1、湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！分子診斷學(xué)完整終結(jié)版1.分子診斷學(xué): 是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法來(lái)研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和2.SNP:單核音酸多態(tài)性，指在基因組上單個(gè)核昔酸的變異，形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。3.基因（gene）:是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA 所必學(xué)的全部核苷酸序列，是遺傳的結(jié)構(gòu)和功能單位。分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因。4結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA 的編碼序列調(diào)控基因：保證轉(zhuǎn)錄功能起調(diào)控作用的非編碼序列5 操縱子 （ operon） 操縱基因與其控制下的結(jié)構(gòu)基因共同組成的功

2、能單位6斷裂基因：指基因的內(nèi)部存在間隔區(qū)，間隔區(qū)的DNA 序列與該基因所決定的蛋白質(zhì)沒(méi)有關(guān)系。間隔區(qū)又稱為內(nèi)含子。出現(xiàn)在成熟RNA 中的有效區(qū)段為外顯子。7 .重疊基因：指基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸重疊的基因8 .跳躍基因：又稱轉(zhuǎn)座子，基因在染色體上的位置不固定，能由一條染色體跳到另一條染色體上。9 .必須基因：生物體中存在的一些維持生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基因，缺少或突變這些基因均能導(dǎo)致生物體死亡10 .基因組（genome） ：細(xì)胞中一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和 .11基因組結(jié)構(gòu)主要指不同的DNA功能區(qū)在DNA分子中的分布和排列12多順?lè)醋樱╬olycistron ） ：

3、操縱子中常常有一至多個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串連一起，受同一個(gè)調(diào)控區(qū)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄在同一個(gè) mRNA 分子中。13 .黏性末端：基因組雙鏈兩端具有能夠互補(bǔ)的單鏈DNA 部分14 .末端正向重復(fù)序列：又稱末端冗余，指病毒雙鏈DNA 分子兩端有一段相同的核苷酸15 .末端反向重復(fù)序列（ ITR ） ： 指病毒基因組兩端的反向互補(bǔ)重復(fù)序列16 .重疊基因：指兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的ORF 共有一段DNA序列17 .分段基因：指病毒基因組由幾條不同的核酸分子組成，多冗于 tDNA 病毒， RNA 病毒及雙鏈RNA 病毒18 .LTR:即長(zhǎng)末端重復(fù)序列，逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的dsDNA 中，兩端有LTR 結(jié)構(gòu)19

4、 .DNA 重組： 是指將不同來(lái)源的DNA 分子通過(guò)磷酸二酯鍵將末端連接形成重組DNA.20 .DNA 克?。ǚ肿涌寺。簩⒛骋惶囟―NA 片段通過(guò)重組DNA 技術(shù)插入到一個(gè)載體（質(zhì)粒和病毒等）中，然后在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制所得到的大量完全相同的該DNA 片段的群體。21.限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（RFLP：個(gè)體之間DNA勺核昔 酸序列存在差異，稱為 DN夠態(tài)性。若因此而改變了限制性 內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱RFLP。22. 限制性核酸內(nèi)切酶（RE） : 重要的工具酶之一。RE 是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA寺定核昔酸序列的核酸水解酶.（水 解磷酸二酯鍵）2

5、3.DNA聚合酶I是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè) DNA聚合 酶，分子量為109000具有5 '3'聚合酶活性、3'5'核酸外 切酶活性、 5 -3核算外切酶活性的工具酶。24.Klenow片段：用特異性的蛋白酶可將 DNA聚合酶I裂解為小片段與大片段，大片段即Klenow 片段，具有5-3聚合酶活性及3 -5外切酶活性，而失去了53外切酶活 性，是分子生物學(xué)研究的常用工具酶25 .TaqDNA聚合酶：一種耐熱的依賴DNA的DNA聚合酶。具有53聚合酶活性和依賴于聚合作用的 53外切酶活 性。 （最佳作用溫度是7080， TaqDNA 聚合酶可用于DNA測(cè)定及通過(guò)聚

6、合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)DNA分子的特定序列 進(jìn)行體外擴(kuò)增）26 .同工異源酶：在DNAk,來(lái)源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。27.逆轉(zhuǎn)錄酶：是具有依賴RNA 的 DNA 聚合酶活性、核酸酶 H 的水解作用、以DNA 為模版的DNA 聚合酶作用的多功能酶。28 .末端脫氧核糖核昔酰轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶） TdT :在 二價(jià)陽(yáng)離子存在下，催化d NT P轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈 DNA 分子的 3'-OH 末端的工具酶。29 . DNA連接酶：催化雙鏈DNA一端的3'0H與另一雙鏈DNA5 '端的磷酸根形成3 ',5/ 一磷酸二酯鍵，將 具有相同黏性末端或平端的兩條雙鏈

7、 DNAf段連接起來(lái)，實(shí) 現(xiàn)DNA勺體外重組，其催化黏性末端連接效率要比平末端高 得多。30 .堿性磷酸酶：用于催化去除 DNA RNM dNTP上的5'-磷 酸基團(tuán)的工具酶。31 .T4 多核苷酸激酶：來(lái)源于 T4 噬菌體感染的大腸桿菌包括前向反應(yīng)和交換反應(yīng)。用于催化 ATP上的丫 -磷酸轉(zhuǎn)移 到DNA鏈的5 /端上的工具酶.32 .核酸酶S 1 :可用于水解雙鏈 DNA、RNA或DNA R N A雜交分子的單鏈部分的工具酶.33 .載體（vector ）:是攜帶靶DNA（目的DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具，本質(zhì)為DNA。34 . 克隆載體：能將目的基因在受體細(xì)胞中復(fù)

8、制擴(kuò)增并產(chǎn)生大量目的基因的載體稱為克隆載體。35 .分子診斷主要特點(diǎn)：直接以疾病基因?yàn)樘剿鲗?duì)象，屬于病因?qū)W診斷，對(duì)基因的檢測(cè)結(jié)果不僅具有描述性，更具有準(zhǔn)確性；可準(zhǔn)確診斷疾病的基因型變異，基因表型異常以及由外源性基因侵入引起的疾??；靈敏度高，便于早期診斷及疾病預(yù)防；以基因分析為基礎(chǔ)，特異性高。36 分子診斷三個(gè)階段:（第一個(gè)階段：準(zhǔn)備和醞釀階段1953年前， 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，DNA 是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。（三個(gè)實(shí)驗(yàn)：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)） 、第二個(gè)階段：DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)、中心法則、PCR 技術(shù)第三個(gè)階段：2001 年， 首張人類基因組序列圖譜及其他物種基因組序列的

9、公布?；蚪M分、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的巨大技術(shù)進(jìn)步，促進(jìn)進(jìn)入第三階段，即以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集型技術(shù)。主要應(yīng)用：感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤的分子診斷，個(gè)體化醫(yī)療，其他如耐藥性、療效監(jiān)測(cè)，多基因疾病37 .四項(xiàng)生物技術(shù)：細(xì)胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基因擴(kuò)增技術(shù)38 .C值：基因組的大小，常用堿基數(shù)目或堿基對(duì)數(shù)目來(lái)描述 C 值是特異的，物種不同，差異極大，真核生物中，一般隨著進(jìn)化，C 值增大C 值矛盾：又稱C 值悖論，生物的進(jìn)化程度與基因組大小不完全成比例的現(xiàn)象39 .真核生物基因組基本特征：有細(xì)胞核基因組和細(xì)胞器基因組之分；核基因組以線狀 DNA分子的形式存在于染色 質(zhì)上；

10、基因多數(shù)為斷裂基因，有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和大量重復(fù)序 列；單順?lè)醋?，基因家族；核基因組由染色體 DNA組 成，分子量較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與蛋白質(zhì)結(jié)合。40 .注意點(diǎn)：染色質(zhì)的基本組成單位是核小體，由組蛋白核心和周?chē)腄NA 組成。組蛋白H2A、 H2B、 H3 和 H4 各 2個(gè)分子組成核心即組蛋白八聚體一個(gè)基因有n 個(gè)內(nèi)含子，則相應(yīng)有n+1 個(gè)外顯子重復(fù)序列分為4類：?jiǎn)我恍蛄小⑤p度重復(fù)序列（ 2 10 個(gè)拷貝）、 中度重復(fù)序列（ 10 12 個(gè)拷貝）、高度重復(fù)序列（1萬(wàn)以上）多基因家族：一些有編碼功能的重復(fù)序列，即指起源相同，序列相似，功能相關(guān)的的一組基因， 分為基因簇（相對(duì)集中分布在某一染色體的特定區(qū)

11、域）和另一類基因家族成員在整個(gè)染色體上散在分布，甚至位于不同染色體超基因家族：由基因家族和單基因組成的較大的基因家族，結(jié)構(gòu)不等的同源性，功能不一定相同假基因：基因家族中有的成員因突變而失活，不能表達(dá)出有活性的產(chǎn)物。41人類基因組計(jì)劃（HGP） ：旨在測(cè)出人類基因組30億堿基對(duì)的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并確定它們?cè)谌旧w上的位置，破譯人類全部遺傳信息，發(fā)展基因組學(xué)新技術(shù)，探討人類基因組研究的社會(huì)法律與倫理等問(wèn)題的一個(gè)國(guó)際性研究項(xiàng)目。1）主要任務(wù)：人類的 DNA 測(cè)序， 包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜等的繪制2）測(cè)序策略：經(jīng)典的逐步克隆法、全基因組鳥(niǎo)槍法 3）人類基因組概貌：GC含

12、量： 平均41% （33%65%）CpG島：即二核昔酸CG染色 體的重組率基因突變率：男性多見(jiàn)重組序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、衛(wèi)星DNA、Tn等單核音酸多態(tài) 性（SNP）含量基因數(shù)量：2、6萬(wàn)一3、9萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)數(shù) 量： 選擇性剪接較多，使得蛋白質(zhì)多而復(fù)雜疾病基因人基因組序列：99、 99%相同4）人類基因組多樣性：同一人種或不同人種基因組存在或多或少的差異。通常 DNA 分子中某一特定位點(diǎn)的變異頻率低于1% 為基因突變，高于1%為DNA 分子多肽。人類DNA 分子多肽性的產(chǎn)生有以下幾種主要方式：重復(fù)序列單元的拷貝數(shù)變異，如微衛(wèi)星DNA多態(tài)性 轉(zhuǎn)座因子導(dǎo)致的分子多肽，如 Alu

13、序列多態(tài)性單個(gè)核苷酸的變異即SNP42 .原核生物基因組一般特點(diǎn)：基因組相對(duì)較小，通常為 一條雙鏈DNA分子功能相關(guān)的基因高度集中，構(gòu)成操縱 子重復(fù)序列少，大多數(shù)的蛋白質(zhì)基因保持單拷貝形式， RNA基因常是多拷貝沒(méi)有內(nèi)含子，基因連續(xù)多順?lè)醋樱?構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位絕大部分DNA 都是用于編碼蛋白質(zhì)的，只有很少不編碼序列DNA 分子中有各種功能區(qū)43、質(zhì)粒是多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物細(xì)胞的染色體外的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子44 .遺傳特性：雙鏈環(huán)狀DNA 分子， 且為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（ cccDNA） 質(zhì)粒復(fù)制有賴于宿主細(xì)胞的復(fù)制，但其自身基因可控制合成的時(shí)限及拷貝數(shù)垂直傳遞不影響宿主細(xì)胞代謝，但可能賦予宿

14、主細(xì)胞新的表型治理的復(fù)制方式為半保留復(fù)制。單向/雙向，單向，雙向。45 .特性：質(zhì)粒的不相溶性：兩種不同質(zhì)粒如果利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，會(huì)在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過(guò)程中相互競(jìng)爭(zhēng)，因而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失的現(xiàn)象。這兩種質(zhì)粒屬于同一不相容群（InC） 。質(zhì)粒的穩(wěn)定性：質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定存在不被丟失稱為質(zhì)粒的穩(wěn)定性。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性。質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記。46 .質(zhì)粒的拷貝數(shù)：在正常生長(zhǎng)條件下，每個(gè)宿主細(xì)胞或每 條染色體所對(duì)應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。由其攜帶的復(fù)制子決定。復(fù)制子是一個(gè)復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)及其相關(guān)的調(diào)控元件。質(zhì)粒的復(fù)制由復(fù)制子與調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用來(lái)啟動(dòng)。47 .松弛

15、型質(zhì)粒：以RNA 為調(diào)節(jié)因子的質(zhì)粒的復(fù)制不需任何自身編碼的蛋白質(zhì)，完全由宿主細(xì)胞提供的壽命較長(zhǎng)的酶及其他蛋白質(zhì)因子來(lái)完成，這些質(zhì)粒的復(fù)制不受宿主細(xì)胞的控制，以所謂的“松弛”方式進(jìn)行。屬高拷貝質(zhì)粒。48 .嚴(yán)緊型質(zhì)粒：攜帶與蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子相互作用的復(fù)制子的質(zhì)粒。屬低拷貝質(zhì)粒。49 .轉(zhuǎn)座因子：又稱可轉(zhuǎn)座元件，指能在基因組中從一個(gè)位點(diǎn)移至另一位點(diǎn)的DNA 序列。1） 轉(zhuǎn)座現(xiàn)象或移位：指由可移動(dòng)因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座作用結(jié)果：a.導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組DNA的插入突- 9 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！變或基因重排，是毗鄰基因失活或表達(dá)水平下降。b.轉(zhuǎn)座因

16、子被認(rèn)為是基因組進(jìn)化的重要推動(dòng)力量，還可作為遺傳學(xué)研究及基因工程的工具。2） 原核生物轉(zhuǎn)座因子的種類：插入序列 （ IS） 、 轉(zhuǎn)座子 （ Tn） 、可轉(zhuǎn)移性噬菌體。 IS： a.IS 兩端有正向重復(fù)序列（ DR） 和反向重復(fù)序列（ IR） ；b.IR 結(jié)構(gòu)的對(duì)稱使IS 既可正向插入靶位點(diǎn)，也可反向插入靶位點(diǎn)；c.IS 的中間位編碼序列，僅編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的酶，含有依賴p 因子的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)及終止密碼，從而導(dǎo)致插入位點(diǎn)的基因失活或表達(dá)水平下降。 Tn ： 基因組中存在的能自主復(fù)制和位移的一些DNA 序列。特點(diǎn)：a.兩端有反向重復(fù)序列；b.轉(zhuǎn)座后靶位點(diǎn)重復(fù)序列是正 向重復(fù)序列；c.編碼與轉(zhuǎn)座有關(guān)的

17、蛋白；d.可以在基因組中移 動(dòng)。50.轉(zhuǎn)座類型：復(fù)制型轉(zhuǎn)座、非復(fù)制型轉(zhuǎn)座。復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子在轉(zhuǎn)座過(guò)程中能夠復(fù)制，結(jié)果是供體與受體都有一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶和解離酶。非復(fù)制型轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座因子不復(fù)制，直接從一個(gè)位點(diǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)，結(jié)果是供體失去一個(gè)轉(zhuǎn)座因子而受體得到一個(gè)轉(zhuǎn)座因子。需轉(zhuǎn)座酶。51.病毒基因組：1）特點(diǎn)：只有一種核酸，4種類型，為雙 鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA核酸大小差 別較大（1.3xi03bp3.6xi06bp）具有啟動(dòng)子和操縱子結(jié)- 10 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！構(gòu) 具有重疊結(jié)構(gòu)2）結(jié)構(gòu)：帽子和 poly （A

18、）尾結(jié)構(gòu)，對(duì) RNA 起保護(hù)作用，并于病毒感染性有關(guān)52 .分子克隆技術(shù)中，常用的工具酶有：限制性核酸內(nèi)切酶，DNA聚合酶I ,逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA連接酶，堿性磷酸酶，多核 苷酸激酶等。53 .限制性核酸內(nèi)切酶（REE命名：HindmH產(chǎn)生該酶的 宿主菌屬名-大寫(xiě)，斜體in代表宿主菌的種名縮寫(xiě)一小 寫(xiě)，斜體d代表宿主菌的株或型-正體III代表同一種菌 株中不同限制酶的編號(hào)（按發(fā)現(xiàn)先后順序）-羅馬數(shù)字。回 問(wèn)結(jié)構(gòu)：通常是雙鏈DN陰子中按對(duì)稱軸排列的反向互補(bǔ)序 列。星號(hào)活力：RE在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，能切割一些與其特異識(shí) 別順序類似的序列，酶的特異性降低，這種現(xiàn)象稱為星號(hào)活力，使用時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生星號(hào)活力。54

19、 .DNA聚合酶.（1） DNA聚合酶I 和Klenow片段（2） TaqDNA 聚合酶55 .Klenow 片段的主要用途：補(bǔ)齊雙鏈DNA 的 3端， 使 3端標(biāo)記； 在 cDNA 克隆中， 第二股鏈的合成； DNA 序列分析56 .逆轉(zhuǎn)錄酶：（多功能酶）功能：（ 1）依賴RNA 的 DNA 聚合酶活性，以 RNA 為模版， 4種 dNTP 為底物 （此過(guò)程稱為逆轉(zhuǎn)錄作用）， 催化合成DNA。 （ 2） 核酸酶 H 的水解作用（ 3）以 DNA 為模版的DNA 聚合酶作用- 13 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！57 .末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶（簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)

20、移酶）TdT 功能：在載體或目的基因3端上加上互補(bǔ)的多聚體尾，形成便于重組的人工黏性末端用于DNA 片段3端的同位素探針標(biāo)記58 .DNA 連接酶主要有兩者：大腸桿菌DNA 連接酶和T4 噬菌體 DNA 連接酶輔基分別為NAD+ （只能連接黏性末端）ATP （既能連接黏性末端， 又能連接平末端）重組 DNA 技術(shù)中常用T4 噬菌體DNA 連接酶 T4DNA 連接酶最初來(lái)自受T4 噬菌體侵染的大腸桿菌，但目前的分離純化手段已能快速而又簡(jiǎn)便的得到大量高度特異性酶。注意： DNA 分子磷酸二酯鍵的斷裂稱為切口（Nick） ，可以用 T4 DNA 連接酶來(lái)修復(fù)。DNA 分子中核酸缺失，稱缺口（ gap

21、） ，不能單獨(dú)用連接酶來(lái)修復(fù)。59 .堿性磷酸酶（1）細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）一由大腸桿菌分離 出來(lái)的（2）小牛腸堿性磷酸酶（CIP）一由牛腸道分離出來(lái)的（兩個(gè)催化去除DNA、 RNA 或 dNTP 上的5 -磷酸基團(tuán)）主要用途：.除去DNA段上的5,磷酸，以防自身連接。 . 在使用 T4 多核苷酸激酶和32P 同位素標(biāo)記前，除去RNA或DNAk 5,端的磷酸，以便進(jìn)一步用32P標(biāo)記的r-磷酸重新 磷酸化，使5'端段被32P標(biāo)記。60核酸酶Si的作用：.除去雙鏈DNA勺黏性末端以生產(chǎn)平 末端。.除去cDN始成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情

22、奉獻(xiàn)！.分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RN粉子的雜交情況等。載體主要有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。根據(jù)其用途分為克隆載體和表達(dá)載體61. 克隆載體常有兩種：質(zhì)粒載體和噬菌體載體1 ）質(zhì)粒載體復(fù)制特性：緊密型和松弛型（與宿主有關(guān)）作為克隆載體的質(zhì)粒具備特點(diǎn)：具有松弛型復(fù)制子；在復(fù)制子外存在幾個(gè)單一的酶切入點(diǎn)，以便目的DNA 插入；具有插入失活的篩選標(biāo)記，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗生素抗性標(biāo)記；分子量相對(duì)較小和較高的拷貝數(shù)。質(zhì)粒缺點(diǎn)：容量較小，一般只能接受小于15kb 的外來(lái) DNA。質(zhì)?？寺≥d體用途保存和擴(kuò)增 2kb目的DNA構(gòu)建cDNA 文庫(kù)目的DNA勺測(cè)序作為核酸雜

23、交時(shí)的探針來(lái)源。目前常用的質(zhì)粒有PBR322， PUC 系列，以及由后者衍生而來(lái)的 PSP 和 PGEM 系列等。PBR322系列載體特點(diǎn)：帶有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)具有二個(gè)抗生素抗性基因具有較小的分子量具有較高的拷貝數(shù) 2） PUC18、 PUC19 質(zhì)粒載體2）噬菌體載體：入噬菌體載體、 M13噬菌體噬菌體是指感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌性噬菌體和溶源性噬菌體1）入噬菌體包括插入型和置換型兩類，其主要用途：用 作一般的克隆載體；用于構(gòu)建一般的基因體或cDNA文湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！庫(kù)（小于22kb）;用于抗體庫(kù)或隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建；核 酸的序列分析。

24、3、表達(dá)載體和穿梭載體講的很少，了解它們的結(jié)構(gòu)便可 P39-41.62 .分子克隆的基本步驟:目的基因的制備載體的選擇和制備目的基因與載體的連接重組 DN礙入受體細(xì)胞 目的基因的篩選和鑒定63 . 目的基因的獲取制備方法：（ 1） 基因從文庫(kù)中獲取【基因文庫(kù)（G-文庫(kù)）：是指含有某種生物全部基因隨即片段的重組 DNAE：隆群。（C-文庫(kù)）：將細(xì)胞的全部mRNAS逆轉(zhuǎn)錄制備出 全套的cDNA隆群】（2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）人工合成DNA 片段（100bp） （4） PCR合成（5）直接從染色體DNA中分離 目的基因2）載體的選擇：入噬菌體和黏性質(zhì)粒載體常用來(lái)構(gòu)建基因 組文庫(kù)，pUC系列常用于構(gòu)

25、建cDNAC庫(kù)和克隆較小DNAt 段，M13噬菌體則用于克隆一些待測(cè)的 DNA列3） 目的基因和載體的連接：平末端連接和黏性末端連接（容易些）黏性末端DN吩子連接（目的基因或 DNA甫入片段與適當(dāng)?shù)妮d體存在同源粘性末端）： 用牛小腸堿性磷酸酶去除載體的5'磷酸抑制DNA的自身環(huán)化，使它只能與未經(jīng)堿性 磷酸酶處理的外源DNM段連接平末端連接法（質(zhì)粒與目的基因無(wú)相同的酶切位點(diǎn)）有湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！以下幾種方法T4DNA連接酶連接人工頭連接通過(guò)同聚尾連接4）將重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞（ 1）重組 DNA 分子導(dǎo)入原核細(xì)胞目的基因與載體在體外連接

26、成重組體后，需先導(dǎo)入受體細(xì)胞，常用的受體細(xì)胞是大腸桿菌。轉(zhuǎn)化方法：Cacl2 處理法電擊法轉(zhuǎn)化作用：將重組的DNA 分子引入細(xì)菌（原核細(xì)胞），使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)染：將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的DNA 重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程（ 2）重組DNA 分子導(dǎo)入真核細(xì)胞Cacl2 處理法電擊法聚聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法磷酸鈣-DNA共沉淀法二乙胺乙基-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體融合脂質(zhì)體法細(xì)胞核的顯微注射法5）重組體的篩選和鑒定（1 ）根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選：篩選出轉(zhuǎn)化菌， 篩選帶重組體的克隆，對(duì)DNA重組體進(jìn)行鑒別。根據(jù)載體的性狀變化進(jìn)行篩選根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇

27、3 -半乳糖普酶系統(tǒng)根據(jù)插入的外源性DNA 片段的性狀進(jìn)行篩選（ 2）根據(jù)重組DNA 的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行篩選重組子大小鑒別篩選限制性內(nèi)切酶圖譜進(jìn)行分析 PCR湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定核酸分子雜交方法進(jìn)行鑒定DNA 序列分析鑒定64 .插入失活效應(yīng)：選用含有兩個(gè)以上的抗藥基因的載體，外源 DNA 片段插入其中一個(gè)基因，并導(dǎo)致這個(gè)基因的失活，就可用兩個(gè)含不同藥物的平板，互相對(duì)照，篩選含重組DNA的菌落65 .核酸分子雜交基本原理：利用核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程。(可發(fā)生

28、在同源或異源的DNA 鏈與 DNA 鏈之間，也可在RNA 鏈與 DNA 鏈)66 .核酸變性(denaturation ) ：指維系核酸雙鏈互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鏈斷裂變成單鏈的過(guò)程，并不涉及共價(jià)鍵的斷裂。(黏度減小， 浮力密度增大，260nm 處紫外吸收增加，活性降低)(熱變形，酸堿變性，化學(xué)變性)67 .Tm( melting temperature ) ：通常把熱變性過(guò)程中DNA變性一半所需要的溫度成為融解溫度。DNA 的 Tm 值在8295c之間 Tm影響因素：DNA的均一性堿基組成溶液的離子強(qiáng)度pH 變性劑68 .DNA 復(fù)性 ( renaturation ) ： 當(dāng)變性條件緩慢去除后，

29、兩條彼此分開(kāi)的互補(bǔ)單鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。( 許多理化性質(zhì)恢復(fù)，但熱變性后驟然冷卻，DNA 則不可復(fù)性)退火(annealing):熱變性后，將溫度緩慢降低而使 DNA 逐漸冷卻即可復(fù)性的過(guò)程。湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！復(fù)性過(guò)程分兩步：成核作用( nucleation)和拉鏈作用( zippering )成核作用：兩條核酸單鏈隨機(jī)碰撞形成暫時(shí)局部雙鏈，如果局部雙鏈周?chē)鷫A基不能配對(duì)，則迅速解離，重新碰撞直到找到正確的互補(bǔ)序列，這個(gè)過(guò)程稱為成核作用。拉鏈作用：在成核的基礎(chǔ)上，兩條單鏈的其余部分堿基迅速互補(bǔ)配對(duì)，就像拉鏈那樣形成完整的雙鏈分子。復(fù)性速度

30、用Cot 1/2衡量，Co:單鏈DNA的起始濃度(mol/L), t為時(shí)間(s), Coti/2表示單鏈DNA的起始濃度與復(fù)性一半所需時(shí)間之積，與復(fù)性速度成反比，與DNA 復(fù)雜度有關(guān)影響因素：DNA 的分子大小和復(fù)雜度，離子強(qiáng)度，DNA 的濃度，溫度69 .探針(probe) ：廣義上指的是能特異性與特定靶分子發(fā)生相互作用，并能被某些方法所檢測(cè)的分子。70 理想探針的特點(diǎn)：高度特異性易于標(biāo)記和檢測(cè)靈敏度高穩(wěn)定且制備方便71 核酸探針：指能與特定靶基因序列發(fā)生特異性互補(bǔ)結(jié)合，并可用特殊方法檢測(cè)的被標(biāo)記的已知核酸序列72 .核酸探針的種類：基因組DNA 探針、 cDNA 探針、 RNA探針、寡核苷

31、酸探針1)基因組DNA探針：制備方法：a.分子克隆b.采用聚合 酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增特定的基因組 DNA片段優(yōu)點(diǎn)：制備方法簡(jiǎn) 便、省時(shí)、易得，穩(wěn)定不易降解，標(biāo)記方法多樣也較成熟73 cDNA 探針： cDNA( complementary DNA ) ： 指與 mRNA- 20 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！互補(bǔ)的 DNA 分子，它是以mRNA 為模板，遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成 優(yōu)點(diǎn)：具有基因組DNA優(yōu)點(diǎn)，且不存在內(nèi)含子和其他高度重復(fù)序列，尤其適用于基因表達(dá)研究（但制備困難）74 RNA 探針：雜交效率高，雜交分子穩(wěn)定，不存在高度重復(fù)序列，非特異性

32、雜交較少，不易標(biāo)記，易降解4）寡核音酸探針：特點(diǎn)：a根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要合成b.長(zhǎng)度一般 為2050nt c.可以識(shí)別靶分子的單個(gè)堿基變化 d.特異性不 高，雜交信號(hào)不強(qiáng) 設(shè)計(jì)原則：a.探針長(zhǎng)度一般2050nt b. 剪輯成分，Gtc含量在40%60%為宜c.不應(yīng)存在大于4bp 的互補(bǔ)序列d.避免同一堿基重復(fù)出現(xiàn)多于 4次e.同源性不 應(yīng)超過(guò) 70% 或有連續(xù)8 個(gè)上堿基同源73 核酸探針的標(biāo)記，兩大類（1）放射性核素：最常用，靈敏度和特異性極高，但半衰期短，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，污染環(huán)境 （ 2）非放射性核素：穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)時(shí)間短，但靈敏度74 .理想探針標(biāo)記物特點(diǎn)：高靈敏度標(biāo)記物與探針結(jié)合后， 不影

33、響堿基對(duì)的特異性，雜交體的穩(wěn)定性及其Tm 值。檢測(cè)方法應(yīng)高靈敏度、特異、 假陽(yáng)性率低標(biāo)記物與探針結(jié)合后穩(wěn)定，保存時(shí)間長(zhǎng) 標(biāo)記物對(duì)環(huán)境無(wú)污染、對(duì)人體無(wú)損傷、價(jià)格低廉。75 放射性核素的標(biāo)記物類型常用32P35S 3H125I131I 其類型特點(diǎn)：32P:比放射活性3.4X 1014Bq/mmol.最常用。放射性強(qiáng)，釋- 22 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！放的6粒子能量高，穿透能力強(qiáng)，靈敏度高，半衰期僅14.4d,射線散射嚴(yán)重而影像分辨率，影響結(jié)果分析。35S:比放射活性5.55 x 1013Bq/mmol.釋放的3粒子較 32P稍低，半衰期 87.1d,靈

34、敏度比32P低，散射作用弱，分辨率較高，適用于原 位雜交。3H:比放射活性1.07 xi012Bq/mmol,釋放的3粒子 能量較低，半衰期12.1 年，采用延長(zhǎng)曝光時(shí)間的方法可產(chǎn)生本底低， 分辨率高的結(jié)果，金庸與細(xì)胞原位雜交，可反復(fù)使用，對(duì)環(huán)境影響大。125I、131I :釋放6粒子和丫射線，具有較高敏感性， 較強(qiáng)分辨率，危害性大。76放射性核素的標(biāo)記標(biāo)記法：采用體外標(biāo)記法，包括化學(xué)法和酶法1）化學(xué)法：利用標(biāo)記物分子和探針?lè)肿由匣钚曰鶊F(tuán)間的化 學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物結(jié)合到探針?lè)肿拥臉?biāo)記方法。2）酶法：預(yù)先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸分子上，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)將標(biāo)記號(hào)的核苷酸分子或標(biāo)記基因摻入或交換到探針?lè)肿又械?/p>

35、方法，有切口平移法，隨機(jī)引物法，末端標(biāo)記法，PCR標(biāo)記法，體外轉(zhuǎn)錄法（ 1）切口平移法：DNaseI Mg2+ 隨機(jī)切割3 OH 加 dNTP（被標(biāo)記）E.coliDNA聚合酶I全酶切除5'端的核昔酸 合成互補(bǔ)單鏈，適用于任何形式的雙鏈DNA 但不適合單鏈DNA 和 RNA（ 2）隨機(jī)引物法：隨機(jī)引物是人工合成的由6個(gè)核苷酸殘基構(gòu)成的寡核苷酸片斷的混合物。模版DNA 變性，加入隨機(jī)引物在 Klenow酶催化加入d NTPs（一種被標(biāo) 記 ），變性形成標(biāo)記探針，適合單雙鏈DNA 和 RNA 探針標(biāo)湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！記3）末端標(biāo)記法：3

36、9;端標(biāo)記法：模版 DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶形成5端突出的DNA， klenow 酶 +d NTPs 變性得到3端標(biāo)記 DNA， 經(jīng)變性成3端標(biāo)記單鏈DNA 探針 5端標(biāo)記法；T4噬菌體多核昔酸激酶（PNK）標(biāo)記法、堿性磷性磷酸酶（ ALP ）切除 5端的磷酸基團(tuán)PNK 作用轉(zhuǎn)移77 .非放射性核素標(biāo)記：生物素、地高辛、光敏生物素、熒光素、酶標(biāo)法ALP 和辣根過(guò)氧化酶（HRP） 核酸探針的純化：乙醇沉淀法凝膠過(guò)濾色譜法核酸探針 的檢測(cè)：（1）放射性：放射自顯影 液體閃爍計(jì)數(shù)法（2） 非放射性：偶聯(lián)反應(yīng)、顯色反應(yīng)（酶促顯色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法）78 .核酸分子雜交的類型：固相雜交和液相雜交兩大類1

37、） 液相雜交：將待測(cè)核酸樣品和核酸探針同時(shí)放入雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，然后分離雜交分子和過(guò)量的未雜交探針，再對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)固相雜交：預(yù)先將待測(cè)的靶核酸鏈固定在固相支持物上，然后與溶解于雜交液中的核酸探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去支持物上未參加反應(yīng)的游離核酸探針，再檢測(cè)雜交信號(hào)，分析結(jié)果。2）常用固相雜交：Southern 印跡雜交Northern 印跡雜交、菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、原位雜交 Southern 印跡雜交:指經(jīng)凝膠電泳分離的待測(cè)DNA 片斷轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定固相支持物（尼龍膜或硝酸纖維素膜），然后用標(biāo)記的探針DNA 分子檢測(cè)靶DNA 的一種方法。湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分

38、隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！基本過(guò)程：限制性核酸內(nèi)切酶消化待測(cè)DNA一瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片斷-DNA變性并轉(zhuǎn)印到固相支持物上- 預(yù)雜交一與特異DNA探針雜交-雜交信號(hào)檢測(cè)及結(jié)果分析 （轉(zhuǎn)膜方法有毛細(xì)管轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移、真空轉(zhuǎn)移）Northern印記雜交：指待測(cè) RNA （主要是mRNA）從 凝膠轉(zhuǎn)印到固相支持物上，與標(biāo)化的DNA 探針進(jìn)行雜交的印跡技術(shù)。與Southern 印跡雜交不同點(diǎn)：a . RNA 易被環(huán)境中存在的RNA 酶降解，應(yīng)避免RNA 酶污染b. RNA 需要在變性劑（甲醛、乙二醛、甲基氫氧化汞）存在下進(jìn)行電泳，保持其單鏈狀態(tài)，防止RNA 分子形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不能用堿變性 c.

39、印跡前將含有變性劑的凝膠用水浸泡除去。79 . 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction,PCR ）技術(shù)是指生物技術(shù)領(lǐng)域中最重要的四項(xiàng)技術(shù)之一（細(xì)胞融合技術(shù)，分子克隆技術(shù)，蛋白工程技術(shù)，基因擴(kuò)增技術(shù)）特異，敏感，高效，簡(jiǎn)便，重復(fù)性，移易化等優(yōu)點(diǎn)。80 .PCR 的原理： 模擬體內(nèi)DNA 半保留復(fù)制過(guò)程，通過(guò)變性，退火，延伸，三步反應(yīng)的循環(huán)完成，靶基因的雙鏈DNA 通過(guò)變性解鏈為單鏈，特異的引物通過(guò)退火與單鏈DNA 模版結(jié)合，在靶DNA 的指導(dǎo)下引物的3端延伸靶DNA 的互補(bǔ)鏈完成一個(gè)循環(huán)，理論上每次循環(huán)結(jié)束后靶DNA 擴(kuò)增一倍，即靶 DNA 數(shù)目以 2? 幾何級(jí)數(shù)方法。

40、（1）反應(yīng)體系：模版 DNA,四種dNTP,引物，TaqDNA聚合酶、緩沖液（含Mg2+）湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！（ 2）變性（denaturation ） :模版 DNA 經(jīng)加熱至95左右一定時(shí)間后，使模版DNA 雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈。退火（annealling） :將下降至適宜溫度（一般較Tm 低5）引物與變性的DNA 單鏈在堿基互補(bǔ)的基礎(chǔ)上形成引物，模版雜交雙鏈。延伸（exension） :將溫度上升至在70左右時(shí)，TapDNA 聚合酶催化以引物為起點(diǎn)的從5 3 端 DNA鏈延伸反應(yīng)，隨著4 種 dNTP 的

41、摻入，合成新的DNA互補(bǔ)鏈。（ 3） 動(dòng)力學(xué)： y=A（1+R） ?估算 PCR 產(chǎn)量， A 為起始模板量，R 為擴(kuò)增效率，有平臺(tái)期81 常見(jiàn)問(wèn)題原因分析和處理（1）假陽(yáng)性。靶DNA 和非靶DNA的污染（2）假陰性標(biāo)本處理的原因PCR試劑問(wèn)題 PCR 擴(kuò)增儀故障或擴(kuò)增過(guò)程中的其他PCR 產(chǎn)物鑒定的問(wèn)題（3）引物二聚體兩引物分子間有較多的堿基配對(duì)， 特別是引物3'端有互補(bǔ)區(qū)引物模版比例太高，可增加模版 用量退火溫度過(guò)低循環(huán)次數(shù)過(guò)多（4）非特異性PCR產(chǎn) 物（5） PCR 污染與預(yù)防（6） RNA 酶的污染與預(yù)防去除外源RNase污染抑制內(nèi)源性RNase的活性82 .擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與分析（

42、1）凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。（ 2） PCR 產(chǎn)物的酶切技術(shù)：PCR 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP ） （ 3） PCR 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析PCR-SSCP（ 4） 核酸探針雜交分析點(diǎn)雜交反湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！向點(diǎn)雜交微孔板雜交RNA 探針雜交酶免疫分析Southern印跡雜交（5） PCR-酶聯(lián)免疫吸附法（6） PCR產(chǎn) 物測(cè)序（雙脫氧核苷酸鏈末端終止法、化學(xué)裂解法）83 .PCR衍生技術(shù)：巢式 PCR,逆轉(zhuǎn)錄PCR,多重PCR,錨 定PCR,反向PCR,免疫PCR,原位PCR,定量（QPCR） 巢式PCR是一

43、種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,使用兩對(duì)（而 非一對(duì)）PCR 引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)PCR 引物擴(kuò)增片段和普通PCR 相似。 第二對(duì)引物稱為巢式引物（因?yàn)樗麄冊(cè)诘谝淮蜳CR 擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR 擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR 的擴(kuò)增非常特異。84 .熒光定量PCR 技術(shù)： 1）基本原理：基于熒光能量傳遞技術(shù)， 通過(guò)對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物熒光信號(hào)的檢測(cè)，對(duì)起始模版進(jìn)行定量分析。85 .實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ real ti

44、me FQ-PCR ） ： 在熒光定量PCR反應(yīng)中，引物的熒光化學(xué)物質(zhì)，在每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)后，產(chǎn)生 一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，利用熒光信號(hào)累積及熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)PCR 過(guò)程實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)。熒光閾值: 設(shè)定在熒光擴(kuò)增曲線上處于熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段是的任意一個(gè)值，一般熒光閾值設(shè)置在3-15 個(gè)循環(huán)內(nèi)- 28 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！Ct 值： 每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系86 .熒光定量PCR 技術(shù)： 熒光染料法（常用染料：SYBBGreenI）和熒光探針?lè)ㄌ结樂(lè)ǎ?TaqMan 技術(shù)， LightCy

45、cler 探針技術(shù)，分子信標(biāo)技術(shù)，復(fù)合探針?lè)?TaqMan 技術(shù) :3 端的熒光Q 分子吸收5端熒光 R 分子的熒光信號(hào)/探針5端連接的熒光R 分子被 Taq 酶切割下來(lái) /熒光R 分子發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR 數(shù)量成比例 LightCycler 探針技術(shù)：有R 發(fā)光探針和Q 淬滅探針熒光淬滅的程度與起始模版數(shù)的量成正比分子信標(biāo)技術(shù)：分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導(dǎo)致熒光淬滅/單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補(bǔ)而與之雜交/探針5端和3端分離，淬滅劑對(duì)熒光劑的淬滅作用消失，產(chǎn)生熒光復(fù)合探針?lè)ǎ河蠷發(fā)光探針和Q淬滅探針 當(dāng)PCR擴(kuò)增溶液無(wú)模版時(shí)，兩探針特異性結(jié)

46、合，無(wú)熒光；有模版，熒光探針與模版結(jié)合，兩探針?lè)蛛x，有熒光87 .實(shí)驗(yàn)區(qū)分為四個(gè)獨(dú)立的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，標(biāo)本制備區(qū)，擴(kuò)增區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個(gè)基本原則：1.四個(gè)區(qū)域必須是相互獨(dú)立的，2.各區(qū)的儀器設(shè)備及物品必須是專用的，3.各區(qū)不能直通，應(yīng)設(shè)有緩沖間，4.產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)安裝排風(fēng)扇或其他抽風(fēng)裝置十六字口訣：各區(qū)獨(dú)立，注意風(fēng)向，因地制宜，方便工作。還應(yīng)設(shè)立臨床標(biāo)本接收區(qū)88 .室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC ）包括測(cè)定前的質(zhì)量控制，統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制，質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)等89 DNA 序列測(cè)定：即DNA 一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，指用人工的方法測(cè)定并分析核酸的堿基組成及排列順序。它是研究基因結(jié)構(gòu)， 功能及其關(guān)系的前提

47、，是臨床疾病的分子診斷最為精確的判定依據(jù)四 種 常 用 方 法 ： Sanger 雙 脫 氧 鏈 末 端 終 止 法 ， Manxam-Glibert 化學(xué)降解法，焦磷酸測(cè)序技術(shù)，雜交測(cè)序法（1） Sanger雙脫氧鏈末端終止法原理：利用 DNA聚合酶， 以單或雙鏈DNA為模版以d NTPs （一種被標(biāo)記）為底 物，在四組互相獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP ）作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對(duì)原則，在測(cè)序引物引導(dǎo)下，合成四組有序列梯度的互補(bǔ) DNA 鏈，然后通過(guò)高分辨率的變性聚丙稀酰胺凝 膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后識(shí)度待測(cè)DNA 的互補(bǔ)序列（ 2） Manxa

48、m-Glibert 化學(xué)降解法原理：首先對(duì)待測(cè)單或雙鏈 DNA 作末端 （ 5端或 3端） 放射性標(biāo)記，標(biāo)記后的DNA分四組， 分別用不同的化學(xué)試劑對(duì)不同的堿基進(jìn)行特異性- 31 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！的化學(xué)切割，通過(guò)控制化學(xué)反應(yīng)條件，使堿基斷裂只隨機(jī)發(fā)生在某一個(gè)特定的位點(diǎn)，由此各組均產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA 片段，通過(guò)（同上）90.自動(dòng)化測(cè)序與傳統(tǒng)方法比較1 標(biāo) 化 物 不 同 ：熒 光 染 料 （ 自 動(dòng) ）放射性核素（傳統(tǒng)）2 監(jiān)測(cè)手段不同：掃描儀 /PCR 循環(huán)測(cè)序反應(yīng)方法/集束話的毛細(xì)管電泳放射自顯影/酶反應(yīng)方法/凝膠電泳特點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快速，結(jié)

49、果準(zhǔn)確可靠，安全無(wú)污染，測(cè)序能力增強(qiáng)91、生物芯片技術(shù)：指通過(guò)微加工和微電子技術(shù)，在固相基質(zhì)表面集成了成千上萬(wàn)密集排列的分子微陣列，以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織、細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)及其他生物分子進(jìn)行高效、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)（微陣列芯片、微流體芯片）常用：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片、液相芯片、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室等。92 、 基因芯片 （ Gene Chip） ： 又稱 DNA 芯片， DNA 微陣列；將大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在載體上制成點(diǎn)陣，稱之為芯片。其原理：經(jīng)過(guò)標(biāo)記的待測(cè)樣品DNA 通過(guò)與芯片上特定位置的探針按堿基配對(duì)原理雜交后，經(jīng)激光聚集熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度來(lái)獲

50、取樣品分子的數(shù)量和序列信息，用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)比較和分析，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量- 33 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！研究。主要包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié)：芯片微陣列制備、樣品制備及標(biāo)記、樣品與基因芯片的雜交、信號(hào)的檢測(cè)及 分析。93、蛋白質(zhì)芯片：指固定于支持節(jié)制上的多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的陣列。據(jù)用途分：蛋白質(zhì)功能芯片、蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片。據(jù)載體分：蛋白質(zhì)微陣列、微孔板蛋白芯片、三位凝膠塊芯片。還可分：抗體芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、適配體芯片。94、組織芯片：也稱組織微陣列（TMA ） ，將成百上千個(gè)不同組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列固定在一

51、張載玻片上所成的微陣列。95、 液相芯片：又稱懸浮陣列，流式熒光技術(shù)，是基于 XMAP技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái)。其核心技術(shù)是把微小的聚苯乙烯微球用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，然后將每種顏色的熒光編碼微球共價(jià)交聯(lián)上針對(duì)特定檢測(cè)物的寡核苷酸或蛋白質(zhì)探針。優(yōu)點(diǎn)：僅需少量樣本即可同時(shí)定性、定量檢測(cè)同一樣本中 的多種不同目的分子一一最突出優(yōu)點(diǎn)高通量、高效率靈 敏度高線性范圍寬重復(fù)性好操作簡(jiǎn)單靈活性好96、縮微芯片實(shí)驗(yàn)室：又稱微型生物全分析系統(tǒng)（ TAS）把生物和化學(xué)等領(lǐng)域所（波or 譜：不認(rèn)識(shí)）及的樣品制備，生物化學(xué)反應(yīng)和檢測(cè)分析的整個(gè)過(guò)程集成化，并縮微到一張芯片上自動(dòng)完成，形成所謂的微型全分析系統(tǒng)。97

52、、分子診斷法：（目的物：病原微生物的DNA 或 RNA）對(duì)病原體特異性核酸序列的雜交，對(duì)病原體基因序列的限制性內(nèi)切酶酶譜分析，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性連鎖分析，對(duì)病原體基因保守序列的擴(kuò)增檢測(cè)基因芯片技術(shù)，支鏈DNA 技術(shù)依賴核酸序列的擴(kuò)增，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。乙型肝炎病毒：PCR 臨床意義：HBV 感染的早期診斷，監(jiān)測(cè)治療效果，判斷病情，指導(dǎo)制訂合理的治療方案。結(jié)核分枝桿菌TB ： TB DNA 檢測(cè)可采用PCR， FQ PCR，競(jìng)爭(zhēng)性PCR,免疫雜交PCR等，PCRSSCP血紅蛋白病兩類：由于珠蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化所導(dǎo)致的異 常血紅蛋白??；由于珠蛋白多肽鏈的組成比例改 變和珠蛋白含量降低所導(dǎo)致的地中

53、海貧血鐮狀細(xì)胞貧血：0珠蛋白基因中第六位密碼子的序列由原來(lái)的 GAC 改變?yōu)?GTG ，使對(duì)應(yīng)的氨基酸由原來(lái)的谷氨酸一繳氨酸用RE酶切法診斷地中海貧血：分為a地貧，3地貧，Y地貧，s地貧，S3 地貧，丫 3地貧等（一）核酸的分離純化與鑒定：1、 核酸分離制備總原則：保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性盡量排除其他的污染，保證核酸的純度核酸提純的主要步驟細(xì)胞裂解抽提分離核酸純化核酸鑒定- 37 -湖北中醫(yī)藥大學(xué)09 衛(wèi)檢“考試突擊小分隊(duì)”2012 歲末傾情奉獻(xiàn)！2、完整性鑒定：可采用凝膠電泳法，DNA 看是否拖尾，RNA 為 2:1 的關(guān)系3、核酸的保存：雙蒸水及 TE緩沖液儲(chǔ)存DNA,醋酸鈉溶液或三蒸水、RNA 酶儲(chǔ)存 RNA4、抑制劑：抑制DNase: A、檸檬酸、EDTA等金屬螯合劑B、 加去污劑SDS C、 加蛋白變性劑抑制RNase：A、高溫高壓滅菌或用 DEPC處理 B、加強(qiáng)的蛋白變性劑 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白真核細(xì)胞的破碎方法有超聲波破碎法、勻漿法、液氮破碎法、低滲等物理法和蛋白酶K 和去污劑溫和處理法DNA 分離純化的方法：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法5、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)：（1）核酸的釋放 目的：裂解細(xì)胞、 釋放核酸物理方法：物理干燥法、凍融法、滲透壓 調(diào)節(jié)法化學(xué)法：酶解法（2）核酸分離純化：除去非核酸類大分子污染物不需要的核酸溶劑等（ 3）核酸