1、高通量測(cè)序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用農(nóng)業(yè)資源利用 一、一、高通量測(cè)序簡(jiǎn)介高通量測(cè)序簡(jiǎn)介 二、二、高通量測(cè)序平臺(tái)的介紹高通量測(cè)序平臺(tái)的介紹 三、三、高通量測(cè)序高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用1.1 1.1 什么是高通量測(cè)序技術(shù) 高通量序技術(shù)（next-generation sequencing）是對(duì)傳統(tǒng)Sanger法測(cè)序的一次革命性的改變，是一次可對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的高通量的測(cè)序技術(shù)，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(deep sequencing)。 一一. 高通量測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序技術(shù)1.2 為什么要

2、發(fā)展高通量測(cè)序技術(shù) 快速和準(zhǔn)確地獲取生物體的遺傳信息對(duì)于生命科學(xué)研究一直具有十分重要的意義。對(duì)于每個(gè)生物體來(lái)說，基因組包含了整個(gè)生物體的遺傳信息。測(cè)序技術(shù)能夠真實(shí)地反映基因組DNA上的遺傳信息，進(jìn)而比較全面地揭示基因組的復(fù)雜性和多樣性，因而在生命科學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。 1977年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。 盡管第一代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測(cè)序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的測(cè)序方法。經(jīng)過不斷的開發(fā)和測(cè)試，進(jìn)入21世紀(jì)后，以Roche公司

3、的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的第二代測(cè)序技術(shù)誕生了。1.3 1.3 高通量測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn) 速度快 準(zhǔn)確度高 成本低 覆蓋度深 產(chǎn)出巨大二 高通量測(cè)序技術(shù)的原理 高通量測(cè)序技術(shù)包括Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。 下面對(duì)三種高通量測(cè)序技術(shù)的原理和特點(diǎn)分別進(jìn)行具體介紹。454 Pyrosequencing 基于磁珠的焦磷酸測(cè)序：A 磁珠制備設(shè)備B 454測(cè)序儀C 454測(cè)序原理454 測(cè)序流程與Base Calling 每次加入一種堿基然后再對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行讀取。堿基聚合反應(yīng)產(chǎn)生

4、焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP，ATP在熒光酶催化下激發(fā)熒光，熒光強(qiáng)度和焦磷酸的量成正比。 454技術(shù)的主要缺點(diǎn)是無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物(homopolymer)的長(zhǎng)度。例如當(dāng)待測(cè)序列中出現(xiàn)Poly(A)的情況下，測(cè)序反應(yīng)中會(huì)一次加上多個(gè)T，而加入T的數(shù)目只能從熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)推測(cè)，有可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是因?yàn)檫@個(gè)原因，454技術(shù)主要的錯(cuò)誤不是來(lái)自核苷酸的替換，而是來(lái)自插入或缺失。 454技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。Illumina Solexa簡(jiǎn)介 橋式PCR 邊合成邊測(cè)序 可逆終止物HiSeq 2000Solexa 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用

5、 讀長(zhǎng)較短，100150bp 通量高，25G每天，120-150G每Run 主要應(yīng)用：RNA測(cè)序、表觀遺傳學(xué)研究ABI SOLiD 簡(jiǎn)介 SOLiDSequencing by Oligo Ligation/Detection Oligo連接測(cè)序：通過連接酶連接，再對(duì)oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)SOLiD 5500 xlABI SOLiD測(cè)序前期制備A 樣品片段化磁珠連接B 乳化PCR3末端修飾C 磁珠富集轉(zhuǎn)到測(cè)序玻片ABI SOLiD測(cè)序原理測(cè)序流程依次加入五種引物進(jìn)行五次測(cè)序。加入測(cè)序引物及加入oligo連接酶連接，激發(fā)熒光檢測(cè)，循環(huán)一個(gè)流程，換一種引物再循環(huán)一個(gè)流程，五個(gè)流程結(jié)果疊加分析出

6、序列。SOLiD 的特點(diǎn)與主要應(yīng)用 讀長(zhǎng)較短，50-75bp 精度高，可達(dá)Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可達(dá)120G 主要應(yīng)用：基因組重測(cè)序、SNP檢測(cè)等三種平臺(tái)的技術(shù)差異三、高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用 目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物全基因組測(cè)序、目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物全基因組測(cè)序、基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小RNAs測(cè)序和表觀基因組測(cè)測(cè)序和表觀基因組測(cè)序等方面序等方面 。下面對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體。下面對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體應(yīng)作以介紹。應(yīng)作以介紹。3.1 全基因組重測(cè)序 全基因組重測(cè)序是對(duì)已

7、知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通過序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)( SNP) 、插入缺失位點(diǎn)( InDel，Insertion/Deletion) 、結(jié) 構(gòu) 變 異 位 點(diǎn)( SV，Structure Variation) ， 通過生物信息學(xué)手段，分析不同個(gè)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)完成注釋。 3.1.1 利用重測(cè)序進(jìn)行進(jìn)化分析及SNP篩選 Lai Lai 等等(2021)(2021)對(duì)對(duì)6 6個(gè)玉米個(gè)玉米( Zeamays) ( Zeamays) 骨骨干自交系進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)干自交系進(jìn)行了全基

8、因組重測(cè)序，共發(fā)現(xiàn) 12731241273124個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)( SNPs) ( SNPs) ，得，得到到3017830178個(gè)個(gè)1 16bp6bp的插入缺失位點(diǎn)的插入缺失位點(diǎn)( InDels) ( InDels) ， 新發(fā)現(xiàn)的這些新發(fā)現(xiàn)的這些SNPsSNPs和和InDelsInDels提供了提供了1 1個(gè)高密度個(gè)高密度的全基因組標(biāo)記信息，同時(shí)也鑒定出數(shù)百個(gè)的全基因組標(biāo)記信息，同時(shí)也鑒定出數(shù)百個(gè)基因獲得與丟失變異基因獲得與丟失變異( Presence/Absence ( Presence/Absence VariationsVariations，PAVs)PAVs)。

9、3.1.2 利用重測(cè)序技術(shù)鑒定突變體突變基因 Ashelford等( 2021)對(duì)一個(gè)擬南芥突變體ebi 1的回交系進(jìn)行基因組重測(cè)序，隨后又通過對(duì)突變體的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)查使得候選SNPs數(shù)目得 以 有 效 縮 小，最終成功鑒定出1 個(gè) 在AtNFXL2基因中引起ebi1突變表型的SNPs位點(diǎn) 該研究證實(shí)利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析可有效減少候選SNPs數(shù)目。3.2 全基因組denovo測(cè)序 全基因組denovo測(cè)序也稱為從頭測(cè)序，是直接對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行基因組全測(cè)序，然后利用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行拼接和組裝，得到完整的物種基因組序列、基因組測(cè)序?qū)ρ芯课锓N的基因組和功能基因

10、信息、闡明物種的進(jìn)化及其生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義。 Huang 等( 2021)完成的黃瓜( CucumissativusL. ) 全基因組測(cè)序是世界上第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的蔬菜作物，該工作的完成對(duì)黃瓜及其他近緣物種的遺傳、改良基礎(chǔ)生物學(xué)研究等具有重要的意義。3.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究 轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非 編碼RNA。 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指通過新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)cDNA測(cè)序，利用統(tǒng)計(jì)相關(guān)reads數(shù)計(jì)算出不同mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SNP新的mRNA等，該技術(shù)可以從表達(dá)水平、等位基因特異性表達(dá)RNA編輯、含有重要信息的融合基因

11、轉(zhuǎn)錄子差異剪接等方面展開相關(guān)研究。 Zhang等( 2021)用8種不同水稻( Oryzasativa L. ) 樣品的不同組織于不同時(shí)期混合建庫(kù)，通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了栽培稻的第1張轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果在水稻8種組織樣品中檢測(cè)到大約27000個(gè)基因的表達(dá)和38000個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，證實(shí)了約9000個(gè)基因發(fā)生可變剪接，同時(shí)鑒定出了234個(gè)由反式剪接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄融合基因，表明融合基因比預(yù)期的更為普遍。3.4 外顯子組測(cè)序 外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需的重要信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的絕大部分功能性變異，能夠直接發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)的遺傳突變 。 3.5小分子RNA測(cè)序 小分子RNA是一類長(zhǎng)約2030個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是植物中的一種新型基因調(diào)控機(jī)制。 Moxon等利用454FLX法分析了番茄葉片和果實(shí)中的小分子RNA表達(dá)情況，結(jié)果表明: 番茄miR390 和miR1917在果實(shí)中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在葉片中，而且miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟過程中應(yīng)答乙烯時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)，因此認(rèn)為這2個(gè)miRNA可能參與了番茄果實(shí)的發(fā)育過程。盡管高通量測(cè)序技術(shù)有諸多的優(yōu)勢(shì)，但其局限性也不容忽視。海量測(cè)序數(shù)據(jù)的產(chǎn)生及分析給研究者提