1、體外構(gòu)建的HTA HSP70BC沖激的樹突狀細胞疫苗 的抗腫瘤作用08-05-05 11:33:00 編輯：studa20cm作者：孫光，郭連英，沈潔，劉丹丹，施廣霞，錢振超【摘要】目的觀察體外構(gòu)建的欖香烯復(fù)合瘤苗抗原 卡介苗熱休克蛋白 70復(fù)合物(HTA HSP70BCG 誘導(dǎo)的樹突狀細胞疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。方法 來源于 小鼠的肝癌 Hca F 欖香烯復(fù)合疫苗的抗原(HTA 與卡介苗來源的 HSP70(HSP70BCG 在體外構(gòu)建成 HTA HSP70BC 復(fù)合物，用 GM CSF 和 IL 4 誘 導(dǎo)樹突狀細胞(DCS，分別用 HTA HSP70BCGHTA 和 HSP70BC 對其沖激。

2、用 MTT 法檢測該DCs 刺激的全脾細胞的增殖活性及被刺激的脾細胞的細胞毒活 性。用流式細胞儀檢測DCs 表面 CD86 和 CD40 的表達。結(jié)果體外構(gòu)建 HTA HSP70BC 可以誘導(dǎo) DCs 成熟，表現(xiàn)為 DCs 表達 CD86 和 CD40調(diào)，該 DCs 可以 刺激全脾細胞增殖并使其產(chǎn)生特異性殺瘤活性，其強度明顯大于HTA 結(jié)論體外構(gòu)建 HTA HSP70BC 復(fù)合物可以誘導(dǎo) DCs 成熟，該 DCs 可以激活脾細胞產(chǎn)生 較強的特異性抗瘤效應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】熱休克蛋白 70；樹突狀細胞；腫瘤瘤苗；抗瘤效應(yīng)基金項目：教育部高等學(xué)校骨干教師資助計劃An titumor EffectsIn

3、ducedbyDen dritic Cell Vacci ne Pulsedwith HTA HSP70BCG Complex Reco nstituted in VitroAbstract : ObjectiveTo investigate antitumor effects inducedby dendritic cells (DCs) pulsed with complex of tumor antigen from eleme ne combotumor cell vacci neheat shock prote in 70 of BCG(HTA HSP70BCG).Methods T

4、umor antigen peptides from elemene combo HcaFcell (HTA) combi ned with HSP70BCG into HTAHSP70BCGin vitro. DCs were in duced in medium with GMCSF and IL 4 andpulsed with HTA HSP70BCG, HTA and HSP70BCG, respectively. The proliferati onstimulati ng effects on unseparated sple no cytes andthe cytotoxici

5、ty of the sple no cytes activated with DCs were evaluated with MTT assay.The expressio n of CD40 and CD86 on the surface of DCs was assessed by flowcytometer.ResultsPulsi ng of HTA HSP70BCGresulted in DCs maturati on, characterized by upregulati on of CD86and CD40. Proliferatio n in dex of unseparat

6、ed sple no cytes from HTAHSP70BCG group was sig nifica ntly in creased as compared with HTA group. U nseparated sple no cytes from DCs pulsed with HTAHSP70BCGrevealed the cytotoxicity agaist HcaF, The HTA failed to revealthe cytotoxicity agai nst HcaF.Co nclusio nHTA HSP70BCG couldin duce DCs matura

7、ti on and the mature DCs could activate sple no cytes to gen eratemore pote nt specific an titumor effect.Key words : Heat shock protein70 ； Dendritic cell； Tumorvaccine ； Antitumor effects0 引言熱休克蛋白(Heat shock proteins , HSP9 是細胞受到應(yīng)激時新合成或合成增加的一組蛋白質(zhì)， 被稱為分子伴侶， 在細胞抗原的加工和提呈方面起 重要作用1。分枝桿菌 HSPs 與相關(guān)抗原形成融合蛋

8、白可誘導(dǎo)特異性 T 細胞 反應(yīng)，分枝桿菌HSP70 富含 T、B 細胞表位，是細胞免疫的重要靶點，可被用來 作為疫苗的載體2?，F(xiàn)已證明，從腫瘤細胞來源的HSPs 腫瘤肽復(fù)合物可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答3, 4，HSP70BC 能通過樹突狀細胞(Dendritic cell，DC 表面TLR4 途徑誘導(dǎo) DC 成熟 5 。 本實驗采用欖香烯處理的 Hca F 腫瘤抗原(Tumor antigenof HcaF treated with elemene， HTA 在體外與卡介苗熱休克蛋白 70 (HSP70BQG 構(gòu)建成腫瘤疫苗 HTA HSP70BC，探討 其抗瘤效應(yīng)及機制。1 材料1.1實驗動物與瘤

9、株BALB/C 近交系小鼠，引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥物研究所。Hca F 肝癌細胞株由本校凌茂英教授惠贈。L929 小鼠成纖維細胞瘤細胞系，由中國醫(yī)學(xué) 科學(xué)院腫瘤研究所張友會教授惠贈。1.2主要試劑RPMI 1640 (GIBCO USA ;胎牛血清、rm IL 4、rm GM CSF (Sigm)； FITC 抗小鼠 CD40 PE 抗小鼠 CD86 抗體(San Diego，CA ; ADP( Trinity Biotech ， Ireland)。2 方法2.1 HTA IISH70BCG 的體外構(gòu)建按本室常規(guī)方法制備欖香烯復(fù)合瘤苗，細胞濃度調(diào)至1X108/ml，用電動勻漿器研磨制成細胞勻

10、漿，超速離心 100 000g，取上清組分作為粗制腫瘤 抗原(HTA。超聲碎 BCG，超速離心后取上清，用 ADP 親和層析法6分 離卡介苗 HSP70 提取物經(jīng)電泳和 Western blot 鑒定。分別用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。按比例將兩類成分混合加ADP 使之相互作用形成復(fù)合物。2.2DC 的誘導(dǎo)及沖激按本室常規(guī)方法獲得小鼠骨髓細胞，用含15%臺牛血清的 RPMI 1640（含和 ）培養(yǎng)液將其濃度調(diào)到 1x106/ml，在37C、5%CO 條件下培養(yǎng)，第 3 天換液，第 6 天收集不粘附細胞為骨髓樹突狀 細胞（不成熟樹突狀細胞），將其濃度調(diào)至 1X106/ml，分別加入 HSP70B

11、CG HTA至終濃度25 卩 g/ml，培養(yǎng) 24h，收集細胞做細胞表型分析和沖激全脾細胞。2.3DC 對全脾細胞的刺激作用按本室常規(guī)方法獲取全脾細胞，全脾細胞濃度調(diào)至4x106/ml，不同處理的 DC 濃度為 4X105/ml，各取 100 卩 l 加入 96 孔板培養(yǎng)，于 72h 以 MTT 法測 定增殖活性，以刺激指數(shù)為指標(biāo)，其計算公式為：刺激指數(shù)（SI）=實驗組OD595 對照組 OD5952.4刺激后的脾細胞的細胞毒活性將不同處理的 DC （濃度為 4X105/ml）與全脾細胞（濃度為4X106/ml ）共同培養(yǎng) 5 天，收集該細胞為效應(yīng)細胞,細胞濃度調(diào)為4X106/ml，以 L929 為靶細胞，細胞濃度調(diào)為 4X105/ml，各取100 卩