1、大鼠海馬腦區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子慢病毒注射與表達(dá)的檢測         11-01-28 13:45:00     編輯：studa20                    作者：張驚宇, 李金星, 孫永奇, 趙 虹, 楊子超 【摘要】  目的: 建立成年大鼠海馬腦區(qū)注

2、射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)慢病毒表達(dá)載體的方法, 并檢測BDNF慢病毒載體體內(nèi)表達(dá)目的基因的能力。方法: 健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH)、 生理鹽水組(NS) 、 GFP慢病毒注射組(GFP)和BDNF慢病毒注射組(BDNF), 每組15只。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在腦立體定位儀下定位海馬組織。NS、 GFP和BDNF組分別給予鹽水（2 L）、 GFP慢病毒（2 L）和BDNF慢病毒（2 L）, SH組只實(shí)行手術(shù)操作。注射手術(shù)7 d、 14 d 和30 d 后, 分別處死大鼠并進(jìn)行在冰上取各組大鼠海馬組織, 分別提取海馬總RNA和總蛋白質(zhì)通過RTPCR和Western blot檢測各組大鼠

3、海馬組織BDNF mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。同時通過原位雜交方法檢測BDNF的表達(dá)水平和腦區(qū)分布。結(jié)果: BDNF慢病毒注射成年大鼠7 d、 14 d和30 d 后, 均可以成功檢測到BDNF在mRNA和蛋白水平在海馬腦區(qū)都有明顯的表達(dá), 同假手術(shù)組相比具有顯著性差異; 原位雜交檢測顯示BDNF慢病毒注射成年大鼠海馬腦區(qū)7 d、 14 d和30 d 的BDNF表達(dá)水平和腦區(qū)分布均保持穩(wěn)定。結(jié)論: 成功地建立了BDNF慢病毒注射成年大鼠海馬腦區(qū)的方法, 并可在注射后不同時間段檢測到BDNF高水平的表達(dá)和均勻的海馬腦區(qū)分布, 為進(jìn)一步將其應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的治療奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】&

4、#160; BDNF; 慢病毒; 治療性基因操作; 海馬注射    Abstract  AIM:  To explore the method of injecting the BDNF gene lentiviral vector in rat hippocampus and detecting its expression. METHODS:  SD rats were randomly divided into four groups:  sham operated group(SH), normal saline g

5、roup (NS),  GFP gene lentiviral vector injection group(GFP) and BDNF lentiviral vector injection group(BDNF).The expression of BDNF was detected by Western blot,  RTPCR and situ hybridization(ISH) at day 7,  14 and 30 after the injection. RESULTS:  BDNF Gene lentiviral vector can

6、 upregulated the expression of BDNF in rat hippocampus. The result of RT PCR and Western blot detection show that the level of mRNA and the protein level was remarkably increased. The result of insitu hybridization showed the stable expression and distribution of BDNF. CONCLUSION:  Successfully

7、 established the method of injecting BDNF gene lentiviral vector in rat hippocampus and detected the high level of BDNF expression following with the time,  which lays the basis for its application in the treatment of the neurodamaged disease.    KeywordsBDNF;  lentiviral ve

8、ctor;  gene therapy;  rat hippocampus目前在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究中, 采用關(guān)鍵基因的過表達(dá)技術(shù)已成為新發(fā)展起來極有前景的治療策略?；谌祟惷庖呷毕莅Y病毒（HIV1）基礎(chǔ)上制備的慢病毒載體, 不易誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng), 毒性較低, 并可以介導(dǎo)長期而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá), 治療基因表達(dá)時間可長達(dá)6個月, 非常適用于神經(jīng)損傷修復(fù)的大鼠動物模型實(shí)驗(yàn)1, 2。本研究旨在探索建立成年大鼠海馬腦區(qū)注射腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor,  BDNF）慢病毒表達(dá)載體的方法, 并檢測BDNF

9、慢病毒載體的表達(dá)水平及其腦區(qū)分布, 探討B(tài)DNF慢病毒載體注射作為治療成年大鼠腦損傷動物模型轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)的可行性。    1  材料和方法    1.1  材料  高滴度eGFP慢病毒顆粒（2×109TU/mL）購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;  高滴度BDNF過表達(dá)的慢病毒顆粒（5×108TU/mL）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并且包裝濃縮。MAXIscript kit體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司。RNATRIzol試劑盒購自Invitrogen公司。Oligod(T)16購自上

10、海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。ECL購自Amersham公司。rabbit antiBDNF antibody (12 000)購自Santa Cruz公司; mouse antiactin (15 000)購自Chemicon公司; HRPcoupled goat antirabbit/mouse IgG (14 000)購自Amersham公司。雄性SD大鼠（250300 g, 清潔級）購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 鞘內(nèi)微導(dǎo)管購自美國Lewyston公司, 冰凍切片機(jī)購自德國Leica公司, IPP圖像分析系統(tǒng)為美國MC公司, 腦立體定位儀購自美國Stoelting公司, 熒光顯微鏡

11、購自O(shè)lympus公司。螺絲、 針線和其他手術(shù)器械購自香港友誠生物科技有限公司。生理鹽水和牙科水泥等其他常規(guī)藥品購自國藥公司。    1.2  方法    1.2.1  動物實(shí)驗(yàn)分組  正常雄性SD大鼠60只, 隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH)、 生理鹽水組(NS), eGFP慢病毒注射組(eGFP)和BDNF慢病毒注射組(BDNF), 每組15只。每個時間點(diǎn)5只動物, 分別在慢病毒注射海馬CA1腦區(qū)7 d、 14 d 和30 d 后處死動物取腦進(jìn)行切片。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在腦立體定位儀下定位海馬組織。 &#

12、160;  1.2.2  慢病毒微量注射  取正常雄性SD大鼠, 以10 g/L戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠, 將其固定于立體定位儀, 然后參照Paxinos等3的大鼠腦立體定位圖譜, 確定海馬CA1區(qū)坐標(biāo)為: 前囟后1.3 mm, 中線側(cè)旁開2.0 mm, 硬膜下4.0 mm。在此基礎(chǔ)上采用螺絲固定電極埋管的方式進(jìn)行埋管, 并將電極固定在海馬CA1坐標(biāo)位置。動物術(shù)后1周即可進(jìn)行慢病毒注射實(shí)驗(yàn)。每只鼠注射一點(diǎn)即電極固定位置, 每點(diǎn)2 L慢病毒懸液(4×106 TU病毒顆粒), 注射速度0.5 L/min, 注畢留針15 min, 并

13、以1 mm/min速度緩慢從套管中退針。對照組按上述同樣方法和坐標(biāo), 注入同樣體積的生理鹽水, 假手術(shù)組不進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn), 只完成手術(shù)電極埋管操作。    1.2.3  RTPCR檢測  深度麻醉大鼠, 斷頭, 取腦。按Invitrogen公司的RNATRIzol試劑盒操作指南進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系如下: RT產(chǎn)物2 L, 10×PCR反應(yīng)緩沖液5 L、 BDNFF引物(10 mmol/L)1 L, BDNFR引物(10 mmol/L)1 L、 GAPDHF引物(10 mmol/L)1 L, GAPDHR引物(10 mmol/L)1 L,

14、 dNTPs (10 mmol/L)1 L, 2 U Taq DNA聚合酶, 反應(yīng)體積為50 L。于94變性5 min后, 進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng), 反應(yīng)條件為94  30 s, 50  30 s, 72  50 s。BDNF基因擴(kuò)增28個循環(huán), GAPDH基因擴(kuò)增19個循環(huán), 反應(yīng)完成后, 72延伸10 min, 于15 g/L脂糖凝膠電泳觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。凝膠成像后進(jìn)行光密度掃描, 以(BDNF基因條帶光密度值/GAPDH基因條帶光密度值)×100%的值來比較各個組間的差異。RTPCR所用引物序列如下: bdnf: forward,  5CATCCAG

15、TTCCACCAGGT3; reverse,  5CCATGGGTCCGCACAGCT3。gapdh: forward,  5CCCCAATGTATCCGTTGTG3; reverse,  5CTC AGTGTAGCCCAGGATGC3。    1.2.4  Western blot檢測  深度麻醉大鼠, 斷頭, 剝離大腦以分離海馬。為了分離海馬的CA1區(qū)域, 首先將海馬切成1 mm的腦片, 然后在解剖鏡下用顯微解剖刀分離。所有的步驟都在冰的PBS中完成, 樣品保存于液氮中。準(zhǔn)備組織樣品時, 以100 mg組織/1

16、 mL預(yù)冷的RIPA緩沖液（150 mmol/L NaCl, 30 mmol/L HEPES, 10 mmol/L NaF, 10 mL/L Triton, 0.1 g/L SDS）裂解組織, 勻漿器冰上碾磨1020次后, 冰上放置30 min。將勻漿好的組織放于1.5 mL離心管中, 4, 13 000 r/min離心30 min, 取上清。取適量樣品測定蛋白濃度。測定好濃度的樣品, 按比例加入6×SDS凝膠樣品緩沖液, 100變性10 min, 備用。以150 g/L的SDSPAGE 膠進(jìn)行蛋白電泳。電泳完畢, 將玻片架從電泳槽中取出, 卸下玻片, 取出凝膠, 將濃縮膠清除, 置

17、入轉(zhuǎn)膜夾中, 將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中(按照濾紙硝酸纖維膜凝膠濾紙的順序), 0.4 A, 電轉(zhuǎn)2 h。將膜放入含50 g/L的脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉13 h。用封閉液稀釋一抗, 將已封閉的膜置入一抗溶液中, 4緩慢搖動過夜。用TBST溶液漂洗膜3次, 每次10 min。用封閉液稀釋二抗, 將已洗滌的膜置入二抗溶液中, 室溫2 h。用洗液振蕩漂洗3次, 每次10 min。取ECL(enhanced chemicoilluminenscenecs)溶液A、 溶液B各0.5 mL加入去離子水中充分混勻, 加入膜上, 置室溫中反應(yīng)5 min, 去除多余液體, 封口。在暗室中曝光X底片。膠片掃描

18、保存, 掃描照片用分析軟件ImageQuant 5.0 進(jìn)行分析, 以光密度值(A)表示各組的蛋白相對表達(dá)量。    1.2.5  BDNF原位雜交檢測  麻醉大鼠, 100 mL DEPC處理的生理鹽水和DEPC處理的150 mL 40 g/L多聚甲醛經(jīng)主動脈灌注固定。灌注固定0.5 h后, 取腦置入40 g/L多聚甲醛液中, 4后固定過夜。次日置于DEPC處理的含有150 g/L蔗糖的PBS中4沉降, 待完全沉降后再放于含有300 g/L的蔗糖的PBS中, 4沉降過夜。冰凍切片機(jī)切片后, 將腦片(厚度20 m)貼于從Fisher公司購買的原

19、位雜交專用玻片上, -70凍存。制備地高辛RNA探針, 采用線性化的質(zhì)粒DNA作為模板, 使用MAXIscript kit 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄, 產(chǎn)物-20沉淀30 min后, 4, 13 000 r/min 離心15 min, 去上清, 加入1 mL 750 mL/L乙醇漂洗, 4, 13 000 r/min離心15 min, 去上清, 將離心管倒扣于濾紙上, 干燥15 min, 以20 L DEPC處理的H2O溶解DNA, 取0.5 L樣品加入6×RNA樣品緩沖液, 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 以確定體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大小和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否完整。將已經(jīng)制備好的腦片從-70取出, 50處理30 min。將腦片放于40 mL/L paraformaldehyde/PBS中, 室溫處理10 min。PBS漂洗3次, 每次3 min。以50 g/L蛋白酶K室溫處理10 min后進(jìn)行腦片乙?；幚? PBS漂洗3次, 每次3 min。將腦片放于預(yù)雜交液中, 60, 預(yù)雜交24 h。將雜交探針加于雜交液中, 使探針濃度為4001 000     g/L , 60雜交1216 h。按下列步驟清洗雜交片, 以減少非特異性信號: 60 1×SSC溶液中洗10 min; 60 1.5 ×SSC 溶液中洗10 mi