1、純化間使用指南2012汪文捷2012.11.19內(nèi)容來自羅銘師兄2009年報告細(xì)節(jié)決定成敗ÑÑ純化間使用指南以及GE 公司官方網(wǎng)站、AKTA 全自動層析系統(tǒng)進(jìn)階培訓(xùn)資料等。506純化間管理員:汪文捷205層析柜管理員:柏曉輝 純化間使用指南2012h五大層析h層析柱簡介h純化儀簡介h注意事項h附錄 純化間使用指南2012 h五大層析h層析柱簡介h純化儀簡介h注意事項h附錄 五大層析 純化間純化間使用指南2012h五大層析h層析柱簡介h純化儀簡介h注意事項h附錄 分子篩 的蛋白才可以通過分子篩進(jìn)行分離;流動相中推薦加入150mM NaCl,嚴(yán)禁使用無鹽buffer過分子篩。

2、抽濾去除固體雜質(zhì)超聲除去部分buffer 中所含氣體 下柱子:先下后上上柱子:先上后下下柱子時請務(wù)必保正與柱子連接的注射器內(nèi)要有足夠多的溶液來維持足夠的壓力。 各種分子篩柱子的分離范圍 分子篩marker (僅供參考 (僅供參考 脫鹽柱 離子交換層析柱MonoS MonoQSPFF QHP DEAE 使用離子交換柱時,先使用高鹽buffer 除去雜質(zhì)(3-5個柱體積,再使用無鹽buffer 平衡柱子(3-5個柱體積,然后上樣。若上樣體積較大,可以使用蠕動泵上樣。梯度洗脫完畢后,請再用高鹽buffer 洗3-5個柱體積,最后用低鹽buffer 平衡柱子(長期儲存buffer 參見下一頁,嚴(yán)禁直接

3、將柱子保存在高鹽中。注意:用和離子交換填料帶有相同電荷的緩沖液;用相同的離子來調(diào)節(jié)緩沖液pH ;在添加鹽后再調(diào)節(jié)pH ;在工作溫度調(diào)節(jié)pH 。強(qiáng)離子交換劑:載量在很寬的pH 范圍內(nèi)保持恒定;弱離子交換劑:載量隨pH 而變化。 SP HP & Q HP Mono S & Mono Q 疏水層析 “高鹽上樣,低鹽洗脫”第一次試驗,通用的條件:結(jié)合緩沖液:50 mM PBS pH 7.0,含有1-1.5 M硫酸銨;洗脫緩沖液:50 mM PBS pH 7.0;梯度:10-15柱體積流速:參考說明書保存:參考說明書注意:疏水層析受pH的影響較小,在pH58.5之間,蛋白和疏水填料的吸附

4、幾乎沒有變化;溫度對結(jié)合的影響很大,樣品和系統(tǒng)的溫度務(wù)必保持一致。 親和層析 鎳柱1. 金屬離子與組氨酸標(biāo)簽的親和力:Ni 2+>Cu 2+>Zn 2+>Co 2+;Ni 2+ (最常用,Co 2+ (當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)和離子的結(jié)合希望較弱時,Cu 2+ (可以和某些蛋白質(zhì)強(qiáng)力結(jié)合,并且某些蛋白只能和Cu 2+結(jié)合,Zn 2+ (和某些蛋白質(zhì)的結(jié)合比較弱,提供更有選擇性的洗脫。2. 流速不影響洗脫蛋白純度。1mL 預(yù)裝柱推薦1mL /min 。3. 上樣時,緩沖液中咪唑濃度推薦為2040 mM ,率度GST 柱:結(jié)合通常和流速有關(guān)系,低流速可以提高結(jié)合量,推薦0.3 mL /min

5、 。pH 和溫度也可能會有影響。 HisTrap GSTrap 常用預(yù)裝柱的限壓及流速設(shè)置柱型柱體積(mL 耐反壓設(shè)置(MPa 建議流速(mL /min 價格(RMB 分子篩S 75(S 2001200.5127548小分子篩S 75(S 2002410.518857大脫鹽柱530.15157343小脫鹽柱50.313478Q (SP HP /FF 50.313719/769Q (SP HP /FF 10.312290/343Mono Q (S 14117050Mini Q (S 0.8318116004注其他預(yù)裝柱限壓及流速設(shè)置請咨詢管理員,或自行查詢GE 公司凝膠選擇指南2012。注限壓超

6、過1 MPa的預(yù)裝柱只能在purifier 上使用,prime 及plus 最高限壓只能到1MPa 。 純化間使用指南2012 h h 五大層析 層析柱簡介 h h h 純化儀簡介 注意事項 附錄 AKTA Purifier 純化系統(tǒng) Buffers Injector Box Monitor Conductivity pH cience m bios amersha Fraction collector amersham e bioscienc Column Valves Outlet Valve UV Detector 3 Wavelengths amersham bioscience Pu

7、mps amers ham biosci ence ÄKTAexplorer Pump A pH/cell electrode Sample Valve Sample holder Buffer switching valve AKTA Purifier 純化系統(tǒng)局部細(xì)節(jié) pH計 電導(dǎo)儀 紫外分光光度計 AKTA Prime (Plus純化系統(tǒng) AKTA Prime (Plus純化系統(tǒng) 局部細(xì)節(jié) pH計 紫外分光光度計 電導(dǎo)儀 注：新Plus沒有配備pH計 樣品收集器AKTA Prime (Plus 純化系統(tǒng)取下轉(zhuǎn)盤時需要注意的細(xì)節(jié)向這邊扳開 轉(zhuǎn)動或取下轉(zhuǎn)盤時,請務(wù)必扳開!關(guān)于EP管

8、的小細(xì)節(jié)Prime(PlusPurifier 純化儀流路進(jìn)氣處理 儀器流路進(jìn)氣時,從此處抽水Prime / Prime Plus Purifier 純化間使用指南2012h五大層析h層析柱簡介h純化儀簡介h注意事項h附錄 預(yù)約注意事項h block時間:8:30-13:00,13:00-17:30,17:30-22:00。為了自己和他人的實驗,請勿延時0.5h以上。h為了防止分子篩進(jìn)氣,嚴(yán)禁過夜使用純化儀。h預(yù)約登記時,請將姓名(或字母簡稱,蛋白名稱,柱型, buffer(如:100mM NaCl,20mM Tris 8.0填寫完整,缺少相關(guān)信息將被視為無效預(yù)約。h請規(guī)劃好自己的實驗,嚴(yán)禁惡意

9、超額預(yù)約或預(yù)約不用。(如:下午才需要過分子篩的話,不得預(yù)約上午的block。h同時預(yù)約兩臺以上純化儀(含兩臺,請告知純化間管理員。 Buffer使用注意事項h過預(yù)裝柱用的buffer一定要經(jīng)過抽濾、超聲除氣后方可使用,放置時間較長的buffer,即使沒有長菌也請重新抽濾除氣。h過預(yù)裝柱用的buffer一定要有預(yù)留量,以防止進(jìn)氣。如過分子篩時,需要配置至少500 mL buffer(120 mL平衡+120 mL過柱子+50 mL平衡上樣環(huán)+100 mL預(yù)留量。h Buffer中如果需要加入添加劑(如:甘油、去垢劑等,請務(wù)必查閱預(yù)裝柱說明書,確認(rèn)該添加劑對柱子填料無損害后方可使用。h嚴(yán)禁在分子篩

10、上換buffer,尤其嚴(yán)禁跨越等電點(diǎn)!換buffer請使用透析、濃縮-稀釋等方法,如果不跨越等電點(diǎn),也可以使用脫鹽柱。h預(yù)裝柱在使用高鹽buffer之后,一定要在最后換回到低鹽buffer(最好是20%乙醇環(huán)境中,以保護(hù)柱子填料。(包括使用脫鹽柱時請務(wù)必等小分子峰出完再收回柱子。h純化完畢后,請將吸水管放回20%乙醇的藍(lán)蓋瓶,盡快收回自己的buffer(包括過鎳柱時使用的50mM離心管等,在純化間任何放置一天以上或者標(biāo)示信息不完整(尤其沒有姓名和buffer配方的個人buffer將隨時被清理。 其他使用注意事項h 過分子篩前,請優(yōu)化好Ni 柱洗脫條件,6mL 離心后上樣。盡量不要濃縮后上樣(避

11、免蛋白沉在柱子上或大體積上樣(影響分離效果。h當(dāng)分子篩流速1mL /min 時柱壓超過0.3MPa ,請通知純化間管理員;柱壓超過0.4MPa 時務(wù)必停止使用并通知管理員。Mono Q 和Mono S (4MPa 最大流速<0.5mL /min 時,請通知管理員。h 換柱子時,請將接頭放入專用小燒杯中;使用Q 柱,S 柱,脫鹽柱時,請妥善保管封口頭,切勿丟失。h 分子篩用完可保持原樣,但用完Q 柱,S 柱,脫鹽柱后,如之后沒有人過相同柱子,請?zhí)幚砗弥雍?換回分子篩。h如果分子篩進(jìn)氣,新手請盡快通知組長或純化間管理員;如果有經(jīng)驗,可以用30%異丙醇排氣。h205實驗室層析柜中的prime

12、 和plus 在使用完之后,請勿關(guān)閉純化儀電源,保持儀器通電狀態(tài),放置水汽在儀器電路上冷凝造成短路。在非運(yùn)行狀態(tài)不必特意關(guān)閉紫外燈,此時紫外燈默認(rèn)關(guān)閉。但平衡柱子時,為節(jié)約紫外燈,請務(wù)必保證紫外燈處于OFF 狀態(tài)。 關(guān)于去垢劑和蛋白酶h使用蛋白酶(純化蛋白酶(包括3C酶或TEV酶或是部分酶解后樣品、TEV酶切后樣品和去垢劑的同學(xué)請盡量使用貼有Ô蛋白酶”或者Ô去垢劑”標(biāo)簽的柱子。h使用蛋白酶和去垢劑的同學(xué),有義務(wù)預(yù)約1.5個block,后0.5個block請用普通buffer清洗一個柱體積以上(120-140mL。h儀器和柱子清洗1+1個柱體積(240mL以后,不會對普通蛋白

13、產(chǎn)生影響,請放心使用。 純化間使用指南2012h五大層析h層析柱簡介h純化儀簡介h注意事項h附錄506純化間保存的未開封預(yù)裝柱目錄。如有需要請在周老師或陳老師同意之后,聯(lián)系管理員開封使用。 凝膠過濾預(yù)裝柱預(yù)裝柱柱體積(ml特性/應(yīng)用數(shù)量Superdex Peptide 10/300 GL24肽/小分子1 Superdex 75 10/300 GL24蛋白/肽/核苷酸/小分子1 Superdex 200 10/300 GL24蛋白/DNA/小分子1 Superose 6 10/300 GL24蛋白/肽/寡核苷酸/核酸/多糖1HiPrep 26/60 Sephacryl S-200 HR 320蛋

14、白,如:血清蛋白(白蛋白1HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 320蛋白,如:膜蛋白和血清蛋白(抗體1HiTrap Desalting5脫鹽3 HiTrap Desalting53脫鹽2 離子交換預(yù)裝柱 預(yù)裝柱 Mini Q 4.6/50 PE Mini S 4.6/50 PE Mono Q 5/50 GL Mono S 5/50 GL HiTrap Q HP HiTrap SP HP HiTrap Q FF HiTrap SP FF HiTrap DEAE FF HiTrap CM FF HiPrep 16/10 SP XL HiTrap Capto Q HiTr

15、ap Capto S HiTrap Capto DEAE HiTrap Capto MMC HiTrap Capto adhere 柱體積(ml 特性/應(yīng)用 0.83 0.83 1 1 5 5 5 5 5 5 20 1 1 1 1 1 極高分辨/微量純化和分析 極高分辨/微量純化和分析 純化和分析 純化和分析 少量樣品純化 少量樣品純化 蛋白制備 蛋白制備 蛋白制備 蛋白制備 蛋白快速半制備 /初步分離純化 高流速/高載量 高流速/高載量 高流速/高載量 耐受高鹽，可在高鹽下吸附蛋白的弱陽離子交換柱 多位點(diǎn)/用作抗體穿透/一步吸附HCP、DNA等雜質(zhì) 數(shù)量 1 1 3 3 6 5 7 6 3

16、3 1 1 1 1 1 1 親和預(yù)裝柱 預(yù)裝柱 HisTrap HP HiTrap Chelating HP GSTrap FF GSTrap FF HiTrap NHS activated HP HiTrap Heparin HP 柱體 特性/應(yīng)用 積(ml 1 1 數(shù)量 13 預(yù)裝Ni Sepharose HP填料 未螯合金屬離子，可根據(jù)需要在柱子開 封后自行螯合Cu2+或Zn2+ GST-tag GST-tag 通過游離氨快速與親和配體結(jié)合 純化抗凝血激酶和別的凝集因子，脂蛋 白、酯酶、激素、DNA結(jié)合蛋白等 專門純化絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和類 胰蛋白酶 MBP-tag 28 2 3 1 5 1 5 5 4 5 5 HiTrap Benzamidine FF 1 MBPTrap HP 注 1 注：MBPTrap HP 暫時沒有，已經(jīng)向GE訂貨，2013年1月份到貨。 疏水預(yù)裝柱 預(yù)裝柱 RESOUCE ETH RESOUCE ISO RESOUCE PHE HiTrap Phenyl FF(LS HiTrap Phenyl FF(LS 柱體積(