不同組織中的表達Fig. 4 Exression pattern of RcCKX5 in different t

29、issuesof Rosa canina圖5 類根體誘導(dǎo)過程中不同時期RcCKX5基因的表達Fig. 5 Expression analysis of RcCKX5 during theformation of rhizoids圖6 類根體誘導(dǎo)過程中不同時期的生長狀態(tài)Fig. 6 Growth state in different time during the formation of rhizoid2.5細胞分裂素6-BA處理對狗薔薇 RcCKX5表達的影響通過不同濃度細胞分裂素6-BA處理類根體誘導(dǎo)過程中的葉片，結(jié)果如圖 7所示，隨著6-BA處 理濃度的升高，RcCKX5的表達呈逐步上升

30、的趨勢。其中濃度為 2.5 mg L-1時表達量達到最高，在 處理濃度為0.25 2.5 mg L-1時，表達量均明顯高于對照，說明6-BA能夠誘導(dǎo)狗薔薇RcCKX5的表達。如圖8所示，細胞分裂素6-BA處理類根體誘導(dǎo)過程中的葉片不同時間，RcCKX5的相對表達量存在較大差異。處理后4 h RcCKX睫達量迅速增高，達到對照的9.1倍，隨后逐漸降低，24 h表達量最低，之后又不斷升高，72 h和120 h時的表達量分別達到對照的10.6倍和15.3吾。這些結(jié)果表 明細胞分裂素6-BA能夠快速而顯著地上調(diào)RcCKX5的表達。圖7 不同?農(nóng)度6-BA處理(24 h)對 RcCKX5表達的影響Fig

31、. 7 Effect of 6-BA treated with different concentration ( 24 h ) on expression of RcCKX5圖8 6-BA (2.5 mg L-1 )處理時間對RcCKX5表達的影響Fig. 8 Effect of 6-BA (2.5 mg L-1 ) treated fordifferent time on expression of RcCKX53 討論狗薔薇PLB再生體系具有一定普適性和高效性，可以作為一種良好的遺傳轉(zhuǎn)化體系用于月季的 研究和育種開發(fā)工作。類根體是狗薔薇 PLB再生的關(guān)鍵階段，對類根體形成機制的研究有利于

32、 PLB 再生體系的深入研究和利用。已有研究證明，生長素和細胞分裂素對于類根體的形成起著重要的作 用，但細胞分裂素調(diào)控類根體形成的機制還不太清楚。本試驗中從狗薔薇中克隆得到1個細胞分裂素氧化酶基因RcCKX5 cDNA的全長。氨基酸序列多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示與 TcCKX5親緣關(guān)系最近，與AtCKX5、TuCKX5等均具有較高的 同源性，且具有保守的FAD結(jié)合域和CK結(jié)合域。這些結(jié)果表明，RcCKX5為CKX家族同源基因，可能與其他CKX 具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。組織表達分析表明，狗薔薇 RcCKX5在根、莖、葉、花、果實中均有表達，相對表達量依次為根 > 花 > 果實 >

33、; 葉 > 莖。這與其他植物CKX 的研究結(jié)果相似。擬南芥AtCKX5 在根分生組織、雄蕊和花藥、腋生分生組織以及葉中的表達量都較高(Werner et al., 2006)。CKX廣泛存在植物體內(nèi)各個部位，玉米CKX 主要在谷粒、根、老葉、成熟和未成熟的雄穗、未成熟的雌穗中大量表達(Bilyeuet al., 2003; Massonneau et al. 2004)。大多數(shù) CKX基因都在根中大量表達( Werner et al, 2006;Liu et al., 2013)。RcCKX5在根中的大量表達說明其對根器官的生長發(fā)育起著重要的作用。相關(guān)研究表明 CKX 能夠促進根的發(fā)育，

34、過表達CKX 的轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出主根變長，側(cè)根不定根增長，根分生組織增大的表型(Schmnlling et al., 2003; Lohar et al., 2004; Laplaze et al., 2007)。類根體誘導(dǎo)發(fā)生過程中，RcCKX5的表達量逐漸升高，在21 d時達到最高，是0 d的20.2倍，此時是類根體發(fā)生的旺盛時期，28 d時即類根體成熟后表達量稍有下降。RcCKX5表達量的變化與類根體發(fā)生過程相一致。CKX能夠負調(diào)控內(nèi)源CK的水平(Kowalskaa et al., 2010; Dung et al., 2012), 因此分析認為RcCKX5的表達量的變化可能造成內(nèi)源C

35、K水平的變化，改變了激素平衡從而調(diào)節(jié)類 根體的形成。另外，有研究證明細胞分裂素在根中能夠抑制根原基，并能調(diào)節(jié)根部細胞脫離根分生組織促進維管組織的分化，過表達 CKX能夠逆轉(zhuǎn)這種作用(Werner et al, 2006; Dello et al., 2007)。RcCKX5 在類根體發(fā)育過程中的表達特性以及在狗薔薇根中的大量表達均說明該基因的表達與類根 體的發(fā)生呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，具體是否參與了類根體發(fā)生還不能明確判斷。目前，關(guān)于CKX 表達的可誘導(dǎo)性的報道有很多，大量的研究顯示細胞分裂素能夠迅速地上調(diào)CKX的表達。Brugi re等(2003)研究發(fā)現(xiàn)6-BA處理玉米葉片24 h, ZmCKX

36、I的表達顯著上調(diào)， 響應(yīng)過程很迅速。小麥已發(fā)芽的胚經(jīng)10 wmol -1 L6-BA處理12 h,TaCKX3即受到強烈誘導(dǎo)(Maet al., 2011)。本研究中對類根體誘導(dǎo)過程中的狗薔薇葉片施加不同濃度的6-BA處理，RcCKX5的表達量隨6-BA濃度的升高不斷上升，2.5 mg L-1時表達量最高，隨后稍有下降，在一定濃度范圍(0.25 2.5 mg L-1)內(nèi)表達量明顯上調(diào)，表明細胞分裂素能夠誘導(dǎo) RcCKX5的表達。進一步分析 RcCKX5響應(yīng)6-BA表達調(diào)控的特性，發(fā)現(xiàn)葉片經(jīng)6-BA處理4 h時后，RcCKX5表達量迅速升高，120 h時表達量最高，達到對照的15.3倍，這說Rc

37、CKX5能夠迅速的響應(yīng)細胞分裂素的表達調(diào)控。這與其他相關(guān)研究結(jié)果相一致。4 24 h表達量短時間內(nèi)的下降可能與培養(yǎng)過程中存在2,4-D有關(guān)，2,4-D可能動態(tài)地參與調(diào)節(jié)了RcCKX5表達。王瑛(2009)用2,4-D處理霍山石斛試管苗15 d, DhCKX的酶活性僅達到對照的58.1%。綜上所述，RcCKX5 可能一定程度參與了類根體的形成過程，今后可通過測定類根體形成不同時期的細胞分裂素含量進一步明確細胞分裂素與類根體形成的關(guān)系，為研究激素調(diào)控PLB再生的機理提供一定的依據(jù)。ReferencesAshikari M ， Sakakibara H ， Lin S ， Yamamoto T ，

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