1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流CHIP實(shí)驗(yàn)步驟.精品文檔.免疫共沉淀 CHIP實(shí)驗(yàn)步驟 (2012-11-28 14:29:54)轉(zhuǎn)載甲醛處理細(xì)胞-收集細(xì)胞，超聲破碎-加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合-加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀-對(duì)沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合-洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物-解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷-PCR分析。一、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎（ 第一天）1. 取出1平皿細(xì)胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養(yǎng)基共有9 ml）。2. 3

2、7孵育10 min。3. 終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5 min即可。4. 吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。5. 細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15 ml離心管中（PBS依次為5 ml，3 ml和3 ml）。預(yù)冷后2 000 rpm 5 min收集細(xì)胞。6. 倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個(gè)細(xì)胞。這樣每100 ul溶液含1×106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×106個(gè)細(xì)胞。本次細(xì)胞長得約為80%。

3、即為4×106個(gè)細(xì)胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800 ul。7. 超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s沖擊，9 s間隙。共14次。二、除雜及抗體哺育 （ 第一天）1. 超聲破碎結(jié)束后，10 000 g 4離心10 min。去除不溶物質(zhì)。2. 留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于-80。3. 300 ul中，100 ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100 ul不加抗體做為對(duì)照組；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M），65處理3 h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。4. 在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中

4、，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4顛轉(zhuǎn)混勻1 h。5. 1 h后，在4靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。6. 取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4顛轉(zhuǎn)過夜。三、檢驗(yàn)超聲破碎的效果 （ 第一天）1. 取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 ul 5M NaCl，65處理2 h解交聯(lián)。2. 分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。四、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗（ 第二天）1. 孵育過夜后，

5、每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4顛轉(zhuǎn)2 h。2. 4靜置10 min后，700 rpm離心1 min。除去上清。3. 依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4顛轉(zhuǎn)10 min，4靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。洗滌溶液：（1）low salt wash buffer-one wash（2）highsalt wash buffer-one wash（3）LiCl wash buffer-one wash（4）TE buffer-two wash4. 清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。每管加入250 ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15 min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管500 ul。5. 解交聯(lián)：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）。6. 混勻，65解交聯(lián)過夜。五、DNA樣品的回收（第三天）1. 解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37孵育1 h。2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.H