1、AKTA pure操作說明分子篩層析操作步驟：1. 開機(jī)：翻開AKTA pure開關(guān),看指示燈,泵同步泵內(nèi)有注入液體的聲音.2. 翻開系統(tǒng)：翻開電腦：雙擊 Unicorn 7.0翻開系統(tǒng),進(jìn)入log on界面,用戶名默認(rèn)為Default,輸入密碼：default,點(diǎn)ok鍵,出現(xiàn)提示對話框,繼續(xù)點(diǎn)確定,進(jìn)入系統(tǒng).注意：進(jìn)入系 統(tǒng)時(shí)會彈出 三個(gè)界面：System Control界面, Evaluation界面和 Administration界面.其中system Control界面為主操作窗口,所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在 該界面下完成： Manual-Execute Manual instruction

2、s-; Evaluation 界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口 ；Administration界面為Unicorn 7.0系統(tǒng)設(shè)置界面.3. 洗泵：把A1泵頭從20%乙醇中取出,用去離子水沖洗,放入分子篩緩沖液中,在 SystemControl 界面下,點(diǎn)擊 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash- 點(diǎn) 開 inlet,選擇 A1-Excuse.4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓 -Execute ;設(shè)流速： Pumps-System flow -設(shè)置

3、 system flow 1mL/min -Execute o注意：流速和柱壓設(shè)置參照“ GE蛋白純化柱表,不要超出最高限制.5. 裝柱子先上后下：接柱子的上面：擰下連接進(jìn)樣閥和檢測器之間的線,等進(jìn)樣閥出口有液體流出時(shí),擰開 柱上面線頭的螺帽,將它連到進(jìn)樣閥出口；接柱子的下面：去掉柱下端連接的注射器,連上接頭,連上一段線,待液體滴出滴出液 體滴到檢測器上的連接口的洞里,滴滿,將接頭連到檢測器的連接口里.6. 平衡柱子：分子篩buffer平衡柱子,一般要兩個(gè)小時(shí)左右,鹽離子濃度到達(dá)5.5%左右.7. 設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先 end-Manual instructions,點(diǎn)擊 brows

4、e,彈出 select result name&location 界 面,點(diǎn)開文件夾"defaultHome ",找到文件夾"labdata",點(diǎn)開,選擇自己名字 首字母縮寫文件夾已創(chuàng)立,在界面下方"name指令框進(jìn)行命名. 注意：命名時(shí)要標(biāo)明 日期,柱子型號,樣品名稱.設(shè)流速： Pumps-System flow-設(shè)流速1 mL/min -Execute ;設(shè)柱壓： Alams- alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓-點(diǎn)擊 Execute;洗 A 泵：Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 in

5、let,選擇 A1-Excuse ;紫外調(diào)零：Monitors-Auto zero UV-Execute ;設(shè)置收集體積:Fracton collection-peak fractionation-fraction size-設(shè)置收集體積-Execute;一般設(shè)為1 mL可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整.設(shè)置收集水平: Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 設(shè)置起女臺 收集水平-Execute.注意：對于初次純化的蛋白,由于蛋白含量未知,起始水平可設(shè)低些, 如10 mAU,預(yù)防損失蛋白.8. 上樣：沖洗Loop環(huán)：取5mL

6、注射器,吸取5 mL分子篩不能有氣泡,從進(jìn)樣口注射 2倍 Loop體積的分子篩來清洗Loop環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品 2 mL, 12000 rpm離心3 min,把上清轉(zhuǎn)移至新的離 心管管,重復(fù)一次,以去除沉淀,預(yù)防堵塞系統(tǒng)；手動蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi),從進(jìn)樣口把樣品注射入 Loop環(huán)內(nèi)； 注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作,首先彈出注射器內(nèi)的氣泡,隨后稍推注射器,使注射器出口處懸掛一樣品液滴別太用力,導(dǎo)致液滴滴落,然后把注射器插入進(jìn)樣口,把蛋白樣品推入Loop環(huán)中.Inject:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng)-inject-E

7、xecute- 走 2 倍 Loop 體積的分子篩緩沖液；Load:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve- 點(diǎn)開 position 選項(xiàng)-manual load-Execute , 調(diào)回 Load狀態(tài).9. 收集目標(biāo)蛋白：參照標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線,估計(jì)樣品出峰位置,收集蛋白樣品,做好標(biāo)記,過完后,peak fracstop 900停止收集.10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出來,離子濃度平衡后,點(diǎn)擊pause,進(jìn)分子篩的buffer的泵頭用去離子水洗,放入20%的乙醇中,continue-洗泵A1泵,平衡柱子.20%的乙醇平衡柱子, 一般要兩小時(shí)左右,鹽離子濃度到達(dá)0%.11.

8、 收柱子先下后上：調(diào)節(jié)流速至0.5 mL/min,擰下柱下面的接頭,連上注射器,再調(diào)流速至1 mL/min ,注射器內(nèi)吸入3-5 mL 20%乙醇,取下柱上面的接頭看是不是往外流液體,由于注射器內(nèi) 有壓力,液體會倒流,蓋子內(nèi)滴滿液體,立即擰上蓋子,預(yù)防進(jìn)氣泡,將進(jìn)樣閥的線接 到檢測器上.12. 關(guān)閉系統(tǒng)：點(diǎn)擊End關(guān)閉系統(tǒng)界面,關(guān)閉 AKTA pure電源,關(guān)電腦.AKTA pure操作說明離子交換蛋白純化步驟RESOURCE Q/S 1. 開機(jī)：翻開AKTA pure開關(guān),看指示燈,泵同步泵內(nèi)有注入液體的聲音.2. 翻開系統(tǒng)：翻開電腦：雙擊 Unicorn 7.0翻開系統(tǒng),進(jìn)入log on界

9、面,用戶名默認(rèn)為 Default,輸入密 碼：default,點(diǎn)ok鍵,出現(xiàn)提示對話框,繼續(xù)點(diǎn)確定,進(jìn)入系統(tǒng).注意：進(jìn)入系統(tǒng)時(shí)會彈出三個(gè)界面：System Control界面,Evaluation界面和Administration界面.其中system Control界面為主操作窗口,所有的設(shè)置選項(xiàng)都是在該界面下完成： Manual-Execute Manual instructions- ; Evaluation 界面為結(jié)果數(shù)據(jù)查看及處理窗口； Administration界面為 Unicorn 7.0系統(tǒng)設(shè)置界面.3. 洗泵：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)-去離子水沖洗 A1,B1進(jìn)液泵頭-分別放

10、入A , B液中；洗 B 泵： 選擇 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 inlet,選擇 B1-Excuse ;洗 A 泵： 選擇 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-點(diǎn)開 inlet,選擇 A1-Excuse,洗泵結(jié)束后調(diào) B 至 100%, 0min-Execute.4. 設(shè)置系統(tǒng)參數(shù)：設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam-設(shè)

11、置最高柱壓 -Execute o 設(shè)流速： Pumps-System flow-設(shè)置 system flow 1 mL/min -execute; 注意：流速和柱壓設(shè)置參照“ GE蛋白純化柱表,不要超出最高限制.5. 安裝RESOURCE柱先上后下：裝離子柱時(shí)先擰開離子柱上面, 連上來自進(jìn)樣閥的線, 邊擰緊上面邊擰松柱下面, 在離 子柱子下端出口連上轉(zhuǎn)接頭, 接上一根較短的先并連到檢測器上 流出液體,滴滿檢測 器上的連接口的洞里,再擰緊.6. 平衡 RESOURCE 柱：等 B 液平衡后,點(diǎn)擊 Pumps-gradient-Target-調(diào) B 至 0%, 0min-Execute.等平衡后,

12、 記錄最高和最低鹽離子濃度：離子交換 B液鹽離子濃度約為 84%,離子交換 A液鹽離 子濃度約為1.7% o7. 設(shè)置系統(tǒng)及收集參數(shù)：命 名：先 end-Manual instructions,點(diǎn)擊 browse,彈出 select result name&location 界面, 點(diǎn)開文件夾"defaultHome ",找到文件夾"labdata",點(diǎn)開,選擇自己名字首字 母縮寫文件夾已創(chuàng)立,在界面下方"name指令框進(jìn)行命名. 注意：命名時(shí)要標(biāo)明 日期,柱子型號,樣品名稱.設(shè)流速： Pumps-System flow-設(shè)流速1 mL

13、/min -Execute;設(shè)柱壓： Alams-alam systerm pressure-high alam- 設(shè)置柱壓 -,點(diǎn)擊 Execute;紫外調(diào)零：Monitors-Auto zero UV-Execute ;設(shè)置收集體積：Fracton collection-peak fractionation-fraction size-設(shè)置收集體積 -Execute；一般設(shè)為1 mL 可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整.設(shè)置收集水平:Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 設(shè)置起女臺收集水平-Execute.注意：對于初次

14、純化的蛋白,由于蛋白含量未知,起始水平可設(shè)低些, 如10 mAU ,預(yù)防損失蛋白.8. 上樣：沖洗Loop環(huán)：取5 mL注射器,吸取5 mL分子篩不能有氣泡,從進(jìn)樣口注射 2倍 Loop體積的分子篩來清洗Loop環(huán)；蛋白樣品處理：取出蛋白樣品 2 mL, 12000 rpm離心3 min,把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管管,重復(fù)一次,以去除沉淀,預(yù)防堵塞系統(tǒng)；手動蛋白上樣：把蛋白樣品轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi),從進(jìn)樣口把樣品注射入Loop環(huán)內(nèi)；注意：上樣時(shí)應(yīng)小心操作,首先彈出注射器內(nèi)的氣泡,隨后稍推注射器,使注射器出口處懸掛一樣品液滴別太用力,導(dǎo)致液滴滴落,然后把注射器插入進(jìn)樣口,把蛋白樣品推入Loop環(huán)中.Inj

15、ect:點(diǎn)擊 Flow path-injection valve-點(diǎn)開 position 選項(xiàng)-injectexecute-走 2 倍Loop體積的分子篩緩沖液；Load:等流穿峰出來后,點(diǎn)擊Flow path-injection valve-,點(diǎn)開 position 選項(xiàng)-manualload-Execute,調(diào)回 Load 狀態(tài).注意：流穿峰蛋白先別丟棄,它有可能是樣品沒有掛上柱子而直接流出來的目標(biāo)蛋白.9. 洗脫目的蛋白：Pumps-Gradient target 50% , length 50 min 可調(diào)-Execute ,自離子柱上洗脫結(jié)合的 蛋白10. 收集目標(biāo)蛋白：收集洗脫下來的蛋白樣品,做好標(biāo)記,過完后,peak fracstop 900停止收集.11. B液平衡離子柱：Pumps-Gradient target 50% , length 0 min- Execute ,至鹽離子濃度到達(dá)最高且平衡.如繼續(xù)純化其他蛋白樣品：要用A液再平衡后再上樣,步驟同上1-11.如不再純化其他蛋白樣品：點(diǎn)擊pause暫停系統(tǒng)-