1、iTRAQ蛋白組學技術(shù)平臺簡介鄧總監(jiān)manager蛋白組學個體器官組織細胞代謝物蛋白質(zhì)mRNADNA2基因組基因組學蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組學轉(zhuǎn)錄組學轉(zhuǎn)錄組代謝組代謝組學雙向電泳雙向電泳雙向凝膠電泳是將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點和分子量差異進行高分辨率分離的分析的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進行分離，是目前唯一的同時能分離。（PDQUEST成百上千種蛋白質(zhì)的工具。通過對蛋白質(zhì)雙向電泳的圖譜掃描，用相關(guān)等）進行圖譜差異分析，找到差別點。然后把差別點切出，進行脫色、酶解。最后樣品進入質(zhì)譜測試，得到質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)文件。通過搜庫可得到差別點蛋白質(zhì)的詳細。原理：1、根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點（第一向）和分子量

2、（第二向）的不同進行分離。2、電泳后根據(jù)蛋白質(zhì)的上樣量對膠進行考蘭染色、或熒光染色，然后用相關(guān)對電泳圖象進行分析。3DIGE雙向電泳DIGE雙向電泳Ettan DIGE熒光差異蛋白表達分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重熒光，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記（Cy2，Cy3，Cy5）的樣分析的品，并第一次引入了內(nèi)標的概念，極大地提高了結(jié)果的準確性，可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中，每個蛋白點都有它的內(nèi)標，并且全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學可信度達到95%以上。利用E

3、ttan DIGE技術(shù)還可以對微量（少到5g）樣本進行蛋白質(zhì)組學分析。4iTRAQiTRAQ同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)是一種新的，功能強大的可同時對四種或八種樣品進行絕對和相對定量研究的。它可以結(jié)合非凝膠串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對復(fù)雜樣本、精確性和重復(fù)性。iTRAQ的4細胞器、細胞裂解液等樣本進行相對定量研究，具有很種同位素標記試劑由種相對分子質(zhì)量分別為114、115、116和117的報告基團(reportergroup)，相對分子質(zhì)量分別為31、30、29 和28 的質(zhì)量平衡基團(balance group)以及一個相同的肽反應(yīng)標記試劑基團(peptide reactive group

4、)組成。不同的報告基團分別與相應(yīng)的平衡基團相配后，相對分子質(zhì)量均為145，即等量異位如果您想：(isobaric tag)。，Leave it to us !5(iTRAQ)iTRAQ平臺6iTRAQ操作步驟7iTRAQ操作步驟1）iTRAQ標記溶解，定量：取凍存的8組蛋白樣品，各加入40ul裂解液和2ul變性劑，振蕩混懸溶解，離心去除沉淀。用Bradford法定量，根據(jù)溶液的蛋白濃度進行調(diào)整， 使每組蛋白樣品量為40ug，體積20ul。還原，封閉：按試劑盒提供方案進行還原、封閉。酶解：向各組蛋白溶液中加入1ug胰酶，3716 h。標記：將8只標記試劑經(jīng)50ul異丙酚稀釋后與對應(yīng)樣品混合(標記

5、試劑113、114、115、116、117、118、119和121分別對應(yīng)8個樣品)，室溫放置1 加入100ul去離子水使標記物失活，混合8組樣品，凍干。h，各8iTRAQ操作步驟2）肽段分離及鑒定第一維強陽離子柱分離：相A液含10 mmolL KH2PO4和25ACN，pH 2.6；B液含10 mmol2P04、350mmolL KCI和25ACN，. 。將凍干樣品溶解于80ulA液并全部上樣。設(shè)紫外檢測波長為214 nm280nm，流速為200 uLmin。線性梯度洗脫：540 min，525B；4045 min，2580B；4550min，80B；5060 min，0B。根據(jù)峰形和時間共

6、收取15-20個梯度，真空離心濃縮后，每餾分用50ul反相液相色譜的A相溶解，量20ul。第二維反相液相色譜：相A液為5(體積分數(shù))乙腈和0.1甲酸溶液，流：05 min，上動相B液為95乙腈和0.1甲酸溶液。RPLC柱線性梯度洗脫樣；570 min，5一35B；7075 min，3580B；7580 min，80B； 8081 min，80一5B；90 min停止。質(zhì)譜鑒定：納噴霧針直接連接于反相色譜柱末端作為噴霧接口，噴霧電壓2.2kV。MS掃描范圍4001800u，一個譜圖選擇4個最強的母離子進行串級掃描，MSMS掃描范圍1002000u。所得串級質(zhì)譜數(shù)據(jù)wiff文件通過ProteinP

7、ilot 3.0檢索SwissProt數(shù)據(jù)，根據(jù)假陽性率為5。對鑒定到的蛋白質(zhì)打分，報告閾值為1.3，對應(yīng)蛋白質(zhì)的9iTRAQ結(jié)果演示-鑒定所有蛋白質(zhì)10iTRAQ結(jié)果演示-蛋白定量鑒定蛋白編號11iTRAQ結(jié)果演示-原始數(shù)據(jù)預(yù)處理ITRAQ原始數(shù)據(jù):12iTRAQ結(jié)果演示-差異蛋白篩選差異蛋白篩選:13iTRAQ結(jié)果演示-層次聚類分析層次聚類分析：所有的差異蛋白表達值首先經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換，作為層次聚類算法的輸入。其中距離(distance) 采用Euclidean distance，連接(linkage)采用average。14iTRAQ結(jié)果演示-差異蛋白共表達模式篩選K-Means聚類分析：挖

8、掘共表達趨勢的蛋白類別,揭示蛋白質(zhì)的表達變化規(guī)律，為機理研究提示尋找疾病標志物提供各時期量的參考。，也15iTRAQ結(jié)果演示-GOGO：對差異表達的所有蛋白向gene ontology數(shù)據(jù)庫的各節(jié)點。計算每個節(jié)點的基因數(shù)目，并結(jié)合整個數(shù)據(jù)庫的基因作為背景分部，對于每個節(jié)點，得到一個2x2的表格，使用超幾何分布檢驗蛋白在每個GO節(jié)點的富集或貧乏程度。16iTRAQ結(jié)果演示-Pathway分析Pathway分析：找出差異表達蛋白在生物學通路中的位置，以闡明其生物學功能以及不同蛋白之間的相互作用。把差異表達蛋白定位在生物學通路（Pathway）上后進行統(tǒng)計分析，確定差異 表達蛋白是否顯著富集某些pa

9、thway。17iTRAQ結(jié)果演示-Network分析Network分析：可以在全局的水平上直觀的反應(yīng)蛋白之間的相互，同時反映了蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的性。網(wǎng)絡(luò)中連接度高的蛋白，稱為hub蛋白。同時可以發(fā)現(xiàn)一些潛在pathway。18我們的平臺使用我們的平臺可以定性5多00達05種0蛋00白，提供中英文檢測分析報告19蛋白質(zhì)組學平臺型號廠商貨號iTRAQNano Aquity UPLC system+Q Exactive Mass spectrometerWaters +ThermoBT3000211iTRAQTriple TOF5600AB SCIEXBT3000212iTRAQ蛋白組學文章1.Cun

10、, Kun Guo et al, Identification of transaldolase as a novel serum biomarkerfor hepatocellular carcinoma metastasis using xenografted mouse mand clinic samples , Cancer Letters 313 (2011) 154166 （IF 4.8，血清樣本） GuangZhi Jin, Yan Li, et al, iTRAQ2DLCESIMS/MS Based Identification of a New Set of immunohi

11、sto chemical Biomarkers for Classification of D s lastic Nodules and Small Hepatocellular Carcinoma,J. Proteome Res. 2011, 10, 34183428（IF5.12，組織樣本） Wu Duojiao Wu,Dong Zhu, et al, Analysis of Transcriptional Factors and Regulation2 .3.Networks inPatients with Acute Renal Allograft RejectionJournal o

12、f Proteome Research 2011, 10, 175181（IF5.12，血清樣本）4.Junhua Ge, Hui Yan, et al, Changes in proteomics profile during maturation of marrowderived dendritic cells treated with oxidized lowdensity lipoproteinProteomics 2011, 11, 1893190（IF 4.42，細胞樣本）Yifeng He, Xin Wu, et al LCMS/MS Analysis of Ovarian Ca

13、ncer MetastasisRelated Proteins5.Using a Nude Mouse MJ. Proteome Res., 2010,: 1433 Zeta as a Candidate Biomarker61806190（IF5.12，囊液樣本）20我們服務(wù)過的客戶科研院校：四川大學、四川農(nóng)業(yè)大學、復(fù)旦大學、上海中大學、第二藥學院、第二、南京農(nóng)業(yè)大學、科學院城市環(huán)境研究所、科學院水生生物研究所、科學院石家莊農(nóng)業(yè)資源中心、科學院東北地理與農(nóng)業(yè)研究所、理工大學、華中農(nóng)業(yè)大學、東北農(nóng)業(yè)大學、東北林業(yè)大學、黑龍江中大學、中醫(yī)科學研究所、農(nóng)業(yè)科學院、生命科學、檢驗檢疫、遺傳所、林業(yè)大學、齊齊哈爾大學、江南大學、東南大學、南京醫(yī)科大學、南京中大學、科學院水生生物研究所、鄭州大學、天津醫(yī)科大學、重慶醫(yī)科大學、浙江大學、溫州醫(yī)學院、揚州大學、師范大學 、