1、普通PCR原位PCR反向PCR與反轉(zhuǎn)錄PCR得基本原理與操作步驟普通PCR1概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）簡(jiǎn)稱(chēng)PCF就是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于放大特定得DNA片段?？汕谱魃矬w外得特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價(jià)值及實(shí)用性得Klenow fragment of E、Coli則就是于70年代得初期由Dr、H、Klenow所發(fā)現(xiàn),但由于此酶不 耐高溫，高溫能使之變性，因此不符合使用高溫變性得聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)今所使 用得酶（簡(jiǎn)稱(chēng)Taq Polymerase）,則就是于1976年從溫泉中得

2、細(xì)菌（Thermus aquaticus）分離出來(lái)得。它得特性就在于能耐高溫，就是一個(gè)很理想得酶，但它被廣 泛運(yùn)用則于80年代之后。PCR最初得原始雛形概念就是類(lèi)似基因修復(fù)復(fù)制，它就 是于1971年由Dr、Kjell Kleppe提出。她發(fā)表了第一個(gè)單純且短暫性基因復(fù)制（類(lèi)似PCR前兩個(gè)周期反應(yīng)）得實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來(lái)得PCR則于1983由Dr、Kary B Mullis發(fā)展出得，Dr、Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界 有著特殊得地位。Dr、Mullis并于1985年與Saiki等人正式發(fā)表了第一篇相關(guān) 得論文。此后，PCR得運(yùn)用一日千里，相關(guān)得論文發(fā)表質(zhì)量可以說(shuō)就是令

3、眾多其它 研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研與臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成 為分子生物學(xué)研究得最重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2 P CF原理PCR技術(shù)得基本原理類(lèi)似于DNA得天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端 互補(bǔ)得寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA得變性濮板DNA經(jīng)加熱至93r左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成得雙鏈DNA解離,使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物得退火（復(fù)性）:模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55r左 右，引物與模板DNA單鏈得互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合

4、；引物得延伸:DNA模板-引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶得作用下，以dNTP脫氧核糖核苷三磷酸）為反應(yīng)原料,靶序列 為模板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新得與模板DNA鏈互補(bǔ)得 半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多得“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)得模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘,23小時(shí) 就能將待擴(kuò)目得基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。3、PCF反應(yīng)體系與反應(yīng)條件3、1標(biāo)準(zhǔn)得PCRS應(yīng)體系10 X擴(kuò)增緩沖液10卩l(xiāng)4種dNTP混合物200卩l(xiāng)引物10100卩l(xiāng)模板DNA 0 12卩gTaq DNA聚合酶2、5卩l(xiāng)Mg2+1、5mmol/L加雙或三蒸水100

5、卩I3、2 PCF反應(yīng)五要素參加PCR反應(yīng)得物質(zhì)主要有五種即 引物（PCR引物為DNA片段,細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制 得引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板與緩沖液（其中需要Mg2+）。PCF步驟標(biāo)準(zhǔn)得PCR過(guò)程分為三步：1、DNA變性（90r-96C）:雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2、 退火（25r -65 r）:系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。3、延伸（70r -75 r）:在Taq酶（在72 r左右，活性最佳）得作用下，以dNTP為原料,從引物得5端-3端延伸，合成與模板互補(bǔ)得DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火與延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PC

6、R因?yàn)閿U(kuò)增 區(qū)很短，即使Taq酶活性不就是最佳也能在很短得時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為 兩步法，即退火與延伸同時(shí)在60r -65r間進(jìn)行，以減少一次升降溫過(guò)程，提高了反 應(yīng)速度。4 PCR反應(yīng)特點(diǎn)4、1特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)得特異性決定因素為：2底物與模板DNA特異正確得結(jié)合；2堿基配對(duì)原則；3Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)得忠實(shí)性；4基因得特異性與保守性。其中引物與模板得正確結(jié)合就是關(guān)鍵。引物與模板得結(jié)合及引物鏈得延伸就是遵 循堿基配對(duì)原則得。聚合酶合成反應(yīng)得忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物得結(jié)合（復(fù)性）可以在較高得溫度下進(jìn)行，結(jié)合得特異性大大增加，被擴(kuò)增得靶基因片段也就能

7、保持很高得正確度。再通過(guò)選擇特異性與保守性高得靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。4、2靈敏度高PCR產(chǎn)物得生成量就是以指數(shù)方式增加得,能將皮克（Pg=1O12）量級(jí)得起始待測(cè)模 板擴(kuò)增到微克（卩g=10-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒得檢 測(cè)中,PCR得靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU空斑形成單位）;在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì) 菌。4、3簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫得Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液 與水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在24小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物 一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。4、4對(duì)標(biāo)本得純度要求低不需

8、要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍?接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。5 PCR常見(jiàn)問(wèn)題5、1假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)得關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸得制備，引物得質(zhì)量與特異性，酶得質(zhì)量，PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板:模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別就是染色體中得組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。 模板核酸變性不徹底。在酶與引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能就是標(biāo)本得 消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定得消化處理液，

9、其 程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活:需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析就是否因酶得活性喪失或不 夠而導(dǎo)致假陰性。需注意得就是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。引物:引物質(zhì)量、引物得濃度、兩條引物得濃度就是否對(duì)稱(chēng)，就是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散得常見(jiàn)原因。有些批號(hào)得引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率得不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為:選定一個(gè)好得引物 合成單位。引物得濃度不僅要瞧0D值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶得亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一 條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)與引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物 亮度

10、高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合 理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度:Mg2+濃度對(duì)PCRT增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCRT增得特異性,濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積 得改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用得體積為20ul、30ul、50ul或lOOul,應(yīng)用多大體積 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,就是根據(jù)科研與臨床檢測(cè)不同目得而設(shè)定，在做小體積如20ul后,再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變

11、性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率，退火溫度過(guò) 高影響引物與模板得結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)得溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)得變性、退火與延伸溫度。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列 某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCRT增就是不會(huì)成功得。5、2假陽(yáng)性出現(xiàn)得PCRT增條帶與目得靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引 物設(shè)計(jì)不合適：選擇得擴(kuò)增序列與非目得擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCRT增 時(shí)，擴(kuò)增出得PCR產(chǎn)物為非目得性得序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假

12、陽(yáng) 性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物得交叉污染：這種污染有兩種原因：一就是整個(gè)基因組或大片段 得交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫得物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管與試劑用紫外線照射，以破壞存在得核酸。二就是空氣中得小片段 核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定得同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性得產(chǎn)生，可用巢式PCF方法來(lái)減輕或消除。5、3出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)得條帶與預(yù)計(jì)得大小不一致

13、，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增 帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶得出現(xiàn)，其原因:一就是引物與靶序列不完全 互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二就是Mg2+濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循 環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次就是酶得質(zhì)與量，往往一些來(lái)源得酶易出現(xiàn)非特異條帶而 另一來(lái)源得酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí) 重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源得酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93C變性,65r左右退火與延 伸）。5、4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCRT增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶得質(zhì)量 差,

14、dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì) 策有:減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源得酶。減少dNTP得濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。 增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。原位PCR在科學(xué)研究中，每一項(xiàng)新技術(shù)得創(chuàng)立都會(huì)帶來(lái)一系列新得研究成果問(wèn)世，從而推動(dòng)著各學(xué)科得發(fā)展。縱觀形態(tài)研究領(lǐng)域，50年代電子顯微鏡引入形態(tài)學(xué)觀察領(lǐng)域,帶來(lái)了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平得深入研究；60-70年代，免疫組織化學(xué)與免疫細(xì) 胞化學(xué)技術(shù)得廣泛應(yīng)用，又將觀察得水平由亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)推向了蛋白質(zhì)分子水平，使細(xì)胞內(nèi)眾多得活性物質(zhì)得以進(jìn)行細(xì)胞或亞細(xì)胞水平得定位，對(duì)醫(yī)學(xué)生物學(xué)得發(fā)展無(wú)疑產(chǎn)生了深刻得影響。70年代，分子生物學(xué)技

15、術(shù)在形態(tài)學(xué)中得廣泛應(yīng)用，隨著原 位雜交技術(shù)得出現(xiàn)，使組織細(xì)胞內(nèi)特定得DNA或RNA序列能夠被定位，將蛋白質(zhì)水 平又提高到基因水平即核酸分子得觀察與定位，從而使人類(lèi)對(duì)許多生命現(xiàn)象在基 因水平上得認(rèn)識(shí)得以深化；80年代，分子生物學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)具有強(qiáng)大生命力得技 術(shù)PC多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)問(wèn)世了，很快地就被引入形態(tài)學(xué)觀察得領(lǐng)域,使細(xì)胞內(nèi)低拷貝或單拷貝得特定DNA或RNA得以進(jìn)行定位及觀察。這一技術(shù)得問(wèn)世，必將帶來(lái)更多得研究成果，使形態(tài)學(xué)得研究又向前邁出一大步。1基本原理原位PCR技術(shù)得基本原理，就就是將PCR技術(shù)得高效擴(kuò)增與原位雜交得細(xì)胞定位 結(jié)合起來(lái)，從而在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝得特定得DNA或

16、RNA序列。PCR技術(shù)就是在DNA聚合酶得作用下，經(jīng)過(guò)模板得變性、退火與引物延伸三種循 環(huán)，將引物引導(dǎo)下得特異性靶序列迅速地進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增得靶序列（一般能擴(kuò)增106倍）,很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來(lái)，因此,PCR技術(shù)具 有靈敏度高，特異性強(qiáng)得優(yōu)勢(shì)，隨著熱循環(huán)自動(dòng)化得提高與穩(wěn)定也使得PCR技術(shù)得 操作簡(jiǎn)便易行。但就是,PCR技術(shù)就是在液相中進(jìn)行得,在擴(kuò)增前,需將細(xì)胞破壞,從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR得結(jié)果與組織細(xì)胞得形態(tài)結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)，同時(shí),也很難判斷含特異性靶序列得細(xì)胞類(lèi)型。原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)，保持了兩項(xiàng)技術(shù)得優(yōu) 勢(shì)又彌補(bǔ)

17、了各自得不足。原位PCR技術(shù)得待檢標(biāo)本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組 織細(xì)胞得良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜與核膜均具有一定得通透性，當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),各種成分，如引物,DNA聚合酶,核苷酸等均可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)，以固定在細(xì) 胞內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)得RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得產(chǎn)物一般分子較 大,或互相交織,不易穿過(guò)細(xì)胞膜或在膜內(nèi)外彌散,從而被保留在原位。 這樣原有得 細(xì)胞內(nèi)單拷貝或低拷貝得特定DNA或RNA序列在原位以呈指數(shù)極擴(kuò)增，擴(kuò)增得產(chǎn) 物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。2基本類(lèi)型根據(jù)在擴(kuò)增反應(yīng)中所用得三磷酸核苷原料或引物就是否標(biāo)記，原位PCR技術(shù)可分 為直接法與間接法兩大類(lèi)，此外，還有反轉(zhuǎn)

18、錄原位PCR技術(shù)等。2、1直接法原位PCR技術(shù)直接法原位PCR技術(shù)就是將擴(kuò)增得產(chǎn)物直接攜帶標(biāo)記分子，即使用標(biāo)記得三磷酸 腺苷或引物片斷。當(dāng)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，標(biāo)記得分子就摻入到擴(kuò)增得產(chǎn)物中，顯 示標(biāo)記物，就能將特定得DNA或RNA在標(biāo)本（原位）中顯現(xiàn)出來(lái)。常用得標(biāo)記物有放射性同位素35S生物素與地高辛，用放射性自顯影得方法或用 親與組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)得方法去顯示標(biāo)記物所在位置。直接法原位PCR技術(shù)得優(yōu)點(diǎn)就是操作簡(jiǎn)便，流程短,省時(shí)。缺點(diǎn)就是特異性較差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性,擴(kuò)增效率也較低,特別就是在石蠟切片上,上述缺點(diǎn)更為突出。 因?yàn)?在制片過(guò)程中，無(wú)論就是固定，脫水還就是包埋，都會(huì)導(dǎo)致DNA得損

19、害，而受損得DNA可利用反應(yīng)體系中得標(biāo)記三磷酸核苷進(jìn)行修復(fù)，這樣標(biāo)記物就會(huì)摻入到DNA得非靶序列中，造成假陽(yáng)性。若用標(biāo)記引物得方法進(jìn)行直接法原位PCR其擴(kuò)增得效率比不標(biāo)記更低。2、2間接法原位PCR技術(shù)間接法原位PCF技術(shù)師現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行特定DNA或RNA擴(kuò)增，再用標(biāo)記得探針進(jìn) 行原位雜交，明顯提高了特異性，就是目前應(yīng)用最為廣泛得原位PCR技術(shù)。間接法原位PCR與直接法不同得就是，反應(yīng)體系與常規(guī)PCR相同,所用得引物或三 磷酸腺苷均不帶任何標(biāo)記物。即實(shí)現(xiàn)先擴(kuò)增得目得,然后用原位雜交技術(shù)去檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)已擴(kuò)增得特定得DNA產(chǎn)物，因此，實(shí)際上就是將PCR技術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié) 合起來(lái)得一種新技術(shù)，故又稱(chēng)

20、之為PCR原位雜交（PCR in situ hybridization , PISH）間接法PCR技術(shù)得優(yōu)點(diǎn)就是特異性較高，擴(kuò)增效率也較高。 缺點(diǎn)就是操作步驟較 直接法繁瑣。2、3原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)原位反轉(zhuǎn)錄PCR（in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR就是將液相得RT-P（技術(shù)應(yīng)用到組織細(xì)胞標(biāo)本中得一種新技術(shù)，與RT-PCR液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行 原位反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)之前，組織標(biāo)本要先用DNA酶處理，以破壞組織中得DNA酶,這樣才能保證擴(kuò)增得模板就是從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成得cDNA而不就是細(xì)胞中原有 得DNA。其它基本步驟與液相得R

21、T-PCR目似。3基本步驟原位PCR技術(shù)得基本步驟包括標(biāo)本得制備。原位擴(kuò)增（PCR及原位檢測(cè)等基本環(huán) 節(jié),現(xiàn)分述如下（重點(diǎn)以石蠟切片為例）。3、1標(biāo)本得制備原位PCR技術(shù)可應(yīng)用于細(xì)胞懸液、細(xì)胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而 言，以懸浮得完整細(xì)胞做原位PCF效果最好,石蠟切片效果最差。隨著技術(shù)方面得 一些問(wèn)題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意得PCR效率得報(bào)道。效果不好 得原因就是多方面得，如:玻片上做PCR熱傳導(dǎo)較差，熱對(duì)流不均勻，TaqDNA酶被玻 璃片吸附等,更為主要得原因,可能就是標(biāo)本經(jīng)制片后,細(xì)胞缺乏完整得胞漿或核 膜,擴(kuò)增產(chǎn)物易發(fā)生彌漫而導(dǎo)致擴(kuò)增得產(chǎn)物在原位不易保留。絕大多數(shù)

22、 得病理標(biāo)本都就是以福爾馬林固定,石蠟包埋得形式保存得,若能很好地解決石蠟 切片原位PCR得有關(guān)技術(shù)問(wèn)題,意義顯然就是十分重大得。組織細(xì)胞得固定:一般認(rèn)為組織細(xì)胞以10%得緩沖福爾馬林或4%得多聚甲醛固定 后進(jìn)行原位PCR效果較好。固定得時(shí)間一般不宜過(guò)長(zhǎng)，視組織得大小，一般以4C 4-6小時(shí)為宜。切片得厚度:一般而言,切片若厚一些，原位PCR得效果也較好一些，因?yàn)榍衅胶?，靶DNA得含量也就越多，同時(shí)膜結(jié)構(gòu)也較多，防止擴(kuò)增產(chǎn)物彌散得作用也越明顯。 但厚切片細(xì)胞重疊多,形態(tài)學(xué)觀察得效果就差了,分辨率也將下降。玻片得處理：為防止石蠟切片在PCR與原位雜交過(guò)程中脫落，在玻片應(yīng)作防脫片處 理,常用得方

23、法就是涂以多聚賴氨酸或用硅烷化處理,一般能防止組織脫落。 蛋白酶得消化作用:在進(jìn)行原位擴(kuò)增之前,組織標(biāo)本需經(jīng)蛋白酶處理。經(jīng)蛋白酶消 化得組織細(xì)胞,可增加其通透性,充分允許反應(yīng)體系中得各成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并能 很好得暴露靶序列，以利于擴(kuò)增。常用得蛋白酶有蛋白酶K,胰蛋白酶或胃蛋白酶。 蛋白酶消化得程度就要根據(jù)組織固定得程度進(jìn)行調(diào)整。蛋白酶消化后,要注意加 熱以滅活酶得活性或通過(guò)充分得洗滌將酶完全去除,因?yàn)橹灰猩倭康脷埩裘复?在，都將對(duì)隨后進(jìn)行得PCR反應(yīng)體系得數(shù)量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性得影響。蛋白酶 消化處理組織細(xì)胞可提高通透性,有利于后續(xù)進(jìn)行得各反應(yīng)成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核 內(nèi),但同時(shí)也使得擴(kuò)增產(chǎn)

24、物得彌散機(jī)會(huì)增多,有可能帶來(lái)假陽(yáng)性或假陰性得結(jié)果。 原位擴(kuò)增（PCR）原位擴(kuò)增即在組織細(xì)胞標(biāo)本上進(jìn)行PCR反應(yīng)，其基本原理與液相PCR完全相同。 引物:PCR所用得引物一般為15-30bp為宜,擴(kuò)增得片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短得引物。從石蠟切片中提取得DNA很少超過(guò)400bp,RNA很少超過(guò)200b P,較長(zhǎng)序列得擴(kuò)增易引起引物與模板得錯(cuò)配而導(dǎo)致非特異性反應(yīng)得出現(xiàn)。 反應(yīng)體系:原位PCF得反應(yīng)體系與常規(guī)得液相PCR基本相同，由于就是在經(jīng)過(guò)固定 得組織切片上進(jìn)行,為獲得較好得擴(kuò)增效果,有人主張反應(yīng)體系中得引物,TaqDNA聚合酶以及Mg2+得濃度均應(yīng)高于液相得PCF反應(yīng)體

25、系。在反應(yīng)體系中要加入牛 血清白蛋白(BSA)以防止TaqDNA聚合酶與玻片得結(jié)合而降低了擴(kuò)增效率。熱循環(huán):原位PCR得熱循環(huán)可在專(zhuān)門(mén)得熱循環(huán)儀上進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便。也可在一般得PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，通常在樣品臺(tái)上覆蓋一層鋁箔，制成平臺(tái)，樣品臺(tái)上得空間用 礦物油或水充填,將載玻片至于平臺(tái)上,即可進(jìn)行熱循環(huán)得步驟。為了保證進(jìn)行充分得擴(kuò)增，原位PCR熱循環(huán)中每一步驟得時(shí)間可比常規(guī)PCR略長(zhǎng) 些另外，也可采用熱啟動(dòng)(hot start)得方法，即玻片加熱到80-94E時(shí)，再立即加入TaqDNA聚合酶。為了保證反應(yīng)體系在熱循環(huán)過(guò)程不過(guò)多丟失,可用清亮得指甲 油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來(lái)。洗滌:原

26、位擴(kuò)增結(jié)束后,標(biāo)本應(yīng)清洗,以除去彌散到細(xì)胞外得擴(kuò)增產(chǎn)物。 洗滌不充分,會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測(cè)時(shí)顯現(xiàn),造成背景過(guò)深或假陽(yáng)性結(jié)果得出現(xiàn)。但就是,洗滌 過(guò)度,也會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增得產(chǎn)物被洗脫,就是陽(yáng)性信號(hào)減弱或丟失。有作者在擴(kuò) 增后用4%多聚甲醛2小時(shí)或2%戊二醛5分鐘進(jìn)行后固定,以使擴(kuò)增得產(chǎn)物在檢 測(cè)時(shí)能很好地保留在細(xì)胞內(nèi),提高檢測(cè)得敏感性與特異性。原位檢測(cè):原位PCR得擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法，取決于原位PCR得設(shè)計(jì)方案，直接法則根 據(jù)標(biāo)記分子得性質(zhì)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測(cè)。 間接法則需用原位雜交得方法 進(jìn)行檢測(cè)。4原位PCR技術(shù)得應(yīng)用原位PCR技術(shù)得突出優(yōu)勢(shì),就就是能在組織細(xì)胞原位檢測(cè)出拷貝數(shù)較低得特異

27、性 基因序列。按照待測(cè)基因得性質(zhì)，可將原位PCR得應(yīng)用分為檢測(cè)外源性基因與內(nèi) 源性基因兩方面。4、1用于外源性基因得檢測(cè)4、1、1病毒基因得檢測(cè)感染病毒得細(xì)胞常無(wú)較好得檢測(cè)手段，但當(dāng)原位PCR技術(shù)應(yīng)用后,使這一極為困難 得問(wèn)題有望解決。對(duì)HIV、HPV HSV HBV HCV等多種病毒得檢測(cè),使我們能夠成功等觀察到這些 病毒在艾滋病、生殖系統(tǒng)腫瘤、肝炎及肝癌中得作用,能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)受感染得人 群。4、1、2細(xì)菌基因得檢測(cè) 最突出得應(yīng)用就是在結(jié)核桿菌得檢測(cè)上,當(dāng)結(jié)核病變不夠典型時(shí),經(jīng)過(guò)特殊染色得 方法很難在鏡下找到結(jié)核桿菌，而應(yīng)用原位PCR技術(shù)可幫助明確診斷，當(dāng)結(jié)核桿菌 很少時(shí)仍能在鏡下被很容易地

28、找出來(lái)。4、1、3導(dǎo)入基因得檢測(cè) 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得研究中,就是否導(dǎo)入了基因,在接受基因治療得患者體內(nèi),就是否 接受了導(dǎo)入得基因，均可用原位PCR技術(shù)來(lái)證實(shí)。因此，原位PCR技術(shù)成為重要得 檢測(cè)手段。4、2用于內(nèi)源性基因得檢測(cè)4、2、1異常基因得檢測(cè)機(jī)體內(nèi)基因得突變、重排、也可用原位PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，原癌基因，抑癌基因得 突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因得重排，對(duì)腫瘤得研究與診斷無(wú)一均提供了 廣闊得應(yīng)用前景。4、2、2固有基因得檢測(cè)對(duì)于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)只有單個(gè)或幾個(gè)拷貝得低表達(dá)固有基因，原位雜交技術(shù)因基因拷 貝數(shù)太少而無(wú)能為力，液相PCR雖可進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)出來(lái)，但不能確定含有該基因得 細(xì)胞類(lèi)型，原位P

29、CR技術(shù)則彌補(bǔ)了上述兩種技術(shù)得不足，使得我們能夠?qū)θ祟?lèi)各種 基因進(jìn)行檢測(cè)，而完成人類(lèi)基因圖得繪制。反向PCR反向PCR（reversePCR就是用反向得互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外得未知序列得片 段,而常規(guī)PCR擴(kuò)增得就是已知序列得兩引物之間DNA片段、實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序 列內(nèi)部沒(méi)有切點(diǎn)得限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性 末端得靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向得引物進(jìn)行PCR其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物 外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究、反向PCR得目得在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)得DNA,也就就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不 就是在一對(duì)引物之間而就是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已

30、知DNA區(qū)段相連接得未知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這 時(shí)選擇得引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3端就是相互反向 得。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增引物得上游片段與下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染 色體（YAC大得線狀DNA片段得雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列得確定與基因庫(kù) 染色體上DNA片段序列得識(shí)別十分重要。PCR只能擴(kuò)增兩端序列已知得基因片段，反向PCR可擴(kuò)增中間一段已知序列，而兩 端序列未知得基因片段不擴(kuò)增。反向PCR得目得在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)得DNA,也就就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不 就是

31、在一對(duì)引物之間而就是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接得未知染色體序列，因此又可稱(chēng)為染色體緩移或染色體步移。這 時(shí)選擇得引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3端就是相互反向 得。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA然后用DNA連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀DNA分子，通過(guò)反向PCRT增引物得上游片段與下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染 色體（YAC大得線狀DNA片段得雜交探針，這對(duì)于轉(zhuǎn)座子插入序列得確定與基因庫(kù) 染色體上DNA片段序列得識(shí)別十分重要。該方法得不足就是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說(shuō)必須選擇一種合適得酶 進(jìn)行酶切才能得到合理大小得DNA片段。這種選擇不

32、能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度與高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中 得未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過(guò)反向PCR得到得探針就有可能 與多個(gè)基因序列雜交。利用反向PCF可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析，探索鄰接已知DNA片段得序列，并可 將僅知部分序列得全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行分子克隆，建立全長(zhǎng)得DNA探針。適用于基因 游走、轉(zhuǎn)位因子與已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。用傳統(tǒng)得緩沖液與其她提供者推薦得條件裂解DNAo反向PCR所擴(kuò)增得片段得大小由PCR擴(kuò)增片段得大小決定，目前,PCR擴(kuò)增得實(shí)際上限為3-4kb。在許多情 況下，首先 需要進(jìn)行Southern雜

33、交來(lái)確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR得片段得末端 片段。能裂解核心區(qū)得內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定 模板（依賴于引物）得上游或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)得酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò) 增，并帶有由內(nèi)切酶與環(huán)化類(lèi) 型決定得接點(diǎn)（例如，互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接）。對(duì) 于擴(kuò)增左翼或右翼序列，初試時(shí) 最好靠近識(shí)別上個(gè)堿基位位得酶，并已知在核心 區(qū)有其方便得裂解位點(diǎn)。如果用反向PCR從含有大量不同得克隆片段得同一載體中探測(cè)雜交探針，建議事先在載體中引入 合適得酶切位點(diǎn)。用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中,為產(chǎn)生對(duì)反向PCR大小適當(dāng)?shù)肈NA片段需要兩種內(nèi)切酶,但這樣所產(chǎn)生得片

34、段末端則不適于連 接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理（鈍化）。連接前，需用酚或熱 變性使內(nèi)切 酶失活。聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用得相同，例如,94 r -30秒變性,58 C -30秒引物退火, Taq聚合酶70C延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。 將反向PCR用于測(cè)序時(shí),與核心區(qū)末端后部結(jié)合得擴(kuò)增引物更為有用，它使測(cè)序 引物擴(kuò)增部 分得核心序列與未知邊側(cè)序列間得接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物得干擾。描述一種大聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)用得方法，使在已知序列得核心區(qū)邊側(cè)得未知成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增用適當(dāng)?shù)孟拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)得，以產(chǎn)生適合于擴(kuò)增大小得片段,然后片段得末端

35、再連接形成環(huán)狀分子得引物同源于環(huán)上核心區(qū)得末端序列,但其方向性，使鏈得延長(zhǎng)經(jīng)過(guò)環(huán)上得未知區(qū)而不就是分開(kāi)引物得核心區(qū)這種反向 方法可用于擴(kuò)增本來(lái)就在核心區(qū)旁邊得序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身得上下游序列。逆轉(zhuǎn)錄PCR1概念RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCR（reversetranscription PCR與實(shí)時(shí)PCR（realtime PCR共同得 縮寫(xiě)。逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR, RT-PC就）是聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR得一種廣泛應(yīng)用得變形。在RT-PC中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為 互補(bǔ)DNA,再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA稱(chēng)作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA得DNA聚合 酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA得另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物與依賴DNA得DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增,即通常得PCR原先得RNA模板被RNA酶H降解，留下互補(bǔ)DNA。RT-PCF得指數(shù)擴(kuò)增就是一種很靈敏得技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)得RNA。RT-PC