1、化濁行血湯含藥血清血管內(nèi)皮保護作用及其體內(nèi)給藥時效差異的研究        【摘要】  目的觀察化濁行血湯含藥血清對缺氧內(nèi)皮細胞的保護作用，以及其藥理作用與動物灌胃給藥的量-時效關(guān)系。方法以化濁行血湯不同給藥方案、藥后不同取血時間所得的藥物血清為受試對象，培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞，進行缺氧復氧實驗，復氧同時給予不同化濁行血湯含藥血清干預，采用MTT法觀察不同含藥血清對缺氧內(nèi)皮細胞活性的影響。結(jié)果含藥血清各組與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。給藥后不同時間取血所獲得的藥物血清對缺氧內(nèi)皮細胞活力的影響存在

2、一定差異，以2次/d灌胃連續(xù)3 d，并在末次灌胃90 min后取血所得藥物血清藥理效應最佳。結(jié)論化濁行血湯含藥血清具有保護缺氧內(nèi)皮細胞的作用，其血清藥效與動物給藥方法存在一定時效關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  化濁行血湯； 內(nèi)皮細胞； 血清藥； MTT法中藥復方進入體內(nèi)后，不同劑量的藥物其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄不同，血藥濃度達峰時間和起效時間亦有較大差異。為研究中藥復方化濁行血湯對內(nèi)皮缺氧損傷的保護作用，本實驗采用MTT法觀察化濁行血湯含藥血清對內(nèi)皮細胞抗缺氧能力的影響，并據(jù)此篩選出合適的含藥血清濃度用于后續(xù)內(nèi)皮缺氧損傷的研究。1  材料與儀器1.1  對象雄性Sp

3、rague-dawley大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，購于山東中醫(yī)藥大學動物中心，符合國家二級實驗動物標準；人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（hUVECs，購自山東省醫(yī)學院，自美國組織培養(yǎng)庫ATTCCCRI1998引進）。1.2  試劑1640培養(yǎng)基（GIBCO公司產(chǎn)品）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司產(chǎn)品）；四氮唑藍(美國SIGMA)；二甲基亞砜(北京世紀銀豐科技有限公司)。1.3  儀器 JJT-1300超凈工作臺（北京半導體設(shè)備一廠）；5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（Forma Scientific 公司）；倒置相差顯微鏡（美國AO Sientific Instrument

4、；酶標儀）；EL340I 全自動酶標儀（美國Biotok公司產(chǎn)品）。2  方法2.1  藥物的配制和含藥血清的制備化濁行血湯由荷葉、焦山楂、決明子、赤芍、酒大黃、路路通、虎杖、何首烏，制水蛭粉組成（全部藥材來源于山東中醫(yī)藥大學附屬），為水煎醇沉工藝制作浸膏，4貯存?zhèn)溆谩?#160;   取SD大鼠按8.25 g/kg灌服化濁行血湯。中藥A組大鼠按照每日灌胃兩次連續(xù)3 d，中藥B組大鼠按照灌胃1次/d，連續(xù)5 d，空白組灌服等量生理鹽水，末次給藥前禁食12 h，給藥后30，60，90，150 min腹主動脈取血，分離血清并滅活、過濾除菌，置20保存?zhèn)溆谩?

5、.2  內(nèi)皮細胞體外缺血、缺氧模型的建立和實驗分組選擇生長良好的內(nèi)皮細胞，以5×104/ml 密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分為正常對照組、模型組及藥物（缺氧）各劑量組進行缺血、缺氧造模及干預。 正常組：換1640培養(yǎng)基（1640 90%，正常大鼠血清10%），并始終在正常條件下培養(yǎng)。模型組：以2006年葉武等1報告的方法稍加改進。缺氧時先將缺氧罐（由干燥皿改裝）提前10 min充入氮氣（流速4.5 Lmin），以保證缺氧罐內(nèi)氣體的純度，罐周邊封凡士林密閉，然后置于37生化培養(yǎng)箱中，備用。將培養(yǎng)板中內(nèi)皮細胞換缺氧無血清1640培養(yǎng)基（用前預先向培養(yǎng)基通入氮氣3 min

6、）；將其放入缺氧罐內(nèi)。缺氧6h后，將培養(yǎng)液換為含10正常大鼠血清的1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中（空氣+5%CO2）繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后進行檢測。中藥各劑量組：造模同模型組，缺氧6 h后，將培養(yǎng)液換成含10SD大鼠藥物血清的1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中（空氣+5% CO2）繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后進行檢測。2.3  四氮唑藍(MTT)檢測各組內(nèi)皮細胞兩次，各加入1640 100 l，MTT 15 l，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100 l，終止反應。振蕩器振蕩10 min，全自動酶標儀490 nm波長，空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度（OD）值。2.

7、4  統(tǒng)計學處理使用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計。組內(nèi)差異采用t檢驗，組間差異采用多因素方差分析，F(xiàn)檢驗(Avon)。1         3  結(jié)果3.1  各組內(nèi)皮細胞形態(tài)特征變化鏡下觀察正常組內(nèi)皮細胞展開貼壁，形態(tài)無明顯改變。體外模擬缺氧6 h后模型組內(nèi)皮細胞回縮，間隙變大，變圓細胞增多，常規(guī)培養(yǎng)18 h后大量內(nèi)皮細胞變圓并呈團漂浮，折光性增強。中劑量中藥各組鏡下觀察缺氧并經(jīng)含藥血清干預后也可見細胞回縮，部分細胞變圓并漂??；但各組仍見貼壁的內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯多于模型組，漂浮變圓細胞明

8、顯少于模型組。3.2  各組內(nèi)皮細胞缺血缺氧后細胞活力的比較（MTT實驗）結(jié)果見表1。表1  10化濁行血湯含藥血清對缺氧內(nèi)皮細胞MTT比色實驗的影響（略）4  討論4.1  化濁行血湯含藥血清的對缺氧復氧內(nèi)皮細胞的保護作用王新陸教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗，以“血濁”立論，創(chuàng)立清化血濁法中風，并據(jù)此組方化濁行血湯?；瘽嵝醒獪珊扇~、焦山楂、決明子、赤芍、制水蛭、酒軍、路路通、虎杖、何首烏組成。動物實驗研究表明，化濁行血湯能明顯改善MCAO大鼠缺血再灌注后的神經(jīng)功能損傷、減小缺血再灌注腦損傷的體積，該治療作用與其對腦血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞的保護作用有關(guān)。本實驗

9、建立血管內(nèi)皮細胞缺血再灌注模型，利用化濁行血湯含藥血清進行干預，以MTT評價內(nèi)皮細胞缺氧損傷變化。MTT在活細胞線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶作用下還原成一種藍紫色結(jié)晶并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細胞數(shù)量成正比。實驗研究證明缺氧復氧后內(nèi)皮細胞活力明顯下降并伴有顯著地形態(tài)學異常，而化濁行血湯含藥血清能顯著提高缺氧復氧后內(nèi)皮細胞的活力且形態(tài)學改變較小。提示該方具有明顯的血管內(nèi)皮細胞保護作用。4.2  化濁行血湯含藥血清藥效與動物體內(nèi)給藥有一定的時效關(guān)系中藥血清藥研究表明，含藥血清的時效主要與動物的給藥時間和取血時間有關(guān)。由于不同中藥復方成分

10、很大差別，給藥后的峰值出現(xiàn)的時間亦有較大差別。血清中確切的藥效成分并不清楚時，應利用藥效為指標行“時效關(guān)系”研究，以評判最佳給藥時間和取血時間。嚴格地說，應該根據(jù)藥物半衰期給藥，連續(xù)57個半衰期達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，但由于中藥及其復方成分復雜，半衰期很難測定，我們按照化濁行血湯為半衰期12 h設(shè)定每日灌胃兩次連續(xù)3 d給藥方案A，按照化濁行血湯為半衰期12 h設(shè)定每日灌胃1次連續(xù)6 d給藥方案B，結(jié)果表明兩種方案獲得含藥血清無明顯差別。如果對藥物血清時效關(guān)系進行研究，應另當別論。    實驗動物學研究表明，大鼠一般灌喂給藥后12 h后血藥濃度達到峰值，此時的血清為機體功能狀態(tài)血清，最好能通過預實驗來確定最佳血時間，我們在本研究中設(shè)立了灌喂后30，60，90，150 min 4個采血時間點。結(jié)果表明，化濁行血湯含藥血清血管內(nèi)皮保護作用與大鼠取血時間有一定的時效關(guān)系，給藥后藥效逐漸增強，灌喂后90 min藥效最明顯，150 mim時藥效已有下降的趨勢，提示灌喂后90 min所得含藥血清藥物濃度最高，具有最佳的藥理效果。    總之，我們的研究表明，化濁行血湯含藥血清對缺氧血管內(nèi)皮細胞的具有明顯保護作用，