1、通過固定化根霉屬delemar脂肪酶連續(xù)生產(chǎn)含有r-亞麻酸和辛酸的異構(gòu)脂Yuji Shimada,Masaharu suenaga,Akio Sugihara,Seiichi Nakai,and Yoshio Tominag 噢薩卡綜合技術(shù)研究學(xué)院，噢薩卡536-8553，日本，與雅士龍有限公司，噢薩卡550-0014，日本摘要： 以特定的1，3根霉屬delemar脂肪酶作為催化劑，連續(xù)酸解含有辛酸的琉璃苣油，混合物的水溶液，以此來激活固定在陶瓷載體上的脂肪酸。反應(yīng)混合物中的部分甘三酯衍生物表明，水解伴隨著酸解同時(shí)發(fā)生。通過添加不額外加水的琉璃苣油/辛酸底層混合物可完全抑制部分甘三酯的伴隨水解

2、。在30下，以4.5ml/h的流速向裝油8g固定酶載體的柱子注入琉璃苣油/辛酸底層混合物時(shí)，與甘三酯化合的辛酸含量是50到55mol%。當(dāng)通入60d后，酸解活性逐漸降低，100d后，甘油酯中的辛酸含量降到原來的73，但把流速減到3.1ml/h時(shí)，辛酸含量又會恢復(fù)到原來的水平。運(yùn)用分子蒸餾技術(shù)反應(yīng)混合物中分離酯交換油，但在蒸出物中沒有發(fā)現(xiàn)甘油酯，回收酯交換油作為殘留物（酸價(jià)2.6）。通過對酯交換油特定部位的分析表明，僅僅是琉璃苣油1，3位置的脂肪酸被置換成了辛酸。另外，通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，所有的甘油酯都含有一個(gè)或兩個(gè)辛酸，而且也有含兩個(gè)r-亞麻酸和一個(gè)辛酸的甘油酯。因此，脂肪酶對r-亞麻酸

3、的作用力很弱。關(guān)鍵詞： 酸解，連續(xù)琉璃苣油，辛酸式反應(yīng)，固定化酶，r-亞麻酸，脂肪酸，packed-bed反應(yīng)器，根霉屬delemar,異構(gòu)酶花生四烯酸，一種n-6多不飽和脂肪酸，作為與花生四烯酸cascade有關(guān)的一種地方性荷爾蒙的前體是很重要的。亞麻酸,花生四烯酸的前體也具有調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的生理功效。并且含有r-亞麻酸的琉璃苣油和夜報(bào)春花油可被用作化妝品、功能性食品和嬰兒套餐的組成成分。易被因?yàn)樵?，3位置上含有中等長度碳鏈脂肪酸的異構(gòu)酯能被粘膜細(xì)胞迅速吸收，所以一種可以生產(chǎn)含有功能性脂肪酸脂類的有效方法。以前我們曾報(bào)道過一用于種生產(chǎn)含有recosahexaenoic酸的異構(gòu)脂的方法：

4、在固定化根酶屬delemar脂肪酶的催化下，用辛酸置換金槍魚油1，3位上的脂肪酸。這種固定化的根霉屬delemar脂肪酶是專門食品加工的只作用甘油酯1，3位置的脂肪酶。運(yùn)用同樣的方法，也能有效的分別從紅花油和亞麻籽油中提出含有亞油酸和r-亞麻酸的異構(gòu)酯。這種方法脂肪酸是一種利用固定化酶催化的連續(xù)式反應(yīng)，但在工業(yè)攪拌器的攪拌下，此酶很破壞。另外，不穩(wěn)定的多不飽和不適宜長期（48h）反應(yīng)。因此，我們嘗試著用packed-bed反應(yīng)器完成這一連續(xù)式反應(yīng)。我們曾報(bào)道過用固定化根霉屬脂肪酶作為催化劑把琉璃苣油1，3位置的脂肪酸置換成辛酸。目前的論文是關(guān)于在裝有固定化脂肪酶的柱子中通過連續(xù)式反應(yīng)生產(chǎn)含有-

5、亞麻酸的異構(gòu)酯的方法和利用分子蒸餾技術(shù)從反應(yīng)混合物中提純脂類。原料及其方法油和脂肪酸 琉璃苣油是Nippon綜合化學(xué)工業(yè)有限公司給的贈品。辛酸和甘油三辛酸酯是yashiro有限公司的商品。脂肪酸活性的分析 根據(jù)以前的描述，脂肪酸活性是通過用50mmol/L KOH滴定從橄欖油釋放出的脂肪酸來測定的。在30下反應(yīng)30min，攪拌速度為50rpm。脂肪酸的單位活性定義為每分鐘釋放1umol脂肪酸所需酶的總量。固定化酶的準(zhǔn)備 根霉屬delemar脂肪酶是TS公司給的贈品。正如我們以前的論文所描述的那樣，先把50g陶瓷載體懸浮于200ml 10%的脂肪酶溶液中，邊攪拌邊緩緩加入冷的丙酮（80），然后在

6、真空中干燥沉淀物。在packed-bed反應(yīng)器中的連續(xù)式反應(yīng) 先將8g固定化酶懸浮于50ml底層混合物中（琉璃苣油/辛酸1：2，w/w），然后在注入玻璃柱中（床式容器，1.5×6.2cm）。用水溶解150ml的底層混合物（含水量，1.18%）,以4.5ml/h的流速將此溶液加入柱子中，于30激活固定化酶，然后以同樣的流速加入沒有額外加水的50ml底層混合物，以此來抑制琉璃苣油酸解時(shí)伴隨發(fā)生的水解。在同樣的條件下完成連續(xù)式反應(yīng)。間歇式反應(yīng) 根據(jù)其他地方描述的方法，反應(yīng)式在螺帽覆蓋的容器中進(jìn)行的。利用以下反應(yīng)方法激活固定化酶：將含油12g底層混合物（琉璃苣油/辛酸1：2，w/w）的反應(yīng)混

7、合物、12g水、0.48g固定化酶在30下培養(yǎng)48min，且以上每分鐘振動140次。因?yàn)槭芗せ畹拿竿瑫r(shí)催化酸解和水解，所以酶的預(yù)處理應(yīng)在12g新鮮的底層混合物中完成，不額外加水，其方法于酶的活化過程相同。重復(fù)兩次預(yù)處理，就可以抑制伴隨水解。間歇式反應(yīng)條件于預(yù)處理?xiàng)l件相同。分析 先將70ml 0.5N KOH(20%乙醇溶液)加入到5g反應(yīng)混合物中，再用10ml n-己烷提取甘三酯。以甲基化鈉作為甲基化試劑，將甘油酯中的脂肪酸在甲醇中甲基化。這些甲酯是用與以前描述的DB-23毛細(xì)管柱連接的Hewlett-Packard 5890 Plus氣象色譜儀分析的。甘三酯、甘二酯、單甘酯以及游離脂肪酸的含

8、量是用薄層色譜/火焰電離監(jiān)測器分析儀測量的，展開劑為苯/氯仿/醋酸（50：20：0.7,v/v/v）混合液。甘三酯是在與高效液相色譜儀連接的兩根octadecyl硅柱中分析的。樣品是用丙酮乙腈（1：1，v/v）混合液洗提的，洗液流速0.4ml/min,溫度40，然后用折射儀探測。再用烯丙基溴化物將樣品進(jìn)行Grignard衰解，然后分析甘三酯的特定部位，最后分離并分析1，3甘二酯餾分。油脂肪酸混合物的含水量是用Karl Fischer滴定法測定的。 分子蒸餾 分子蒸餾裝置是用來從反應(yīng)混合物移去脂肪酸的。反應(yīng)混合物是通過用辛酸連續(xù)酸解琉璃苣油得到的。結(jié)果與討論固定化脂肪酶的激活 雖然固定在陶瓷載體

9、上的根霉屬脂肪酶沒有顯示出任何的酸解活性，但可通過與含水的底層物接觸被激活。這樣就可將底層混合物的水溶液（含水量，1.18%）注入涂有固定化酶的柱子中。數(shù)據(jù)1表明了反應(yīng)混合物中的含水量以及與甘三酯化合的辛酸的含量。當(dāng)加入50ml底層混合物的水溶液后，甘油酯中的辛酸含量迅速增加并達(dá)到某一定值（50mol%）.固定化酶逐漸地吸收底層混合物中的水分，但當(dāng)加入100ml后，水分的吸收作用不易被觀察到。這段時(shí)期內(nèi)總吸水量約為0.5mL。加入50、100、150ML底層混合物時(shí)，其反應(yīng)混合物的甘油酯組成乎相同；甘三酯/甘二酯/單甘酯80:17:3,w/w/w。次結(jié)果表明，在固定化酶的激活期間，水解伴隨酸解

10、同時(shí)發(fā)生。當(dāng)加入195ml的底層混合物水溶液后，并在同樣的條件下(數(shù)據(jù).1)加入沒有額外加水的底層混合物（含水量，0.154%）。反應(yīng)混合物的含水量迅速增加到與加入50ml（總?cè)莘e，245ml）底層混合物的含水量相同的水平。從固定化酶中除去過量的水分后，甘油酯中的辛酸含量變化甚微。此外，反應(yīng)混合物中的甘油酯組成（甘三酯/甘二酯/單甘酯）是98.8:1.0:0.2,這表明伴隨水解幾乎沒有發(fā)生。通過這些結(jié)果可知，固定化酶的激活是在向裝有8g酶的柱子中加入150ml底層混合物的水溶液后才完成的，然后再加入50ml沒有額外加水的底層混合物進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)1. 固定化根霉屬delemar脂肪酶的活性。在3

11、0下，以4.5mL/h的流速將底層混合物（琉璃苣油/辛酸=1：2，質(zhì)量質(zhì)量）的水溶液加入到裝有固定脂肪酶的柱子中（8g脂肪酶；1.5×6.2cm）。在加入195ml底層混合物的水溶液后，再在同樣的條件下，將不含水的底層混合物加入到柱子中。表示以甘油酯形式存在的辛酸的含量；表示反應(yīng)混合物中的含水量。用辛酸水解琉璃苣油時(shí)底層混合物流速對其的影響 用裝油激活的固定化酶脂肪酸的柱子觀察底層混合物流速對與甘油酯化合的辛酸總量的影響。甘油酯中的辛酸含量隨著流速的降低而升高，當(dāng)流速為6ml/h時(shí)，其含量達(dá)到某一定值。表1 流速對用辛酸酸解琉璃苣油的影響a流速（mL/h）脂肪酸組成（mol%）b8:

12、016:018:018:118:218:320:122:122:4454.81.50.66.716.918.40.60.3n.d654.41.50.66.817.118.60.70.3n.d847.31.80.77.418.722.80.80.4n.d1644.62.41.09.122.222.91.30.80.33236.03.91.79.622.722.71.82.10.5毛油c_10.63.917.538.422.423.92.11.2a在30下，以不同的流速將底層混合物加入到一根裝有固定化脂肪酶的竹子中（8g脂肪酶；1.5×6.2cm）。b叢柱子流出的反映混合物中甘三酯的脂肪

13、酸組成。c毛琉璃苣油的脂肪酸組成。d未檢出。間歇式反應(yīng)式通過振動含40固定化酶的底層混合物來控制的。因?yàn)樵谶B續(xù)式反應(yīng)中用了8g固定化酶，所以連續(xù)反應(yīng)所需的200g底層混合物與間歇式的反應(yīng)時(shí)間相一致。這樣，在間歇式反應(yīng)中，4、6、8、12和32ml/h的流速分別與56、37、28、14和7h的反應(yīng)時(shí)間相一致。每種流速下甘油酯中辛酸的含量完全符合以前報(bào)道的間歇式反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程，結(jié)果表明連續(xù)式反應(yīng)式在最佳條件下發(fā)生的。固定化酶的穩(wěn)定性 根據(jù)原料與方法中描述的方法完成連續(xù)式反應(yīng)。當(dāng)?shù)讓踊旌衔镏胁患铀畷r(shí)，由于會吸收空氣中的水分，其含水量為0.03-0.16%。數(shù)據(jù)二顯示了用n-己烷提取的甘油酯中辛酸的含

14、量。60d內(nèi)，酸解活性幾乎不變，之后，活性將逐漸降低。100d后，甘油酯中的辛酸含量降到初始值的73，但當(dāng)流速降到3.1ml/h時(shí)，辛酸含量將回升到初始值。數(shù)據(jù) 2. 在連續(xù)式流動反應(yīng)中固定化酶的穩(wěn)定性。根據(jù)材料和方法中描述的方法進(jìn)行連續(xù)式流動反應(yīng)。在4.5mL/h的流動速度下反映100天，然后將流速減到3.1mL/h。從反應(yīng)混合物中除去游離脂肪酸 30到50d后，收集來自上述柱子的反應(yīng)混合物，且取1g混合物用于分子蒸餾。通過測定殘留物的酸價(jià)來判斷蒸餾是否完全（表格2）。當(dāng)在130、0.2mmHg柱的氣壓下蒸餾時(shí)，一次蒸餾油644g被分離出來，酸價(jià)為369。因?yàn)闅埩粑锏乃醿r(jià)為54，所以將蒸餾溫

15、度升至170，結(jié)果，在二次蒸餾中，又出52g，（酸價(jià)，202），但殘留物的酸價(jià)仍然是26。在195下進(jìn)一步蒸餾，使第三次殘留物的酸價(jià)降到2.6，回收率為24.8%。表2 分子蒸餾后酯交換油的純度步驟酸值回收率（%）反應(yīng)混合物a263100第一次蒸餾b36964.4第二次蒸餾c2025.2第三次蒸餾d1813.9第三次殘留物d2.624.8a從裝有固定化脂肪酶的柱子中流出的油/脂肪酸混合物。b在130和0.2mmHg真空下蒸餾。c在170和0.2mmHg真空下蒸餾。d在195和0.2mmHg真空下蒸餾。在第一、第二和第三次蒸餾物中，僅存在游離脂肪酸，沒有發(fā)現(xiàn)甘三酯、甘二酯和單甘酯。從這些結(jié)果中，

16、我們發(fā)現(xiàn)，分子蒸餾可有效地從反應(yīng)混合物中除去游離脂肪酸。用分子蒸餾純化后的酯交換油的組成 表3顯示了毛琉璃苣油和酯交換油中1（3）和2位置上的脂肪酸的組成。反應(yīng)前后2位置上的脂肪酸組成是不變的，辛酸沒有化合到2位置上，此結(jié)果表明，在固定化根霉屬脂肪酶的催化下的連續(xù)式反應(yīng)脂肪酸中，僅僅是在琉璃苣油1（3）位置上的被置換成了辛酸。酸解度估計(jì)為79，因?yàn)?2.9的辛酸被化合到了辛酸中。表3 琉璃苣油和酯交換油中1（3）和2位置上的脂肪酸的組成a脂肪酸脂肪酸組成（mol%）琉璃苣油酯交換油總數(shù)1(3)2總數(shù)1(3)28:0_52.752.8n.d.b16:010.610.6n.d1.61.50.118

17、:03.93.9n.d0.60.6n.d.18:117.512.25.36.91.75.218:238.424.414.017.43.513.918:322.46.016.419.63.216.420:13.93.80.10.70.7n.d22:12.12.2n.d.0.30.4n.d.24:11.21.10.10.1n.d.0.1a用通過降解獲得的1，3-甘二酯分析甘三至1（3）-為上的脂肪酸。從甘三酯和1，3-甘二酯的脂肪酸組成 預(yù)測推算2-位上的脂肪酸。在1（3）-位和2-位上的幾脂肪酸總數(shù)以100%計(jì)。b未檢出。毛油和酯交換油中的甘三酯組成是用高效液相色譜分析的（數(shù)據(jù)3）。酸解琉璃苣油

18、得到的甘三酯都是新的組分，它們洗提時(shí)保留時(shí)間比毛油洗提時(shí)的保留時(shí)間短。因?yàn)樵?7min時(shí)洗提出甘油三辛酸酯，所以由此說明所有的酯交換油在1（3）位置上都含有一到二分子的辛酸。為了用高效液相色譜鑒別甘三酯餾分的結(jié)構(gòu)，將個(gè)組分進(jìn)行編號（數(shù)據(jù)3）并且收集起來分析它們的脂肪酸組成。根據(jù)脂肪酸的容模比，如下所示判斷峰I到 IV的結(jié)構(gòu)：峰I，1，3辛?；?r亞麻酰基甘油；峰II，1，3辛酰基2亞油?；视?；峰III,1,3-辛?；?油酰基甘油；峰IV，含一分子辛酸和量分子r-亞麻酸的甘三酯。 數(shù)據(jù)3.毛琉璃苣油（A）和通過連續(xù)酸解(B)獲得的油的甘三酯成分。用材料和方法部分描述的方法進(jìn)行高分辨率的液相色譜分析。B圖中的峰數(shù)在文中作了描述。在一次、二次和三次蒸餾中，部分甘三酯和三辛酸甘油酯沒有被發(fā)現(xiàn)，并且在第三次蒸餾的殘留物（純化了的酯交換油）中也沒有發(fā)現(xiàn)三辛酸甘油酯。另外，在酯交換油的2位置上也沒有發(fā)現(xiàn)辛酸。所以，用固定化根霉屬脂肪酶催化的連續(xù)反應(yīng)只在1，3位置進(jìn)行，并且證實(shí)，水解、酯化、分子內(nèi)重排不是同時(shí)發(fā)