1、固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測甘蔗中3-硝基丙酸的方法研究中國食品N生雜志CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 1282012年第24卷笫2期實除技術與方?jīng)Q固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測甘蔗中3-硝基丙酸的方法研究李兵，吳國華，劉偉，趙旭東，趙海慈，薛穎，趙松(北京市疾病預防控制中心，北京100013)搐 要：目的 盛立甘菽中3 端基兩陵的陽相舉取是擊政農(nóng)相包譜卡取質語校則方法,方法 樣品經(jīng)乙晴萃 取，5中p.k氨基即相草取柱凈化越而效液和包語小聯(lián)質語法測文甘源中3統(tǒng)基內發(fā)含量。邑譜社為Waters ACQU1TY BEH CltU(1.7出嘰50 mm

2、x2. 1 mm),柱溫40 P ,樣品溫度10 t ,遺并依枳51d.流動相A為水，流動 柏B為乙醇，悌度洗to結果 方法的修姓范國為4.0-40.0 ag/kg,星質加標工作由或線M相關系做為0.998。 方法的定性修出H為L0叢 ,定量檢出展為4.0 nV X.高、中,低3個濃度水平的為行舊妝率為92.5% 93. 6%，相廿標準值樂小于10% G結論 本方法靈敕、快見、*吭，可用于甘藤中3N基內酸妁測定。關健詞：甘原3剛基西酷；因鋤耳?。怀咝б合嚯娮V串我般譜中圖分類號：TS242. 1 文獻標識碼：A 文章編號：1004.8456(2012)02012706Detection of

3、3-nitropropionic acid in sugarcane by solid-phase extraction coupled withultra high performance liquid chromatosrapby-tandem mass spectrometryLi Hing. Wu Guohuat Liu Wei, Zhao Xudong, Zhao liaiyanv Xue Ying, Zhao Rong(Beijing Centers for Diseases Control and Prevention, Beijing 100013. China)Abstrac

4、t ： Objective To establish a method for the deiection of 3-niuoprupionic acid in sug&rrane by solid-phase extraction (SPE) coupled with uhn high performance liquid chromatography-tanderr maAN spectrometry ( LPLC-MS?MS). Methods Sampler were extracted by acetonitrile and cleaned up by 梟ppak H. &#

5、187;oK<i phaM<* extraction column. The 3- nitropropionic acid waa determined by UPLC-MS/MS. The chrumalornphic condilicnei ； usin§ U atrra ACQl?!TY BEH CIB column (1.7 |im, 50 mtn x 2. 1 mm ) with water as mobile phase A and acetonijftle 2 mobile phase B for gradient elution； keeping the

6、column temperature at 40 t and the samples at 10 X with an injection volume of 5 p.1. Results There was a goo<l linearily of the calibration curve for 3-nitropropionic acid standard in the range of 4 0 - 40. 0 1ig/kg with correlation coefficient of 0. 98. The detection limit of <he method wa&#

7、187; I. 0 and the limit of quanliGcation was 4.0 (tg/kg. The average recovery fit three spiked level* wax in the range of 92. 5% -93. 6% . and the rehtive Afandanl <lerivation wua lower than 10% . Conclusion The method ift simplet rapidv sensitive and accurate, which can be uiied in the detection

8、 of 3 nitropropionic acid in “ar cane.Key words： Sugarcane; 3-nitmpr<»ptonic acid; olid-phai«c extrachon： UPLGMS/MStt«aM：2011<07.2S作者簿介：李兵 * 檢件 期完方向為金品中涔&構幡刑通佶作者：越生 * 樹Jt條技得 有寬方向為心品中為物及索殺成分校雙 E-mail ：lxyi>e(»yMh. netprotein intaket and the risk ol(pul in men J； N En&

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10、clic com pounds in citrus ”加1- 127-oils J. J Pharmacrut Biomed »2000 ,24( 1 ) ：I47-1S4.ill張書時，陳勇,袁律慶無環(huán)4苦和弱隙睢的育效毛細督電泳 海定D)分析化學.1996,24( 10) ：1212“21£12 LOL S N.CHEN T Y. Siudir uo the 山川<卬 method of the punne enntrntv in (iahen products; J. Food Sci, 1997,24( i )： ML13 JOU J H. KER K C.

11、The investiga60n of anthlical method of purine contml in high punne foodn . J. Nutr Sei J, 1999.24 (4).366-378.中國是甘蔗生產(chǎn)大國之一,所生產(chǎn)的甘蔗含糖量 高，還含右豐富的維生素、無機元素等營養(yǎng)成分,是人 們再愛的水果，同時也是制造讖糖的主要原料。但ft 族霉變后可產(chǎn)生導致人類和動物中毒的毒素3-硝圓 丙族（3、nitruprupionic acidt3-NPA）o 3-NPA 是一種暗 神經(jīng)毒素 3 .可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生產(chǎn)重損傷"a 1972年23月份我國北方相繼發(fā)生了多

12、起因食用毒 變甘讖導致的中毒事件.重癥病人多為兒童及青年, 其中約10%死亡，幸存者往往留F嚴取的后遺癥：'。 1984年我國研究人員發(fā)現(xiàn)并首次闡明笥變甘蔗中簽 胞毒菌的代謝產(chǎn)物3-硝理丙酸是導致中毒的主要原 因。歷年來，我國均有食用苒變甘蔗中毒的報 道''°。R生部門每年都會發(fā)出食品安全預警提醒 消費者不要購買密變甘蔗，目前關于甘蔗中3-NPA的檢測方法報道較少， 旦不同基質中的3-NPA檢測方法不一，多為提取液 經(jīng)過液液分配凈化后.經(jīng)過薄總色譜法、氣相色譜 法、氣相色諳-質譜法和高效液相色譜法測定 不僅前處理率助費時，靈敏度低、回收率不高,使用 氣相色滯法

13、時還需要衍生，難以適應快速檢刑工 作加之甘蔗含精依高，基質較為復雜,如果不經(jīng) 凈化，提取后直接進樣會對儀器造成污染，并且會 降低靈敏度。固相萃取方法溶劑使用越小、快速. 何收率高，是一種環(huán)境友好的前處理方法。超高效 液相色譜一串聯(lián)質潛法靈敏、快速.本文通過對甘芥 中3-NPA的提取、凈化及測定條件的優(yōu)化,建立了 甘蔗中3-NPA乙睛提取、固相萃取凈化以及超高效 液相色譜-串聯(lián)質潛測定方法。具有操作簡便、快 速、靈敏度高等特點。目前國內外還未見相關方法 的報道。I材料與方法1. 1儀器和試劑超高效液相色譜質譜/質譜聯(lián)用儀：配備有 ACQUITY對高效液相色譜儀,Quattr。Premier XE

14、質 譜儀（Waters公司）.離心機（Beckman公司）,均質 儀 B<00（BUCHI 公司）。Sep.pak 風格柱（500 mg/6 ml. Watem 公司）。 甲醉、乙腦（色譜純.迪馬公司）。甲酸（分析純，北 京化學試劑公司）。試臉用水均為超純水（25 P電 阻率8.2 Mncm,Millipore公司）。3-硝拓丙酸 標準品純度大于98% （Sigma公司）。3,硝其丙酸標準儲備液的配制：稱取標準品 10.0 mg,用甲醉溶解后轉移至10.0 m】粽色容居瓶 中,用甲醉定容，配制成質成濃度為L0 mg/ml的 標準儲備液，于-20 P條件下保存。3-硝基丙酸標準工作液的配制

15、：取上述標準儲 備溶液0. 10 ml,置于10.0 ml棕色容量瓶中,用甲 醇定容，配制成10.0 IM/ml標準中間液，取上述標 選中間液0.10 ml于10.0 ml棕色容量瓶中，用甲 靜定容,配制成100。ng/ml標準工作液,樣品定容溶液：稱取0.385 g無水乙酸被溶解 于500 ml水中，加入1 ml甲酸,水定容至1 000 ml, 配成濃度為0J %甲修水的5 mmol/L乙酸鉞溶液。 1.2儀器條件超高效液相色潛條件：色譜住Waters ACQUITY BKH Clst£（L7 p.m.50 mm x2. I mm）,柱溫 40 t ； 樣品溫度10 T ;進樣體積

16、5 p.lo流動相A為水. 流動相B為乙睛，梯度洗脫.梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution programWffl(mm)流速（ml/m而）就動相A（% ）流動相B（%）00. 25095.05.03.000. 23010.090.04.000. 25010.090 04. 500 25095.05.0質譜條件：離子源：電噴霧高子源（ESI-）；掃 描方式：多反應監(jiān)泅YRM、毛細管電壓2.5 kV；離 子源溫度100t；脫溶劑氣溫度450 tC；脫溶劑氣流 Q 500 L/h；錐和電壓12 V；離子碰撞能址10 eVo3硝基丙酸質譜條件：母閾子（

17、m/z） 118.0；特 征離子（m/z）46. 0。1.3 樣品的制備將甘蔗去皮，均質儀均質，稱取1.0 g試樣.置 于50 ml雨心管中，加入10.0 ml乙腦.振蕩20 min. 加入I g氨化衲.振蕩10 min J- 10 000 r/min條件 下離心10 min,取上清液5 ml.待凈化;效基固相率取住用6 ml乙醇活化后，將試樣溶液 過柱，先用4 ml 10%甲醉水溶液淋洗，再用5 ml 10% 甲醉氨洗脫,收袈洗脫液.用氮氣吹至近千.用。1% 甲酸水5 nimol/L乙酸鉉溶液定容至1.0 ml后，過 0.22 »xm濾膜后超高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。1.4 基質

18、加標工作曲線的制備分別稱取6份1.0 g空白樣品基質于50 ml離 心管中，分別加入100.0 ng/ml標準工作液40、80、 120J 60,200,400 1d，依1.3方法處理,制備基質加 標工作曲線.濃度為4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、 40.0 jxg/kg,在上述優(yōu)化的儀器條件下進行測定。 蛉制基質加標工作曲線。1.5 定性及定居在1.2儀器條件下測定基質加標標準溶液及樣 品溶液，目標化合物以保留時間和特征面子定性. 要求被測試樣中目標化合物的保留時間與標準溶液 中國食據(jù)衛(wèi)生雜志CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE130中目標化合物的保留

19、時間一致（偏差小于20%）。 以標準溶液濃度對特征離子峰面積繪制標準曲線, 外標法定量。樣品中待測物3.NPA的濃度按下述 公式進行計算：式中,C 一樣品中目標化合物含量（pg/kg）； c一測定液中目標化合物的量（陽？ /ml）；，一試樣定 容體枳（ml）；即一稱試樣質量（kg）。2結果與分析2.1 色譜柱的優(yōu)化液相色譜法分析3-硝基丙酸一般使用C”反相 色譜柱，由于3-硝基丙酸具"較強的酸性和親水 性，在反相色譜柱上保留較弱，為了增強保留有 關作者曾使用琪酸二氫鉀溶液作流動相“，而 UPLOVS/MS在流動相中應避免使用®酸款，因此 本試驗考察r有利于極性物質保留的反相

20、色譜柱 Waters ACQUITY HSS T3, Waters ACQUITY BEH ShiddRPI8色詣柱，結果表明,與Waters ACQUITY BEH孰色譜柱相比，這兩種色譜柱對于3-硝基丙 酸的保留相差不多，并考察了 Waters ACQLITY BEH HILIC,Waters ACQLITY BEH Amide 兩種親水色譜 柱 " Wairre ACQUITY BEH Amide 色滯柱允許使 用的PH范闈為211,因此本試驗號累了乙腦.水、 乙睛。1%甲酸水、乙肺X）. 1%氨水、乙腦-5 mmol/L 乙酸鐵水溶液、乙脂0 1%甲酸5 mmol/L乙酸鉞水

21、 溶液、乙腦O 1 %銳水5 mmol/l.乙酸鉉水溶液流 動相體系對于Water* ACQLITY BEH HIUC色譜 柱，由于其允許使用的pH范圉為1 9,因此本成驗 考察了乙腑-水、乙腦O 1%甲酸水,乙睛S mmol/L 乙酸錢水溶液、乙脂。1%甲酸5 mmol/L乙酸被水 溶液流動相體系。對于兩種色譜柱均將純水乙睛、 乙照甲醉,以及初始比例流動相作為定容溶液進行 了考察。結果察明，HIUC 和 Amide色譜柱對于3- 硝基丙酸的保留情況相似,不同的流動相及定容溶 液時于3.硝基丙酸的保留幾乎沒有影響，在HILIC 和Amide色譜柱中3-硝基丙酸的出峰時間均早于 a柱，見圖I明3

22、。最終確定使用Waters ACQUFFY BEH 6色譜柱o 2.2流動相的優(yōu)化首先選取最常用的Waters ACQUITY BEH Cl9 色潛柱，對于流動相進行了考察，3-硝基0：N OH丙酸是一種小分子有機酸結構式,0 78MRMof I Charnel ES-/*'min/5I圖 I 3硝落丙酸在 Walers ACQUITY BEH CIg柱上的保招情況Figure 1 Th。retention of 3-iMUopropionic acid on the Walers ACQUITY BEH Cia column0.4060.81.0121.41.6 IStfmmffl

23、2 3硝 基內酸在 Waters ACQUITY BEH Amid 柱上的保留情況Figure 2 The retention of 3-nitropropionic acid on die Waters ACQUITY BEH Amid columnKfRMof 1 Channel ES- TJC 2 82Z圖 3 3 硝基丙酸在 Water® ACQUfTY BEH HIUC 柱上的保留情況Figure 3 The rcteniion of 3-ni(rvpropionic acid on the Watcre ACQUITY BEH HtLIC columnACD/Ubs V8

24、. 14 軟件計算出其 pKa 為 3. 661 log P 為-0. 17皿：，具有較強的酸性和親水性，在色譜柱 上的保留較弱'”，為了兼顧3-硝基丙酸在色諾柱上 的保留與質譜上的響應，對于甲醉.水、乙睛.水、乙 睛。1%甲酸水、乙睛O 1%氨水.乙特O 1%甲酸 5 mmol/L乙酸鐵水溶液、乙腑O 1%氨水5 mmul/L 乙酸鉞水溶液體系進行了名察。結果表明,乙腦水 為流動相時的響應值要比甲醉-水高1倍左右，保留 時間差別不大，潦動相中加酸、堿或鹽時靈敏度較 低，可能是酸、堿或鹽的存在抑制了 口標化合物的 電離,并且對于酸的濃度（0. 1% ,0.3%、0.5%）進 行優(yōu)化后發(fā)

25、現(xiàn)保留沒有明鼠增藻。因此確定乙睛- 水為流動相。為了增強目標物在色諾柱上的保笛，對定容溶 液進行了優(yōu)化：純水、乙盾-水、0.1甲酸水。1% 氨水、0. 1%甲酸水5 mmol/L乙酸核、0. 1%氨水 5 mmol/L乙酸鐵發(fā)現(xiàn)使用0. 1%甲酸水5 mmoi/L 乙酸儂作為上機溶液時不僅保留時間明顯增強而 旦響應也最佳。最后確定流動相為乙精水梯度洗 脫。1%甲酸水5 mmol/L乙酸被作為定容溶液° 2.3樣品提取溶液的選擇在空白廿蔗基質中加入3硝基丙酸標準溶液， 分別用水、乙肪、甲醇、丙酮、乙酸乙酯各10 ml振蕩 提取20 min.結果衣明,以乙腦作為提取溶劑提取率 最高，因此

26、，確定乙將作為提取溶劑。2.4 氯化鈉加入屬的優(yōu)化因為甘蔗中含有大量的水分，使用氨基柱凈化 時，要在上柱溶液中最大限度地降低水的含量，因 此在提取過程中要加入氯化鈉使水相和有機相分 冏，取行機相過固相不取杜。本試驗對于箱化鈉的 加入員（0.5、】，2 g）進行優(yōu)化，結果回收率較為接 近,而適量的氯化鈉在離心后有助r減少有機溶劑 中的漂浮物，使樣品更加清激，有利于固相萃取的 進行。因此本試驗選擇家化鈉的加入量為1 So 2.5 固相萃取柱的選擇WS/T 10-1996變質甘蔗食物中潴診斷標準 及處理原則采用謝pH值后乙酸乙酯提取甘蔗 樣品,再采用2%碳酸氫鈉在分液漏斗中提取乙酸 乙酯溶液，收集水

27、相奔去乙酸乙隔層,再用三氯用 烷溶液提取碳酸氫鈉層后棄去三氯甲烷層，最后調 朽pH位后再采用乙酸乙脂提取,完成提取凈化過 W 采用不同極性的溶劑反更多次的液-液萃取進 行凈化較為費時,而且溶劑使用出大,在多次的萃 取中容易造成損失。本試驗采用環(huán)境友好的固相荒取技術完成甘 就中目標化合物的富集和凈化，選取Oasis MAX、 Oasis WAX、Oasis HLB、氨基柱4種小柱進行篩選。 3-硝普內酸分尸結構中帶有一COOH,首先選擇 MAX柱.MAX柱是一種混合型的固相萃取柱，同 時具行反相吸附和陰高子交換的功能，對于酸性2012年第24卷第2期物質有較好的選擇性,。使用加標的乙精溶液上 柱

28、后,收集上柱液分析，可以確定樣品完全保留在 柱子匕對洗脫液進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)0. 1% J）. 5%、 1%、3%、5%、10%、20%甲酸甲醉溶液均回收較 差，扶至使用0.1 mol/L鹽酸仍無法將目標物洗脫 下來“釣。Oasis WAX洗脫時有二種模式1a”： 一 種洗脫液的pH大于填料的pKa兩個pH單位.使 境料呈中性狀態(tài),而使目標物洗脫；另種洗脫液 的pH小于目標化合的pKa兩個pH單位，使目標 化合物呈中性狀態(tài)而洗脫。其中第二種模式與 Oasis MAX相同.因此采用第一種模式進行試臉， 使用加標的乙肪溶液上柱后，收集匕柱液分析,可 以確定樣品完全保留在柱子上，但通過對0. 1%至 2

29、0%的一系列貳水甲解洗脫液進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)回 收率均較差.HLB住是親水-親脂平衡固相萃取 柱,應用較為廣左H。本試驗對于多種上柱溶液 進行了優(yōu)化，分別在水、甲醇、乙精、甲酸水、鹽酸 水溶液中加標，收集上柱溶液,發(fā)現(xiàn)HLB柱對目標 物的保留均非常微弱。寂基柱在非極性溶液和水 溶液中可分別表現(xiàn)出極性吸附作用和利的陰離子 交換作用。使用加標的乙肪溶液上柱后，收集上 柱液分析,可以確定樣品完全保留在柱子上，使用 氨水甲醇作為洗脫溶劑，可以獲得較好的回收最 終確定使用史基柱。2.6 氨基固相萃取柱條件的優(yōu)化H林中畬有大鼠的慵分，提取后直接進入色漕 系統(tǒng)會對色譜柱造成污染，為了提高凈化效果.本 試驗使用氨

30、基固相萃取柱對于tt蔗中的3硝基內 酸囪集后，使用甲醉水溶液淋洗,進行樣品凈化。 采用水含量分別為0、10%、20%、30% ,40% .50%、 60%（y/y）的水.甲髀溶液進行淋洗.考察3.硝氈四 酸的損失情況.結果見圖4。結果表明當溶液中水 含量超過20%時,3 硝基丙酸有損失，為了避免損 失，乂最大限度地除去樣品中可能對目標化合物產(chǎn) 生干擾的氈質，本試臉選擇了含10%甲醉水溶液作 為淋洗液。吸附于氨基固相落取柱上的3.硝基丙 酸.需要在極性溶劑中洗脫。本試驗對氨水含員為 0.2%、4%、6%、8% JO% J2%的甲障和乙庸溶液 的洗脫能力進行了試驗，見圖5,最終確定以10%迎 水甲

31、靜溶液作為洗脫溶液.2.7 定址方法的選擇由于甘蔗樣品含增量高,基質復雜，提取后需 凈化,才能采用液相色譜申聯(lián)質誑進行測定，操作 過程中難免會造成損失,由于無法得到3-硝翦內酸 的同位索內標，因此選擇了基質加標工作曲線進行 外標法定量，對操作過程的損失進行校正0中國食品衛(wèi)生雜忐CHINESE JOURNAL OF FOOD HYGIENE 1322012年第24稔第2期圖4淋冼液中水含量對3硝基內酸的影響Figurt- 4 Influence of waler content in washing solution on the peak irea of (he lout 3-nilropro

32、pionic acidMJOOISOIOOWOI2C.00IOCOO氨水含量G圖5敘水含St不同的洗脫液的洗脫效率Figure 5 The percentage of ammonia in eluting solvent and the elution efficiency2.8 檢出限、精密度、回收率及線性范圉在空白基質中加標，按照L3所述方法進行提 取、凈化和濃縮，得到基質加標工作曲線。線性范 圍為 4.0 40.0 jg/kg,線性方程為 y =20.9* 13.9,線性相關系數(shù)(r)為0.998。方法的定性檢出 限為L0隰g/kg,定址檢出限為4.0 11g/kg。分別稱取1 g不含3

33、-NPA的甘蔗，分別加入 100.0 ng/nd 3-NPA 標準溶液 40、60、80 出1.使得樣 品中的加標濃度為4.0、6.0和8.0業(yè)"kg,每個濃度 做5個平行，依L3方法處理后上機測定。計算平 均回收率及相對標準偏差(RS。)。如表2所示，3 個加標濃度水平下所得平均回收率均在92.5% 93. 6%之間，相對標準偏差均小于10% ,可以滿足 3 -硝基丙酸痕量檢測的要求。表2方法精密度及1可收率Table 2 The recovery and precision of the method(n =5)本底伍(“)加標水平 (w“)檢出儂度 (UK)回收率 (%)RSD

34、 (»)04.03.793.09.006.05.592.54 908.07.593.66.72.9 實際樣品的測定運用本方法對23月份的10份市售甘蔗樣本 進行了分析，均未檢出3硝基丙酸。隨機取其中5 份樣本置于-20 t冰柜保存3個月后取出進行分 析,檢出濃度為2.95.6 g/kgo3結論本文建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián) 質譜測定甘蔗中3 -硝基內酸的方法，周相萃取方 法溶劑使用且小、快速、回收率高，是一種環(huán)境友好 的前處理方法。超高效液相色譜一串聯(lián)質譜法靈 敏、快速°本方法適合用于甘庶中3-硝荒丙酸的 測定,為監(jiān)測市售甘庶中3 -硝基丙酸的產(chǎn)生情況 提供了實用的

35、技術手段，可以滿足中毒樣品的快速 檢測，參考文獻( 汪做.雷根玉，馮學勤，等.沙打旺中做 3 硝茶丙酸的，加 色時測定中何觸992,316972(2 在做.雷祖玉馮學勤.萼.不同品種和彩盒掙點多變小冠花 中的3硝茶丙艘唐川中地學報.1994.2(1 )：8994.(3 陳明,胡攵M棟君君,等 天然傳京3&茶丙酸的研究或 狀外醫(yī)學II生學分冊，1988.17(3) |1”461.4 )劉興琦,羅3元，目可在.變質甘筋中毒的病因研究1 .流行 病學及嗔床資料的分析以及中毒憚品的毒性成Sk"J衛(wèi)生 研究.1984/3(5九2428.(5 PERAICA M w DOMUAN A.

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