1、    -干擾素與異搏定逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥性的研究        腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因。異搏定(VPL)是最早被發(fā)現(xiàn)可逆轉(zhuǎn)MDR的化合物，但VPL體外逆轉(zhuǎn)MDR所需濃度較高，因而限制了它在臨床中應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)選擇VPL和IFN-聯(lián)合進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，以觀察二者是否有協(xié)同作用。 材料和方法一、材料人肝癌細(xì)胞耐藥株SMMC-7721/ADM是本實(shí)驗(yàn)室對SMMC-7721長期用阿霉素誘導(dǎo)、篩選所建立的耐藥株；阿霉素為Sigma公司產(chǎn)品；柔紅霉素為Fa

2、rmitatia公司產(chǎn)品；異搏定為上海天豐藥廠產(chǎn)品；-干擾素為沈陽三生制藥股份有限公司產(chǎn)品。P-糖蛋白單克隆抗體MRK16由Dr.T.Tsuruo贈(zèng)送。二、方法(一) VPL逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM細(xì)胞藥物敏感性測定：取對數(shù)生長期SMMC-7721/ADM細(xì)胞，接種于96孔平底培養(yǎng)板中，加入不同濃度的異搏定，然后分別加入阿霉素、柔紅霉素(濃度均為1.5g/ml)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入二甲亞砜150l，終止反應(yīng)，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD值(光密度)，計(jì)算細(xì)胞存活率。根據(jù)直線回歸與相關(guān)，分析異搏定濃度的變化與細(xì)胞存活率的關(guān)系。(二) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞MDR1表達(dá)產(chǎn)物P-gp：用流式細(xì)

3、胞儀進(jìn)行膜抗原P-gp測定。分別檢測SMMC-7721、SMMC-7721/ADM、SMMC-7721/ADM+VPL細(xì)胞膜抗原P-gp表達(dá)。(三) 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)藥物濃度：將SMMC-7721/ADM與SMMC-7721細(xì)胞接種于24孔的培養(yǎng)板中，細(xì)胞分成4組：敏感組、耐藥組、VPL逆轉(zhuǎn)組、VPL與INF-聯(lián)合逆轉(zhuǎn)組。第四組加入INF-(濃度500u/ml)，其它三組無INF-，37、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，次日4組均加入柔紅霉素(1g/ml)，在加入柔紅霉素前1小時(shí)，第3、4組加入VPL(2.5g/ml)，2小時(shí)后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。結(jié)果一、異搏定對SMMC-772

4、1/ADM抗藥性的影響由表1可見，隨異搏定濃度增加，耐藥細(xì)胞的吸光度值，活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)隨著降低，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異有非常顯著性(P<0.01)。VPL處理前，0.15g/ml的阿霉素和柔紅霉素幾乎沒有殺傷SMMC-7721/ADM細(xì)胞的作用。VPL處理后，化療藥物殺傷SMMC-7721/ADM細(xì)胞的作用增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組與對照組比較：P<0.01二、異搏定與-干擾素聯(lián)合對SMMC-7721/ADM抗藥性影響由表2可見，-干擾素與異搏定聯(lián)合逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM與異搏定單獨(dú)逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM細(xì)胞比較，細(xì)胞存活率有明顯不同。ADM濃度為0.15g/ml,VPL以g/m

5、l為單位，INF-濃度為500u/ml三、異搏定逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞前后細(xì)胞表面P-gp表達(dá)流式細(xì)胞分析SMMC-7721/ADM細(xì)胞膜上P-gp熒光細(xì)胞染色率(%)為70.13，較敏感細(xì)胞有非常明顯的升高(0.65)，VPL逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM細(xì)胞后，細(xì)胞表面P-gp的表達(dá)較塑轉(zhuǎn)前有明顯降低(22.68)。四、逆轉(zhuǎn)前后細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素的比較由表3可見，耐藥細(xì)胞內(nèi)DNR積聚能力較敏感細(xì)胞明顯降低，VPL逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM后，細(xì)胞內(nèi)DNR濃度有所提高。VPL與IFN-聯(lián)合作用于SMMC-7721/ADM細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)DNR濃度進(jìn)一步提高。DNR濃度為1.5g/ml，VPL為2.5g/

6、ml，IFN-為500u/ml，P值是以SMMC-7721/ADM細(xì)胞組為對照。表1不同濃度異搏定對SMMC-7721/ADM細(xì)胞(0.15g/ml)抗藥性影響分別異搏定g/mlSMMC-7721/AMD+ADM吸光度X1活細(xì)胞(%)對照00.9410012.50.616525.00.5862310.00.4750420.00.3739表2異搏定與-干擾素聯(lián)合對SMMC-7721/ADM抗藥性影響分別SMMC-7721/ADM+INF-SMMC-7721/ADM-INF-t檢驗(yàn)吸光度活細(xì)胞數(shù)(%)吸光度活細(xì)胞數(shù)(%)t值P值A(chǔ)DM0.86±0.013910.94±0.577

7、1006.5320<0.05ADM+0.25VPL0.86±0.013870.85±0.017946.9420<0.05ADM+0.5VPL0.71±0.020760.81±0.0153868.1650<0.02ADM+2.5VPL0.29±0.056310.62±0.0305669.7756<0.02表3SMMC-7721/ADM及VPL與IFN-逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM前后細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素的比較細(xì)胞平均DNR濃度陽性細(xì)胞數(shù)(%)p值SMMC-721121097.5SMMC-7211/ADM13362.3

8、SMMC-7211/ADM+VPL16376.1<0.05SMMC-7211/ADM+VPL+-干擾素19590.6<0.005討論 為了篩選有效的抗藥逆轉(zhuǎn)劑，我們用異搏定(VPL)和-干擾素(IFN-)進(jìn)行肝癌細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究，以便為臨床提供有效的逆轉(zhuǎn)方法。一、異搏定逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM的作用VPL是一種鈣通道阻滯劑，是最早發(fā)現(xiàn)具有逆轉(zhuǎn)MDR的逆轉(zhuǎn)劑1。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著異搏定濃度增加，抗癌藥物的細(xì)胞毒性逐漸遞增，VPL對SMMC-7721/ADM的逆轉(zhuǎn)作用與VPL濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。VPL逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：SMMC-7721/ADM細(xì)胞膜P-gp表達(dá)在VPL

9、逆轉(zhuǎn)前后有顯著不同，細(xì)胞內(nèi)DNR相對濃度也不同，推測VPL與SMMC-7721/ADM細(xì)胞膜上的P-gp結(jié)合后，抑制了細(xì)胞毒藥物的外排，使化療藥物細(xì)胞內(nèi)濃度升高，細(xì)胞毒效應(yīng)增強(qiáng)。與Akihiro等的結(jié)果一致2。二、異搏定與干擾素聯(lián)合逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM的作用由于VPL的逆轉(zhuǎn)作用與本身的濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，在達(dá)到有效抑制MDR的血清濃度時(shí)，就會(huì)造成明顯的心臟毒性作用。本實(shí)驗(yàn)用異搏定與IFN-聯(lián)合逆轉(zhuǎn)MDR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入IFN-后，VPL為2.5g/ml濃度時(shí)，幾乎與VPL 20g/ml單獨(dú)逆轉(zhuǎn)時(shí)的效果相當(dāng)，VPL與IFN-二者聯(lián)合，有明顯的協(xié)同作用。Yuan等人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)IFN-單獨(dú)

10、使用不能逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對阿霉素的耐受，它可能通過對P-gp的直接作用而不是競爭P-gp上的藥物結(jié)合點(diǎn)3。對于IFN-是直接作用于P-gp，還是使VPL與化療藥物的競爭性增強(qiáng)，其機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討?？傊甀FN-毒副作用小，可降低VPL逆轉(zhuǎn)MDR的劑量，是一個(gè)有前途的耐藥逆轉(zhuǎn)劑。作者單位：210009南京鐵道醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院參考文獻(xiàn)1.Mohammad R.Abbaszadegan.Nils E.Foley.Mary C.Gleason-Guzman and William S.Dalton.Resistance to the Chemosensitizer Verapamil in a Multi

11、-drug-resistan (MDR) Human Multiple Myeloma Cell Line.Int.J.Cancer,1996,66:506-5142.Akihiro Takeshita.Kaori Shinjo.Kazunori Ohnishi,and Ryuzo Ohno.New Flow Cytometric Method for Detection of Minimally Expressed Multidrug Resistance P-Glycoprotein on Normal and Acute Leukemia Cells Using Biotinylated MRK16 and Streptavidin-RED 670 Conjugate.Jpn.J.Cancer Res,1995,86:607-6153.Yuan Kang and Roger