1、非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表達及突變的研究 作者：劉元華, Christophe Leboeuf, 金曉龍,肖家誠, Anne Janin, 陳賽娟，趙維蒞【摘要】 本研究探討78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表達和突變的發(fā)生率及其臨床意義。應用激光微切割技術從淋巴結組織中特異地分離淋巴瘤細胞，用實時定量RT-PCR法檢測淋巴瘤組織和淋巴瘤細胞中BCL-XL的表達，PCR直接測序法檢測BCL-XL的突變情況。結果表明：與淋巴結反應性增生（15例）相比，濾泡性淋巴瘤（30例）組織和微切割的淋巴瘤細胞均高表達BCL-XL（P值分別為0.0064和<0.0001），而T細胞淋巴瘤（2

2、4例）和彌漫性大B細胞淋巴瘤（24例）中BCL-XL表達無明顯升高。在濾泡性淋巴瘤中，BCL-XL高表達的患者常伴多個淋巴結外器官累及（P=0.0004），血清乳酸脫氫酶水平升高（P=0.0019），國際預后指數分組多為高危組（P=0.0013），患者總生存期短（P=0.0451）。突變檢測發(fā)現1例濾泡性淋巴瘤BCL-XL的同義突變（密碼子 109 ACAACC）。結論：BCL-XL表達與濾泡性淋巴瘤的疾病進展和患者預后密切相關。 【關鍵詞】 非霍奇金淋巴瘤；BCL-XL基因；基因表達；基因突變BCL-XL Expression and Mutation in Non-Hodgkins Lym

3、phomaAbstractThe study was aimed to investigate the BCL-XL expression and mutation, and its clinical significance in non-Hodgkins lymphoma. Lymphoma cells were selectively isolated by laser microdissection. BCL-XL expression from lymphoma tissue and microdissected lymphoma cells was measured by usin

4、g real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. BCL-XL mutation was analyzed by using direct sequencing of PCR products. The results showed that compared to 15 patients with reactive hyperplasia, BCL-XL was overexpressed in follicular lymphoma (n=30), both in lymphoma tissu

5、e (P=0.0064) and in microdissected lymphoma cells (P<0.0001). No significant rise of BCL-XL expression was observed in patients with T-cell lymphoma (n=24) and diffuse large B cell lymphoma (n=24). In follicular lymphoma, high BCL-XL level was associated with multiple extranodal involvement (

6、P=0.0004), elevated lactate dehydrogenase level (P=0.0019), high-risk international prognostic index (P=0.0013) and a short overall survival time (P=0.0451). Mutation analysis revealed one synonymous mutation (Codon 109 ACAACC) in one case of follicular lymphoma patient. It is concluded that BCL-XL

7、expression is closely correlated with progress of follicular lymphoma and prognosis of patients with follicular lymphoma. The value of BCL-XL expression as a prognostic marker in follicular lymphoma should be considered.Key wordsNon-Hodgkins lymphoma; BCL-XL gene; gene expression; gene mutation淋巴瘤是一

8、種起源于淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。近20年來，非霍奇金淋巴瘤在世界范圍內的發(fā)病率幾乎增長了1倍，嚴重危害人類的健康1。 因而探索淋巴瘤的發(fā)病機制、掌握淋巴瘤的疾病進展相關基因，對于淋巴瘤的診斷治療前景，特別是開展個體化診治和基因靶向治療具有重要意義。凋亡異常對于惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著相當關鍵的作用。 凋亡受阻致使腫瘤細胞壽命延長， 異常堆積，最終引起細胞轉化和腫瘤形成2。 同時，誘導凋亡又是腫瘤治療，包括化療藥物治療、放射治療和免疫治療的重要機制之一。凋亡抑制可使腫瘤細胞產生耐藥，導致治療失敗或疾病復發(fā)3。細胞凋亡主要通過兩個途徑：外源性途徑和內源性途徑。后者起始于

9、線粒體細胞色素C的釋放，作用于凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1），誘導caspase-9活化，導致細胞凋亡2。BCL-2家族在調節(jié)凋亡的內源性途徑中起著重要作用，按其功能不同主要分為兩類：一類是促凋亡蛋白，包括BAX、BAK、BOK、BCL-XS、BID、BAD等，另一類是抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、A1等4。 在非霍奇金淋巴瘤中，內源性途徑受抑也是影響腫瘤細胞凋亡的重要因素5。BCL-XL是BCL-2家族的主要凋亡抑制因子，由BCL-X編碼，后者位于20q11.21，由3個外顯

10、子組成。BCL-X缺陷的小鼠表現為幼稚淋巴細胞的凋亡明顯增加，同時亦證實BCL-XL在淋巴瘤中表達6，7。然而，它在不同類型淋巴瘤中的表達情況和與疾病進展的關系尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究應用實時定量RT-PCR法檢測78例患者淋巴瘤組織和細胞中BCL-XL的表達，應用PCR直接測序法檢測是否存在BCL-XL突變，探討B(tài)CL-XL的表達及基因突變在淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的意義。材料和方法患者患者共78例, 來自上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院和法國巴黎第七大學圣路易醫(yī)院，其中男38例，女40例，年齡21-88歲，中位年齡52歲。按WHO病理分型，78例中T細胞淋巴瘤24例，彌漫性大B細胞淋巴瘤24例，濾泡

11、性淋巴瘤30例。對照組為淋巴結反應性增生患者，共15例。兩組均經患者知情同意后，留取部分淋巴結活檢組織，-80凍存，用于提取DNA和RNA。另有60例健康志愿者，采集其外周血，提取DNA，作為基因突變檢測對照。激光微切割用淋巴結冷凍組織制備7 m切片，70%酒精固定，蘇木素-伊紅染色。應用激光微切割儀（LEICA公司產品）切割約1 500個淋巴瘤細胞，自動置入TRIzoL中，用于RNA提取。DNA提取按常規(guī)酚-氯仿抽提，冷無水乙醇沉淀法提取基因組DNA8，最后溶于適量TE中。紫外分光光度計測定樣品DNA含量。RNA提取淋巴結組織總RNA經制備10-15片10 m冰凍組織切片后提取，淋巴瘤細胞總

12、RNA直接從激光微切割的細胞中提取，操作參照TRIzoL試劑盒說明書進行。cDNA合成通過逆轉錄反應將RNA 轉化為cDNA。25 l逆轉錄體系包括： 5×逆轉錄緩沖液5 l；dNTP 5 l；Oligo-dT 2 l；逆轉錄酶MMLV(Promega公司產品) 1 l；RNasin 0.5 l，淋巴結組織模板為1 g總RNA，激光微切割的淋巴瘤細胞模板為所有微切割產物提取的總RNA產物。反應條件：42 60分鐘，90 5分鐘，4保存。實時定量PCRBCL-XL和TBP（human transcription factor IID/TATA binding protein）的TaqM

13、an定量PCR試劑購自PEApplied Biosystems公司，通過ABI PRISM 7700定量PCR儀檢測。TBP作為內參校正樣本量，同時將表達BCL-XL的Jurkat細胞系9作對照。定量PCR結果參照2(-CT)法計算10，所示數值為每個標本BCL-XL表達量和Jurkat細胞BCL-XL表達量的比值。PCR直接測序采用Taq酶（購自申友公司）通過PCR法擴增BCL-XL各目的片段。PCR 反應體系為25l。擴增條件：預變性94 5分鐘；循環(huán)條件為94變性30秒, 退火溫度為54-60（根據各引物不同而改變）, 退火時間為30秒，72延伸50秒，共35個循環(huán)；72 7分鐘。擴增啟

14、動子區(qū)與外顯子的引物序列如下：啟動子區(qū)上游引物：5 TGCGGGGATGCCGGTAACTC 3；下游引物：5 GCCTCACCCTCACCCAGTCT 3 ；1號外顯子上游引物：5 TAATAGGGATGGGCTCA ACC 3；下游引物：5 CTTCGCAATTCCTGTGT CGC 3；2號外顯子上游引物：5 AAGAAAAGGGA CACACAAGG 3；下游引物：5 TGAGTGAGCAG GTGTTTTGG 3；3號外顯子上游引物：5 ATACCT GCCAGCCTCCTTTG 3；下游引物：5 TTTCCCC ACCCACCTACATC 3。PCR產物純化測序采用蝦堿酶（shri

15、mp alkaline phosphatase, SAP）和外切酶（exonuclease I）純化PCR產物。反應體系：4 l PCR產物（30 ng/l）；0.5 l SAP（3.3 U/l）；0.5 l Exon 1（20 U/l）；用ddH2O定容至10 l。反應條件：37 60分鐘，80 15分鐘。純化產物經電泳定量，將濃度調整至10 ng/l后采用ABI 3700自動測序儀（PE Biosystems公司）進行直接測序。統(tǒng)計學分析 數據以均數±標準差（X±SD）表示，使用t檢驗分析?；颊唠S訪截止期為2005年6月，總生存期（OS）即患者從診斷到死亡或隨訪截止期的

16、時間。生存分析按照Kaplan-Meier法進行，應用Log-rank和2檢驗，P值小于0.05具有統(tǒng)計學意義。所有處理均用SAS 8.2統(tǒng)計軟件完成。結果非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表達與反應性增生淋巴結相比，濾泡性淋巴瘤組織的BCL-XL表達顯著升高（P=0.0064），而在T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤與之相比無顯著差異（表1）。Table 1. BCL-XL Expression in Non-Hodgkins Lymphoma （略）濾泡性淋巴瘤細胞表達BCL-XL運用微切割技術從濾泡性淋巴瘤組織切片中直接分離淋巴瘤細胞，運用定量PCR法檢測BCL-XL表達。結果表明，與反應性增生

17、的淋巴細胞相比（2.79±0.59），微切割的濾泡性淋巴瘤細胞高表達BCL-XL（9.00±4.26，P<0.0001）。濾泡性淋巴瘤BCL-XL表達與疾病進展和患者預后相關在濾泡性淋巴瘤中，具有多發(fā)淋巴結外浸潤、血清乳酸脫氫酶水平升高和國際預后指數分組（international prognostic index, IPI）為高危組的患者BCL-XL表達顯著升高（P值分別=0.0004、0.0019和0.0013）（表2）。在T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤中無上述差異。Table 2. BCL-XL gene expression of follicul

18、ar lymphoma patients in relation to clinical characteristics（略）根據淋巴結反應性增生組BCL-XL的平均值（3.13）將濾泡性淋巴瘤患者分組，BCL-XL相對高表達的患者（>3.13，A組，n=20）2年和5年OS分別為94.74%和43.21%，顯著低于BCL-XL相對低表達的患者（<3.13，B組，n=10，2年和5年OS 均為100%，P=0.0451）（圖1）。在T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤中，BCL-XL表達與患者生存無顯著相關。BCL-XL基因突變分析運用PCR產物直接測序法，我們在78

19、例非霍奇金淋巴瘤中發(fā)現1例濾泡淋巴瘤的BCL-XL基因伴不改變氨基酸的同義突變密碼子109 ACAACC（圖2），突變發(fā)生率為1.28%,與NCBI 的SNP 數據庫和60例正常人比較后未見相同的變異。討論細胞凋亡是由于細胞內外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)所引起的細胞主動死亡過程，在細胞增殖和腫瘤發(fā)生等過程中起著十分關鍵的作用。然而，凋亡的調控基因根據腫瘤類型的不同而有所改變。與侵襲性較高的T細胞淋巴瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤相比，低度惡性的濾泡性淋巴瘤中高表達BCL-XL，說明凋亡異常在“惰性”淋巴瘤中的重要性5。淋巴瘤組織中除淋巴瘤細胞以外，還包含炎性細胞，基質細胞以及正常細胞，后者可能影響基因研

20、究的特異性和敏感性。本研究中，我們通過激光微切割技術直接選取了濾泡性淋巴瘤細胞進行定量PCR檢測。結果表明，微切割的淋巴瘤細胞與反應性增生的淋巴細胞相比，前者BCL-XL表達的水平更高，這進一步證實了高表達的BCL-XL是濾泡性淋巴瘤細胞本身表達的。與BCL-2相似，BCL-XL可穩(wěn)定線粒體膜通透性，通過減少凋亡因子的釋放而抑制細胞凋亡。然而，BCL-XL除與BCL-2具有相同的抑制細胞凋亡的作用外，還可在功能上替代后者，挽救因BCL-2缺失而致的淋巴細胞凋亡，這在BCL-2-/-的BCL-XL轉基因小鼠中已被證實11。 同時在高表達BCL-2的濾泡淋巴瘤細胞中，下調BCL-XL的表達，淋巴瘤

21、細胞將隨之發(fā)生凋亡12。 因此，BCL-XL是影響濾泡性淋巴瘤細胞凋亡的關鍵因素13。深入的研究表明，BCL-XL高表達與患者的疾病進展密切相關。腫瘤細胞凋亡受抑，浸潤各臟器，表現為診斷時即具有多處淋巴結外累及；同時腫瘤負荷增加，表現為血清乳酸脫氫酶升高；相應地，患者的國際預后指數分期多位于高危組。更重要的是，已知BCL-XL可抑制CD40和化療藥物介導的腫瘤細胞的凋亡14，15，BCL-XL高表達的患者預后不良，這從另一角度反映了腫瘤細胞的耐藥性。 為探索其異常表達的機制，我們檢測了BCL-XL的突變情況。結果在78例非霍奇金淋巴瘤僅發(fā)現1例濾泡淋巴瘤存在突變，但為同義突變，不改變氨基酸序列

22、。Yamaguchi等16在50例非霍奇金淋巴瘤中也僅發(fā)現1例彌漫性大B細胞淋巴瘤有BCL-XL突變。因此，BCL-XL在淋巴瘤細胞中具有高度保守性，其表達上調的原因有待于進一步研究。綜上所述，BCL-XL的異常表達在濾泡性淋巴瘤發(fā)生進展中具有一定的作用，可作為濾泡性淋巴瘤一個重要的預后指標和基因治療靶點。【參考文獻】 1 Fisher SG, Fisher RI. The epidemiology of non-Hodgkins lymphoma. Oncogene， 2004; 23: 6524-65342Kitada S, Pedersen IM, Schimmer AD, et al.

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