1、應(yīng)用低濃度長(zhǎng)春新堿分離并鑒定MG63細(xì)胞系中的骨肉瘤干細(xì)胞                              作者：婁楠 王巖趙建武 高忠禮【摘要】  目的 分離并鑒定人成骨肉瘤細(xì)胞系MG63中的骨肉瘤類腫瘤干細(xì)胞。方法 通過無血清培養(yǎng)基加入低濃度長(zhǎng)春新堿的方法懸浮培養(yǎng)成骨肉瘤細(xì)胞球來進(jìn)行分離和類干細(xì)

2、胞富集。后行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞球免疫熒光染色、RTPCR、流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，成骨、成脂肪誘導(dǎo)及裸鼠成瘤的一系列鑒定試驗(yàn)。結(jié)果 懸浮培養(yǎng)得到肉瘤細(xì)胞球，可持續(xù)傳代細(xì)胞亞系“MG63M”，多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物及多藥耐藥基因表達(dá)均為陽性。具有很強(qiáng)的自我更新及多項(xiàng)分化能力。結(jié)論 MG63細(xì)胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的骨肉瘤干細(xì)胞，而采用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加低濃度長(zhǎng)春新堿是從骨肉瘤細(xì)胞系中分離培養(yǎng)出骨肉瘤干細(xì)胞的有效辦法。 【關(guān)鍵詞】  MG63細(xì)胞;單克隆;細(xì)胞株腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤中存在一小部分細(xì)胞，像正常干細(xì)胞一樣，具有自我更新能力。這種為數(shù)不多的細(xì)胞

3、呈不對(duì)稱分裂，產(chǎn)生的絕大多數(shù)細(xì)胞是普通腫瘤細(xì)胞，而真正致瘤和維持腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)的類干細(xì)胞的數(shù)量是非常稀少的。根據(jù)此理論，推斷骨肉瘤干細(xì)胞的存在也許正是骨肉瘤的異質(zhì)性和對(duì)化療藥物的抗藥性存在的關(guān)鍵。而Gibbs1等已經(jīng)利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮成球的方法成功的分離出 骨肉瘤干細(xì)胞，也證明其表達(dá)胚胎干細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志物，具有自我更新和多項(xiàng)分化能力。本研究利用腫瘤干細(xì)胞具有化療藥物抵抗的特點(diǎn)，使用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基加入低濃度長(zhǎng)春新堿懸浮成球的方法，進(jìn)一步富集骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞。而得到的細(xì)胞亞群同樣具有自我更新和多項(xiàng)分化能力、更高的致瘤能力和極為顯著的化療藥物耐藥性。1 材料與方法1.1 試劑 人成骨肉瘤細(xì)胞M

4、G63購(gòu)自ATCC。高糖DMEM (Gibco，USA)，優(yōu)等胎牛血清(Hyclone，USA) ，胰酶 (Promega，USA)，二甲基亞砜(DMSO，天佳生物科技有限公司中國(guó))，Trizol、TaKaRa RTPCR Kit(TaKaRa，Japan)，CCK8(碧云天生物 研究所) ，TritonX100、PI、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、 噻唑藍(lán) (MTT)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Sigma，USA)，鼠抗人CD44FITC、CD45FITC、CD106FITC、CD133FITC、CD105FITC(武漢博士德公司)，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司),P

5、CR引物(上海生物工程公司)。1.2 方法1.2.1 懸浮成球試驗(yàn) MG63細(xì)胞以6×104的密度接種在6孔板(Corning，Inc.，Corning,NY)，使用含有1%甲基纖維素的無血清HDMEM培養(yǎng)基，其中加入黃體酮(20 nmol/L)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(25 mg/ml)、長(zhǎng)春新堿(10 ng/ml)、胰島素(20 mg/ml)，hEGF(10 ng/ml)，bFGF(10 ng/ml)每2 d加入1次，培養(yǎng)6 d和12 d，使用相差顯微鏡進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。培養(yǎng)57 d,待培養(yǎng)基中懸浮的肉瘤細(xì)胞球體積較大后，吸取培養(yǎng)基并離心，用無血清培養(yǎng)基重新吹打成單細(xì)胞懸液，按 12或 13比例傳

6、代。使用重復(fù)3次。1.2.2 RTPCR檢測(cè)類腫瘤干細(xì)胞中OCT4、Nanog、nestin、mdr1 mRNA的表達(dá) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MG63和MG63M細(xì)胞各2×1010個(gè)細(xì)胞 /ml,按 Trizol提取試劑盒說明提取細(xì)胞內(nèi)RNA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色觀察，電泳產(chǎn)物用FT500凝膠成像系統(tǒng)照相，各系統(tǒng)經(jīng)吸光度掃描儀進(jìn)行分析。1.2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志物 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞5×105，1 000 r/min離心5 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗1次。0.1%

7、Triton X100 0.5 ml，10 min。PBS清洗1次。一抗(兔抗人MMP26多克隆抗體11 000稀釋)4孵育40 min，PBS清洗1次。二抗(羊抗兔FITC標(biāo)記)4孵育40 min。PBS清洗1次，500 l PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。     1.2.4 CCK8法檢測(cè)類腫瘤干細(xì)胞增殖活性 生長(zhǎng)曲線測(cè)定:細(xì)胞接種，胰酶消化80%融合狀態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)以1×104接種7塊96孔板，每種細(xì)胞設(shè)8個(gè)平行孔。每日定時(shí)隨機(jī)取出一塊孔板，每加入含10%胎牛血清的HDMEM 90 l/孔，并加入10 ul/孔CCK8，37孵育3 h后

8、測(cè)量光吸收值。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、分析結(jié)果并作圖。全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀在 490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值 (D值)，取均值并繪制生長(zhǎng)曲線。1.2.5 免疫熒光染色 將蓋片放入無水乙醇:冰醋酸=11的液體中浸泡30 min;棄去浸泡液，純水沖洗;再用無水乙醇浸泡30 min，然后用綢布擦干;將處理的蓋片置于小平皿內(nèi)高壓、烤干備用。取P6代細(xì)胞，用0.25%胰酶37消化3 min左右，加入含10%FCS培養(yǎng)液中和胰酶，輕輕吹打細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸液離心，800 r/min，6 min，使細(xì)胞形成微團(tuán)，再用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞;計(jì)數(shù)細(xì)胞，以104105個(gè)細(xì)胞/ml接種在預(yù)先已放置蓋片的24孔板內(nèi);當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿蓋片的80%左右

9、，將培養(yǎng)液吸出，37預(yù)熱的0.1 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次;4%多聚甲醛室溫固定30 min;0.1 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次;蒸餾水沖洗3次，5 min/次;將細(xì)胞爬片在37孵箱中烘烤2 h，然后放入-20冰箱保存，以備染色。將爬片從24孔板內(nèi)取出，蒸餾水水化10 min后，應(yīng)用0.1%TritonX100滲透打孔10 min，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，5min/次;滴加阻斷劑室溫孵育15 min;0.01 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次;滴加封閉血清，室溫孵育30 min;甩掉蓋片上的多余血清，滴加一抗(濃度為150)，3

10、7孵育1 h或4過夜，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次;滴加FITC標(biāo)記二抗，同時(shí)加入羅丹明或DAPI染細(xì)胞核，放置于濕盒內(nèi)，常溫避光反應(yīng)30 min，0.01 mmol/L PBS沖洗3次，5 min/次;激光掃描共焦顯微鏡(LSCM)下觀察。1.2.6 成骨誘導(dǎo)體系的建立 將MG63、MG63M兩個(gè)細(xì)胞系細(xì)胞，以3×103個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于100 mm平皿內(nèi)，加入含10%FBS的無酚紅LDMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，換為成骨基礎(chǔ)誘導(dǎo)液，分為MG63對(duì)照組、MG63M組;每4 d換1次培養(yǎng)液，雌激素和抑制劑每2 d添加1次，誘導(dǎo)24 d。行von co

11、ssa染色。1.2.7 成脂肪誘導(dǎo)體系建立 將MG63、MG63M兩種細(xì)胞系細(xì)胞，以4×103個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于100 mm平皿內(nèi)，加入含10%FBS的無酚紅LDMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后換為成脂肪誘導(dǎo)液(胰島素0.01 mg/ml、0.2 mmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、0.2 mol/L地塞米松，10%FBS無酚紅LDMEM培養(yǎng)基)，每4 d換1次培養(yǎng)液，雌激素和抑制劑每2 d添加1次，誘導(dǎo)12 d。行油紅O染色鑒定脂滴。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用單因素方差分析。2 結(jié) 果2.1 細(xì)胞球的形成 MG6

12、3骨肉瘤細(xì)胞離心后置于無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4872 h后形成大小不等的只有數(shù)個(gè)細(xì)胞的圓形類細(xì)胞球，懸浮生長(zhǎng)，而不能形成細(xì)胞球的貼壁細(xì)胞因無法耐藥基本死亡。細(xì)胞球傳代后 2 d即可見到次代腫瘤細(xì)胞球的形成，以后體積逐漸增大，形態(tài)規(guī)則。細(xì)胞球可傳代，命名為“M”細(xì)胞株。見圖1。2.2 RTPCR結(jié)果 多能干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133)，胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物(OCT3/4、 nestin、nanog)，多藥耐藥基因(MDR1、ABCG2)均在“M”細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)。2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)志物 流式細(xì)胞儀檢測(cè)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物(CD105，CD90，CD44，CD29)，造血干細(xì)胞標(biāo)志物(CD34，

13、CD133)，上皮干細(xì)胞標(biāo)志物(CD24)。結(jié)果證明CD34、CD31、CD105無論在MG63還是M細(xì)胞株都呈陰性表達(dá)，而CD90和CD44都呈較強(qiáng)的陽性，且表達(dá)量基本相當(dāng)。而M細(xì)胞株CD29表達(dá)量略高，CD24略低于MG63;多能干細(xì)胞標(biāo)志物CD133在M細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MG63，而這在RTPCR 的檢測(cè)中也得到了驗(yàn)證。2.4 類腫瘤干細(xì)胞增殖活性 類腫瘤干細(xì)胞的增殖潛伏期約為 22.8 h,傳代后 2448 h即可見傳代的腫瘤干細(xì)胞形成，以后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。類腫瘤干細(xì)胞對(duì)數(shù)倍增時(shí)間約為傳代后35 d。     2.5 免疫熒光染色 無血清懸浮

14、培養(yǎng)中的懸浮肉瘤細(xì)胞球行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133)、胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物(OCT3/4、 nestin、nanog)、多藥耐藥基因(MDR1、ABCG2)均呈陽性表達(dá)。PI染細(xì)胞核。見圖2。2.6 成骨、成脂肪誘導(dǎo) 分別使用成骨及成脂誘導(dǎo)液對(duì)“M”細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，成脂誘導(dǎo)14 d胞漿內(nèi)可見大量脂滴形成。成骨誘導(dǎo)24 d可見骨結(jié)節(jié)形成。見圖3。3 討 論本實(shí)驗(yàn)中再次確定骨肉瘤中確實(shí)存在一個(gè)具有懸浮成球和自我更新能力的細(xì)胞亞群，而這也與從腦腫瘤和乳腺腫瘤中分離出的腫瘤干細(xì)胞在大體形態(tài)上相同1，2。通過這種懸浮成球的方式得到的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的很多性質(zhì)與正常干細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞也極

15、為相似。此外，這些干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞表達(dá)很多間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物，如CD44、CD45、CD105 等，而其也具備間充質(zhì)干細(xì)胞的至少兩項(xiàng)分化能力。此外，這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的相關(guān)基因，而腫瘤細(xì)胞球高表達(dá)胚胎干細(xì)胞多分化潛能的關(guān)鍵性標(biāo)志物Oct 3/4、nestin和 Nanog。綜上所述，這些數(shù)據(jù)都有力的說明骨肉瘤中確實(shí)有類干細(xì)胞性質(zhì)的亞群存在。骨肉瘤細(xì)胞球與普通骨肉瘤細(xì)胞最顯著的差異就是Oct 3/4、nestin和 Nanog的高表達(dá)，而進(jìn)一步深入的研究發(fā)現(xiàn)，早期形成的小細(xì)胞球中Oct 3/4、nestin和 Nanog的陽性表達(dá)極高，隨著細(xì)胞球增大，細(xì)胞數(shù)目的增多，胚胎干細(xì)胞標(biāo)

16、志物的表達(dá)逐漸降低，也說明了腫瘤呈現(xiàn)了更顯著的異質(zhì)性。而這些都說明原始的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)對(duì)稱分裂到不對(duì)稱分裂的轉(zhuǎn)變，也因此產(chǎn)生了多種成分的子代腫瘤細(xì)胞。有趣的是通常認(rèn)為是間充質(zhì)惡性腫瘤的骨肉瘤實(shí)際上是表達(dá)三個(gè)胚層的基因,但在體內(nèi)的骨肉瘤卻為間充質(zhì)性質(zhì)。而與其一致的是培養(yǎng)中的細(xì)胞也顯示了間充質(zhì)干細(xì)胞所應(yīng)有的特征性蛋白。這些都能說明骨肉瘤腫瘤干細(xì)胞最有可能由幼稚的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)展而來。骨肉瘤是由成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，多發(fā)生在年輕成人。盡管腫瘤發(fā)生來源不同，但其中的干細(xì)胞樣成分和其表達(dá)情況卻是沒有差別的。相信此類腫瘤中的腫瘤干細(xì)胞維持腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制也是相差無幾的。Oct 3/4是Pou家族的同

17、源異型蛋白(質(zhì))，最初在胚胎內(nèi)細(xì)胞中表達(dá)，是胚胎干細(xì)胞保持多項(xiàng)分化能力的根本，其隨著胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸下調(diào)3。而在成體中，Oct 3/4只在A型精原細(xì)胞、睪丸生殖干細(xì)胞瘤、畸胎瘤和某些始祖干細(xì)胞中有所表達(dá)4。體細(xì)胞中并為發(fā)現(xiàn)5，6。近年發(fā)現(xiàn)的一種同源域蛋白Nanog，被認(rèn)為處于維持ES細(xì)胞自我更新的細(xì)胞外刺激、細(xì)胞內(nèi)多種因子共同參與的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)。Oct4直接作用于Nanog，以維持它在一個(gè)亞穩(wěn)定狀態(tài)的濃度，而不會(huì)讓它達(dá)到或超過穩(wěn)定狀態(tài)的水平;原本在體細(xì)胞中不表達(dá)的Nanog 基因變得高表達(dá)，提示Nanog基因的重新激活在細(xì)胞擴(kuò)增和維持細(xì)胞全能性中扮演了重要角色7。而Nanog和Oct 3/4一樣并未在成體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)過。總而言之，Oct 3/4、Nanog和nestin是負(fù)責(zé)鼠類胚胎干細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能和自我更新狀態(tài)的關(guān)鍵蛋白8。如果他們?cè)谀[瘤干細(xì)胞中扮演了相同的角色，那么這就是骨肉瘤靶向治療的重要分子生物學(xué)靶點(diǎn)。本研究也進(jìn)一步支持了實(shí)體瘤中含有極少數(shù)目負(fù)責(zé)腫瘤發(fā)生和增長(zhǎng)的腫瘤干細(xì)胞這個(gè)假設(shè)，假設(shè)腫瘤干細(xì)胞理論是正確的，那么細(xì)胞毒性的化