1、RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)步驟一、知識背景：1、基因表達(dá)：DNA k RNAProtein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因104個(gè)絲心蛋白mRN（每個(gè)mRN存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白）共合成109個(gè)絲心蛋白。因此單拷貝基因的 mRN表達(dá)水平對于其功能水平的調(diào)控是非常 重要的。2、PCR技術(shù)（Polymerase chain reaction）:即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A. 變性：通過加熱使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈 DNAB. 退火：將反應(yīng)混合液冷卻

2、至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C. 延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg廿存在下，退火引物沿 5 一卜3 方向延 伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴 RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、 依賴RNA勺DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解 RNA:DNA雜合體中的 RNA3、 依賴DNA勺DNA聚合酶活性：以第一條 DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈 cDNA.二、RT-PCR的準(zhǔn)備：1. 引物的設(shè)計(jì)及其原則：1）引物的特異性決定 PC

3、F反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至 關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA?切方式以及可能存在的 hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆 蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存 在的內(nèi)含子。2）引物設(shè)計(jì)原則的把握引物設(shè)計(jì)原則包括：a、 引物長度：一般為1530bp ，引物太短會(huì)影響 PCR的特異性，引物太長 PCR的最 適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（T

4、m值）：40%60%, PCRT增的復(fù)性溫度一般是 較低Tm值減去510度。c、3端要求：3端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G C居中間，因此引物的3端最好選用A、G C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的Tod、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或 引物自身復(fù)性。e、 引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3端不應(yīng)超過2 個(gè)。f、 同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。 g、5 端無嚴(yán)格限制：5末端堿基可以游離，但最好是 G或C,使PORT

5、物的末端結(jié) 合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如 Primer5.0 , Oligo6.0等對 于這些條件都可以自行設(shè)置。2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過 0.1%DEPC水浸泡處理，除去 RNA酶，防止操作過程中 RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活 DEPC。3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。三、RNA勺提取方法RT PCF中從細(xì)胞分離的 RNA勺質(zhì)量至關(guān)重要，包括 RNA勺純度和完整性。RNA分 離的最關(guān)鍵因素是盡量減少 RNA

6、酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì) 胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量 RNA酶。因此在提取 RNA寸，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè) 無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性 RNA酶污染和抑制內(nèi)源性 RNA酶活性，主要是采用 焦碳酸二乙酯（DEPC去除外源性 RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強(qiáng)力的蛋 白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。RT-PCR 步驟:50-*00mg組織如時(shí)旳喇生舶漿豹1滬個(gè)細(xì)胞加D8rnl些性淒，宇泵入EP菅內(nèi)履吹打10-九農(nóng)i. f1加ai ml乙s絢N甌I水館和酚,0 2ml o,充分混勻，靜置5分鐘后,t2020gX20mn屮心持上匡無魚液俯專移入

7、新EP管內(nèi)切創(chuàng)取到甲曇日色物慶（取加即可對于脂肪、瞬殳芬的組織樣品可以再加KtS遐和頸仿再提取一靈增高垣度n加萼惋決號丙醇，輕輕1T剎混勺，-20tS .3011 in4 tJ.l2000gxi0mino可看到管底部壁二有白色沉淀即為的亠拜去上濫C-.3rrl交性液和D Ml耳丙醇重翳懸世爲(wèi)淀，刨D放亀Mmig 4 t.1000gX10nmU舟吉上満，加 価I了5%乙聽，吹打島起沉謹(jǐn)室溫靜董smin可,20匸 保石）4匸7500g X 5min,笄上渚，滅菌涯紙加適軍2OUI左若DEPC處理過的水，渚解只NA匚可30匸保存：）,取2 UI稀裁50倍，于核醸蛋白測寶逆轉(zhuǎn)錄休糸的組成*DEPC處理

8、水Sul10mM dNTPs2.5ulRandom primers0.4ulRNasin0.5ul總RNA2.5 -次cDNA的合成吉3 us70C 5minn速置冰水中冷卻u再加：站逆轉(zhuǎn)錄buffer5ul逆轉(zhuǎn)錄 SS(M-MLT)lul(200U)加水至25ulfl37 C 60min901C 5min3s PCR擴(kuò)増=94匸5min94匸Imin退火溫度40 sec72匸50sec72匸丁min4匸Osec4s PCR反應(yīng)條件土29 cycles51113ul(10niM)lullul( lumoi t) lul( lumoi 1)1.5ul36.7U10 腕 K2417)50ul501

9、11PCR體糸的組成： lOxpCRbuffer Ma Cl： lOmMdNTPs sense primer antisensi? primer cDNA DEPC處理水 T呂q酶四、PCR條件的優(yōu)化=PCR條件的優(yōu)化王要是引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下 變化尋找最隹退火溫度。此外M一探度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2mM左 右.引物和模板的量等。五、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定=根據(jù)產(chǎn)物長度制作誼宜鞭度的瓊脂糰擬膠（不同長度產(chǎn)韌所需橇膠濃度）取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖潢充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖褪膠點(diǎn)樣孔中.1.0V cm電冰45 -百Omin成像糸統(tǒng)咸像分析亠分

10、離不同大小DXA片段的合適瓊脂牌報(bào)度瓊脂WR度（%）線性DNA片段的育效分蜀范圍（kb）0.51-300.70.8 - 121.00.5 - 101.20.4-71.；0,2-3六*需汪意的冋題=1. 汪意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溟優(yōu)乙錠EE）、酚、異硫氨酸肌、 案外線等2. 注意避免試劑污染3. 始終注意避免RNA酶的污染：4. 保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協(xié)調(diào)，注意實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生RNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和步驟來源：生物谷訪問量：3688評論(0)分享1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参锟俁NA非變性膠電泳的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行

11、。非變性電泳使用1.0%-1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條 件下，RNA勺泳動(dòng)率才與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測定RNA分子量時(shí)，一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總 RNA羊品完整性時(shí)，配制普通的 1%瓊脂糖凝膠即可。 rRNA （占80-85%） i8S5S植物RNAtRNA及小分子RNA （占1015%）inRNA （占1 5%）輯蝌wbbioQgR寡聚脫氧胸#（oiigodT）層析柱三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品蘑菇的總RNA溶液。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫 外透射檢測儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，0.5卩g

12、/ml溴化乙錠(EB 10X 載樣緩沖液。四、實(shí)驗(yàn)步驟(1) 用1X TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1X TAE電泳緩沖液至液面覆蓋 凝膠。(2) 在超凈工作臺上，用移液器吸取總 RNA樣品4卩l(xiāng)于封口膜上。在實(shí)驗(yàn)臺 上再加入5卩l(xiāng) 1 XTAE電泳緩沖液及1卩I的10X載樣緩沖液，混勻后，小心 加入點(diǎn)樣孔。（3）打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至100V,使RNA由負(fù)極向正極電泳，約30min 后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察 RNA電泳結(jié)果。1% DenMtudn； AKn)sc Gd of Total RNALan* LiBlfh QuuIMt T沁

13、RALaiw 3:DcpWXTim1Lam 凳葉Z刑 UARNA的變性瓊脂糖凝膠檢測試劑：（1） MOP緩沖液（10*） :0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOP）（Ph7.0）， 0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。（2） 上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍(lán)，0.4%二甲苯藍(lán)。（3）甲醛。(4) 去離子甲酰胺。v電泳槽清洗：去污劑洗干凈(一般浸泡過夜)水沖洗一一乙醇干燥一一3%H2O灌滿一一室溫放置10分鐘一一0.1%DEP(水沖洗。 操作：(1) 將制膠用具用70%L醇沖冼一遍，晾干備用。(2) 配制瓊脂糖凝膠。 稱取0.5g瓊脂糖，置干凈的100ml錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內(nèi) 加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。 待膠涼至60-70 C，依次向其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS緩沖液和0.5ul溴化乙錠，