1、中圖摩孕通掘2009,25(17):181-185ChineseAgriculturalScienceBulletin生防菌株TL2的菌劑研制及大田防病試驗(yàn)洪永聰（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所，山東青島266109）摘要：以一株能在茶樹(shù)體內(nèi)內(nèi)生定殖、對(duì)茶葉斑病防病效果好的枯草芽抱桿菌（8s沮U3S泌Mis）菌株TL2為研究對(duì)象，優(yōu)化該菌株的發(fā)酵條件和生產(chǎn)工藝，篩選它的適宜助劑，測(cè)定它在大田對(duì)茶葉斑病的防病效果。結(jié)果表明：該菌株的最佳產(chǎn)阮條件為氮源（蛋白蹤）、培養(yǎng)溫度（35P）、碳源（蔗糖）、培養(yǎng)時(shí)問(wèn)（72h）、初始pH6.6和250ml裝液量（50ml）。它的最佳固態(tài)發(fā)酵工藝為象源（豆餅扮）、碳源（

2、我皮）、含水量（25ml）、接種量（4%）、培養(yǎng)溫度（35P）和初始pH7.0。篩選得到該菌劑的4種良好栽體，碳酸鈣、高嶺土、滑石粉和硅藻土等，1種良好的潤(rùn)濕分散劑，木質(zhì)素橫酸鈣，以及2種優(yōu)良的紫外保護(hù)劑，腐核酸和糊精。該菌劑（抱子粉可濕性粉劑）在田間對(duì)茶葉斑病有較好的防治效果，防效達(dá)70%以上，與對(duì)照藥劑多菌靈的防治效果相當(dāng)。關(guān)鍵詞：生防菌；枯草芽抱桿菌；茶葉斑病；菌劑；防病效果中圖分類號(hào):S435.711文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A論文編號(hào):2009-0927MicrobialInoculumofBiocontrolStrainTL2anditsEffectofProventingDiseasesinF

3、ieldHongYongcong(TeaResearchInstitute,QingdaoAgricultureUniversity,QingdaoShandong266109)Abstract：BacillussubtilisstrainTL2wasstudied,whichwasprovedtobecolonizeinsideofteaplantandhadgoodeffectofpreventingtealeavespotdiseases.Thefermentationconditions,processingtechnique,accessoryingredientandcontrol

4、effectagainstleavespotdiseasesinfieldofthisstrainweretested.Theresultindicatedthatitsoptimumconditionsofproducingantimicrobialproteinshouldbenitrogensource(peptone),cultivationtemperature(35*C),carbonsource(sucrose),cultivationtime(72h),originalpH6.6andliquidmediumvolume(50ml/250ml).Itsoptimumcondit

5、ionsofsolidstatefermentationwastestedtobenitrogensource(defattedsoybean),carbonsource(bran),moisturecontent(25ml/250ml),inoculumconcentration(4%),cultivationtemperature(35C)andoriginalpH6.6.Fourkindsofaccessoryingredient(calciumcarbonate,kaoline,talcumpowderandkieselguhr),onekindofwettingdispersants

6、(calciumlignosulphonate)andtwokindsofprotectiveagentfromUV(humicacidanddextrine),werescreened.Themicrobialinoculum(wettablepowder)wastestedtohavegoodeflectofpreventingtealeavespotdiseases(70%)inteagarden,whichwasappropriatetotheelfeetofSanmateasacontrol.Keywords：biocontrolbacteria,Bacillussubtilisle

7、avespotdiseaseoftea,microbialinoculum,effectofpreventingdisease0引言茶葉是以嫩梢為主要收獲物的經(jīng)濟(jì)作物,病蟲(chóng)害的發(fā)生和危害對(duì)茶葉的生產(chǎn)和加工造成了許多不良的影響七目前，生產(chǎn)上應(yīng)用的一些生防菌劑主要是從土壤或作物根際篩選獲得，這些產(chǎn)品存在生產(chǎn)難度大、定殖能力差、易產(chǎn)生抗性而退化、田間應(yīng)用受氣候條件影響等缺點(diǎn)很多茶園管理者對(duì)微生物農(nóng)藥缺乏全面的認(rèn)識(shí)，對(duì)微生物農(nóng)藥信心不足，微生物農(nóng)基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“殺蟲(chóng)防病1：程內(nèi)生細(xì)偏植物疫苗研究M（No.30370968）.第一作者簡(jiǎn)介：洪永聰，男，1977年出生,博士，講師，研究

8、方向：生物防治.通信地址：266109山東省青島市城陽(yáng)區(qū)長(zhǎng)城路700弓，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.Tel:053288030231.E-mail:hongyongcong.收稿日期：2009-04-30,修回日期：200995-2】藥的推廣使用需要大量的技術(shù)指導(dǎo)并加強(qiáng)宣傳力度叫針對(duì)當(dāng)前茶樹(shù)病害生物防治的研究現(xiàn)狀及茶葉農(nóng)藥殘留情況,在從茶樹(shù)葉片上分離篩選到一株能在茶樹(shù)體內(nèi)內(nèi)生定殖、對(duì)茶葉斑病防病效果好的枯草芽苑桿Bacillussublilis）菌株TL2同的基礎(chǔ)上，筆者擬優(yōu)化該生防菌株的發(fā)酵條件和生產(chǎn)工藝，并且篩選適宜的助劑，為生防茜劑的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供理論依據(jù)，測(cè)定該生防菌劑在大田對(duì)茶葉斑病

9、的防病效果，為生防菌劑的實(shí)際開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1供試菌株枯草芽泡桿菌（BacillussubtUisY株TL2,經(jīng)鑒定能在茶樹(shù)體內(nèi)內(nèi)生定殖、對(duì)茶葉斑病有較好防治效果。茶輪斑病菌（PesiQllozzia血ae）,由該課題組分離、鑒定和保存。1.1.2培養(yǎng)基內(nèi)生細(xì)鑿的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為NA或LB,分離培養(yǎng)基為NA。病原真菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基為改良PDA,產(chǎn)弛培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基。內(nèi)生細(xì)菌的拮抗性測(cè)定培養(yǎng)基為PDA。1.1.3大田試驗(yàn)地點(diǎn)分別在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)茶園、日照凱越茶廠茶園、嶗山沙子口茶園等地進(jìn)行。1.2菌株TL2液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化采用L25（56）正交表（如表1）,測(cè)

10、定碳源（含最為1%）、氮源（含品:為0.3%）、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH以及裝液量（250ml三角瓶）等6種因素對(duì)菌株TL2產(chǎn)生抗菌蛋白的影響，每種因素各取5個(gè)水平。對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)定不同處理發(fā)酵液的抗菌活性，根據(jù)結(jié)果計(jì)算出每個(gè)處理對(duì)茶輪斑病菌絲生長(zhǎng)的抑制率（%），從而優(yōu)化出菌株TL2的最佳產(chǎn)骯條件。表1菌株TL2產(chǎn)骯條件優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)方案因素碳源氮源培養(yǎng)溫度/*c培養(yǎng)時(shí)間/h初始pH250ml裝液量/ml水平1匍萄糖硫酸鉉20126.225水平2果精蛋白腺25246.650水平3庶糖胰蛋白腺3048775水平4麥芽糖酪蛋白35727.4100水平5淀粉尿素40967.8150表2菌株TL2固

11、態(tài)發(fā)醵工藝優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)方案因素碳源氫源含水tf/ml接種量/（V/m）培養(yǎng)溫度/*C初始pH水平1稻谷殼硫酸鉉151%206.2水平2米淼尿素202%256.6水平3玉米粉花生餅粉253%307水平4荻皮豆餅粉304%357.4水平5棉籽殼魚(yú)粉355%407.81.3菌株TL2固態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)化采用L25（56）正交表（如表2）,測(cè)定碳源、氮源、含水域（250ml.三角瓶）、接種量（V/m）、培養(yǎng)溫度以及初始pH等6種因素對(duì)菌株TL2活菌數(shù)的影響，每種因素各取5個(gè)水平。根據(jù)配方稱取固體發(fā)酵培養(yǎng)基原料（其中碳源和氮源的總質(zhì)量為20g）,加入自來(lái)水挽拌均勻，以“手握指縫有游離水，但滴不下來(lái)”為標(biāo)

12、準(zhǔn)。攪勻后的固態(tài)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入到250mL三角瓶中，培養(yǎng)基經(jīng)121-C滅菌30mino降溫后接種入種子菌，置37.C培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，間時(shí)拍打，使其均勻生長(zhǎng)，培養(yǎng)48L于60.C烘干、粉碎、平板菌落技術(shù)法測(cè)定不同處理的活菌數(shù)（億個(gè)龜）。1.4菌株TL2的助劑偉選設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)（因素水平如表3）,測(cè)定載體、潤(rùn)濕分散劑以及保護(hù)劑等3個(gè)因素對(duì)菌株TL2拖子粉的影響。將新鮮抱子粉與各種載體、各種潤(rùn)濕分散劑和各種保護(hù)劑分別按1：10、5：1和50：1的比例混合均勻，對(duì)照為不加助劑的新鮮抱子粉。室溫放置2天后，稱取1g的混合物，平板菌落技術(shù)法測(cè)定不同處理的活菌數(shù)（億個(gè)/g）。以上每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)分析利

13、用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行，采用LSD法對(duì)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，比較同因素不同處理之間及與對(duì)照的差異顯著性,數(shù)值采用平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。1.5生防菌劑的大田防治試驗(yàn)在茶葉斑病發(fā)病初期，在3個(gè)大田地點(diǎn)分別設(shè)置生防區(qū)、藥劑對(duì)照區(qū)和空白對(duì)照區(qū)3個(gè)處理，每區(qū)大小為0.13.20hm生防菌菌劑以1000倍兌水稀釋噴霧，對(duì)照藥劑多菌靈按500倍兌水稀釋噴霧。噴施表3菌株TL2弛子粉助劑篩選的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案水平我體潤(rùn)濕分散劑保護(hù)劑1碳酸鈣十二烷基硫酸鈉（SDS）甲基纖維素2高嶺土凈洗劑（LS）腐植酸3白炭黑十二烷基苯碩酸鈉（ABS）糊精4滑石粉木質(zhì)素橫酸鈣熒光素鈉5硅藻上二丁基蔡橫酸鈉（BX）黃原膠6皂土木

14、質(zhì)素橫酸鈉CMC-Na時(shí)間選在下午45時(shí)進(jìn)行，應(yīng)保證噴后24h無(wú)雨，否則試驗(yàn)應(yīng)視為無(wú)效。試驗(yàn)均在同等茶園正常的肥水管理下進(jìn)行，田間最高溫度在2533C間。在綜防區(qū)內(nèi)禁用其它任何土壤殺細(xì)菌劑。綜防區(qū)統(tǒng)一于對(duì)照發(fā)病盛期，按茶葉斑病調(diào)查的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抽樣調(diào)查，需同時(shí)調(diào)查全部的對(duì)照及化學(xué)藥劑對(duì)照，生防區(qū)的調(diào)查面積不得少于對(duì)照區(qū)。調(diào)查時(shí)，以發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，計(jì)算病情指數(shù)以及防治效果（）。2結(jié)果與分析2.1菌株TL2的液態(tài)發(fā)酵條件菌株TL2對(duì)茶輪斑病抑菌率的正交統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）表明：試驗(yàn)的6種因素中極差A(yù)值從大到小依次為，氯源（39.8）、培養(yǎng)溫度（34.3）、碳源（32.8）、培養(yǎng)時(shí)間（30.1）、p

15、H26.9和裝液量（12.3）,這一結(jié)果說(shuō)明影響菌株TL2抗菌蛋白產(chǎn)量的因素作用大小依次為：氮源、培養(yǎng)溫度、碳源、培養(yǎng)時(shí)間、pH值和裝液量從各水平的統(tǒng)計(jì)A值比較來(lái)看，菌株TL2的最佳產(chǎn)酶條件應(yīng)為：氮源（蛋白豚）、培養(yǎng)溫度（35C）、碳源（蔗糖）、培養(yǎng)時(shí)間（72h）.pH6.6和250ml裝液量（50ml）。2.2菌株TL2的固態(tài)發(fā)酵工藝菌株TL2活菌數(shù)的正交統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（表5）表明：試驗(yàn)的6種因素中極差&值從大到小依次為：氮源（133.74）、碳源（34.74）、含水量（33.40）、接種量（30.62）、培養(yǎng)溫度（24.08）和初始pHO.2258。因此，影響菌株TL2固態(tài)發(fā)酵工藝的因素作用

16、由大到小依次為：氮源、碳源、含水量、接種量、培養(yǎng)溫度和初始pHo從各水平的統(tǒng)計(jì)A值比較來(lái)看，菌株TL2的最佳固態(tài)發(fā)酵工藝應(yīng)為：氮源（豆餅粉）、碳源（缺皮）、含水量（25ml）、接種最（4%）、培養(yǎng)溫度（35C）和初始pH7.0o表4菌株TL2抑菌率（%）的正交統(tǒng)計(jì)結(jié)果因素碳源氯源培養(yǎng)溫度/C培芥時(shí)間/b初始pH250ml裝液址/ml水平1葡萄挺硫酸鉉20126.225水平2果糖蛋白腺25246.650水平3蔗糖胰蛋白豚3048775水平4麥芽精酩法白35727.4100水平5淀粉尿素40967.8150A154.027.038.143.632.846.7A246.566.735.133.059

17、.654.2A367.853.935.149.555.850.8A439.256.969.563.144.548.8A535.038.064.653.149.841.9極差R32.839.834.330.126.912.32.3菌株TL2的助劑篩選不同助劑對(duì)菌株TL2弛子粉活力影響的方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果（表6）顯示：皂土、白炭黑與對(duì)照存在顯著性差異,特別是白炭黑的弛子粉活菌數(shù)明顯低于對(duì)照，說(shuō)明其對(duì)弛子活力的傷害較大；而碳酸鈣、高嶺土、滑石粉和硅藻土等4種處理的活菌數(shù)與對(duì)照沒(méi)有顯著性的差異，可以考慮作為制劑的載體。十二烷基硫酸鈉、凈洗劑、十二烷基苯磺酸鈉、二丁基荼磺酸鈉和木質(zhì)素磺酸鈉等5種潤(rùn)濕分散劑

18、的處理，活薄數(shù)與對(duì)照存在顯著性差異，說(shuō)明它們對(duì)勉子活力都有可能造成傷害；而木質(zhì)素磺酸鈣處理后的活菌數(shù)與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，對(duì)勉子活力無(wú)明顯的影響，可以考慮作為制劑的潤(rùn)濕分散劑。在紫外照射下，甲基纖維素、熒光素鈉、黃原膠和CMC-Na等4種保護(hù)劑對(duì)抱子活表5菌株TL2,固體發(fā)酵活菌數(shù)（億個(gè)/g）的正交統(tǒng)計(jì)分析因素碳源敏源含水量:/ml接種e/V/m)培養(yǎng)溫度/C初始pH水平1稻谷光硫酸鉉15!%206.2水平2米糠尿素202%256.6水平3玉米粉花生餅粉253%307水平4缺皮豆餅粉304%357.4水平5棉籽殼魚(yú)粉355%407.8A185.1618.42118.9692.5495.38116

19、.62A2108.501)7.1689.0296.76110.6694.78A3106.30126.28122.42120.78111.26117.36A4119.90152.16101.82123.16119.46103.72A5115.60121.44103.24102.2298.70102.98極是R34.74133.7433.4030.6224.0822.58表6不同助劑對(duì)菌株TL2弛子粉活菌數(shù)（億個(gè)/g）的影響水平載體潤(rùn)濕分散刑保護(hù)劑165.84.4a33.8士10.5c86.7】.0b26L65.8a51.8*3.5be106.314.0a335.5M.4b5O.35.ObH8.(

20、H：18.7a48l.912.4a67.63.9a77.04.6c576.29.1a31.02.0c90.79.3b651.85.2b51.36.5be79.3l3.7bcCK80.35.4a70.73.6aH0.0ti3.1a表7三試點(diǎn)兩年示范推廣生防菌劑對(duì)茶葉班病的防治效果姓理青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)茶園日照凱越茶廠茶園嶗山沙子口茶園病情指數(shù)防治效果/%病情指數(shù)防治效果/%病情指數(shù)防治效果/%生防區(qū)6.383.27.9739.971.1藥劑對(duì)照區(qū)5.984.21162.56.880.1空白對(duì)照區(qū)37.5/29.3/34.2/力影響與對(duì)照呈現(xiàn)顯著差異；而腐植酸和糊精處理的活菌數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著差異，說(shuō)明

21、它有效地保護(hù)弛子免受紫外光的傷害，可以考虐選用它們作為制劑的紫外保護(hù)劑。2.4菌株TL2對(duì)茶葉斑病的大田防治效果在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)茶園、日照凱越茶廠茶園、嶗山沙子口茶園等地利用生防菌劑對(duì)茶葉斑病進(jìn)行了大田防治試驗(yàn)，結(jié)果（表7）表明：生防菌劑對(duì)茶葉斑病有較好的防治效果，防效達(dá)70%以上，與對(duì)照藥劑多菌靈的防治效果相當(dāng)。3小結(jié)與討論通過(guò)液體發(fā)酵條件優(yōu)化，得出生防菌的最佳產(chǎn)骯條件為氮源（蛋白豚）、培養(yǎng)溫度（35C）、碳源（蔗糖）、培養(yǎng)時(shí)間（72h）、pH6.6和250ml裝液量（50ml）。通過(guò)固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化，得出生防留的最佳固態(tài)發(fā)酵工藝應(yīng)為:氮源（豆餅粉）、碳源（荻皮）、含水量（25ml）、接種量（4%）、培養(yǎng)溫度（35C）和初始pH7.0。通過(guò)助劑篩選，得到生防菌制劑的4種良好載體，碳酸鈣、高嶺土、滑石粉和硅藻七等，1種良好的潤(rùn)濕分散劑，木質(zhì)素磺酸鈣，以及2種優(yōu)良的紫外保護(hù)劑，腐植酸和糊精。生防菌劑的大田試驗(yàn)表明，抱子粉可濕性粉劑對(duì)茶葉斑病有較好的防治效果，防效達(dá)70%以上,與對(duì)照藥劑多菌靈的防治效果相當(dāng)。進(jìn)一步加強(qiáng)與生物農(nóng)藥企業(yè)的開(kāi)發(fā)