1、    凋亡對腫瘤細(xì)胞表面抗原活性的影響        摘 要 通過以常規(guī)免疫法和削減免疫法分別制備抗B凋亡細(xì)胞相關(guān)抗原的抗體Ab1和Ab1a，以ELISA法檢測抗原抗體反應(yīng)，觀察腫瘤細(xì)胞在凋亡過程中表面相關(guān)抗原活性的變化及新抗原的表達(dá)。結(jié)果顯示Ab1與B凋亡及非凋亡細(xì)胞的表面相關(guān)抗原均有較強(qiáng)反應(yīng)，而Ab1a只與凋亡細(xì)胞表面抗原反應(yīng)較強(qiáng)。由此可證明腫瘤細(xì)胞在凋亡過程中表面相關(guān)抗原活性并未明顯降低，同時有新的抗原分子表達(dá)。關(guān)鍵詞 B細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 相關(guān)抗原 削減免疫法中號 R7

2、30.3 INFLUENCED IMMUNOCOMPETENCE OF TUMOR CELL-ASSOCIATED SURFACE ANTIGENS BY INDUCING APOPTOSISZhang Jin，Wang Dechang（Institute of Cancer，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021）Abstract To determine immunocopmetence of apoptotic B cell-associated surface antigens （Ag1） and find new anti

3、gens expressed during cell apoptosis，the routine immunization and subractive immunization techqnique were individually used to prepare polyclonal antibodies（Ab1 and Ab1a）against Ag1，and the antibodies response to antigens was determinded by ELISAAb1 reacted strongly both with Ag1 and non-apoptotic B

4、 cell-associated surface antigens（Ag2），but Ab1a only reacted strongly with Ag1The immunocopmetence of tumor cell-associated surface antigens did not evidently fall during apoptotic response and new antigens expressed were foundKey words B cell，Apoptosis，Associated antigens，Subtractive immunization從細(xì)

5、胞凋亡的角度探討腫瘤治療途徑已成為近年來的熱點。研究表明：諸多哺乳類基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，它們通過自身所編碼的蛋白而發(fā)揮誘導(dǎo)或抑制凋亡的作用，每一過程都會產(chǎn)生特定的分子表達(dá)1。通過研究其分子調(diào)控機(jī)制，將對有計劃地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生重要的指導(dǎo)作用。腫瘤細(xì)胞表面抗原是腫瘤免疫的前提和基礎(chǔ)之一，宿主的免疫系統(tǒng)通過識別這類抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，攻擊并排除腫瘤細(xì)胞。觀察腫瘤細(xì)胞凋亡過程中表面相關(guān)抗原活性的變化及是否有新的抗原表達(dá)，對細(xì)胞凋亡分子調(diào)控機(jī)理及腫瘤免疫的研究具有一定的意義。本實驗通過制備B凋亡細(xì)胞相關(guān)抗原的多克隆抗體，對其表面抗原的免疫活性進(jìn)行了初步研究。1 材料與方法1.1 凋亡細(xì)胞的誘導(dǎo)

6、及分離 參照文獻(xiàn)2方法，B細(xì)胞株（醫(yī)科院藥物所藥理室），以含10小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（Gibco公司），37°C，5CO2培養(yǎng)細(xì)胞生長至對數(shù)期，換用含5乙醇的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8h，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。按文獻(xiàn)3方法以Percoll（Sigma公司）非連續(xù)性密度梯度法離心純化，于1.075gml層收集凋亡細(xì)胞。1.2 相關(guān)抗原的制備 將凋亡細(xì)胞勻漿后離心10 000rmin 15min，取上清加入分子量通透上限為10 000的透析袋中，4°C下每隔4h換水1次，3次后過夜，作為B凋亡細(xì)胞相關(guān)抗原（Ag1）。以非調(diào)亡B細(xì)胞同法制備其相關(guān)抗原（Ag2）。1.3 常規(guī)法制備凋亡細(xì)

7、胞抗體（Ab1） 雄性新西蘭兔，體重23kg。Ag1（05mgkg）加福氏完全佐劑于背部皮下多點注射，后每隔10d加強(qiáng)免疫1次共3次，劑量方法同前并測定抗體效價，第40d殺兔收集血清。另外Ag2同法制備非凋亡細(xì)胞抗體（Ab2）。1.4 削減免疫法制備凋亡細(xì)胞抗體（Ab1a） 參照文獻(xiàn)4方法用Ag2對動物做基礎(chǔ)免疫后，于15min、24h、和48h腹腔注射環(huán)磷酰胺100mgkg（上海華聯(lián)制藥有限公司）。2周后再以Ag1按常規(guī)法制備抗體。1.5 抗原的檢測 以細(xì)胞為抗原包被，在96孔板中加入0001多聚賴氨酸（Sigma公司），4°C過夜后棄去。將凋亡及非凋亡細(xì)胞分別以2×10

8、6ml向每孔加入0.1ml，離心500rmin 5min，棄上清再加入0.1ml預(yù)冷至4°C的0.05戊二醛（北京化工廠），4°C置5min，PBS洗3次加入封閉液備用。其他按常規(guī)ELISA方法進(jìn)行。2 結(jié)果將Ab1、Ab1a和Ab23種抗體分別與Ag1和Ag2進(jìn)行免疫反應(yīng)，ELISA檢測結(jié)果見1?？梢钥闯觯撼Ｒ?guī)免疫法制備的抗體Ab1和Ab2與Ag1和Ag2產(chǎn)生較強(qiáng)的交叉免疫反應(yīng)；而以削減免疫法制備的Ab1a與Ag1的反應(yīng)明顯強(qiáng)于Ag2。1凋亡與非凋亡B細(xì)胞表面抗原抗體反應(yīng)Fig 1Reaction of apoptotic and non-apoptotic B cell

9、-associated surface antigens with their antibodies3 討論細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的根本區(qū)別在于細(xì)胞死亡過程中超顯微結(jié)構(gòu)變化不同并伴有新的蛋白質(zhì)合成5。凋亡的過程是程序化的，是多基因調(diào)控的，其表面相關(guān)抗原的表達(dá)也將受到影響。本實驗以凋亡與非凋亡B細(xì)胞相關(guān)抗原分別制備多克隆抗體，由于細(xì)胞勻漿制備的抗原除來源于細(xì)胞膜外還可能來自胞漿或細(xì)胞其他成分，為顯示細(xì)胞表面相關(guān)抗原的活性并排除干擾，故以凋亡和非凋亡細(xì)胞為抗原與制備抗體進(jìn)行交叉免疫反應(yīng)。結(jié)果表明：B細(xì)胞在凋亡過程中，其表面抗原免疫活性并未明顯減弱。但僅據(jù)此尚無法確定其分子表達(dá)的性質(zhì)，因為參與凋亡調(diào)控的

10、基因表達(dá)多為瞬時的且表達(dá)強(qiáng)度不大1。以常規(guī)法制備的抗凋亡細(xì)胞相關(guān)抗原的抗體與非凋亡細(xì)胞抗體有很大共性，使其無法確認(rèn)凋亡細(xì)胞有無新的抗原分子表達(dá)。為此，我們采用了削減免疫法（Subtractive Immunization），即以非凋亡細(xì)胞抗原免疫動物，然后用免疫抑制劑環(huán)磷酰胺殺傷被非凋亡細(xì)胞抗原激活的B細(xì)胞使其產(chǎn)生免疫耐受，再以凋亡細(xì)胞抗原進(jìn)行免疫。這樣就排除了非凋亡細(xì)胞抗原的干擾，使動物只產(chǎn)生凋亡細(xì)胞所獨有的相關(guān)抗原的抗體，而這種抗原應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程中新的分子表達(dá)所產(chǎn)生的。結(jié)果以該法制備的抗體與凋亡細(xì)胞表面抗原反應(yīng)強(qiáng)烈；而與非凋亡細(xì)胞表面抗原反應(yīng)微弱。由此可以證實：腫瘤細(xì)胞在凋亡過程中表面相

11、關(guān)抗原有新的分子表達(dá)，而使其免疫活性得以保持。這對于腫瘤免疫及凋亡細(xì)胞相關(guān)基因的研究均有一定意義。然而，就其細(xì)節(jié)及影響因素而言，如：表達(dá)開始的時相、凋亡的不同階段對表達(dá)的影響、新分子表達(dá)的種類與數(shù)量等還有待于進(jìn)一步探討。第一作者：男，40歲，大學(xué)，副研究員 作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所 北京 100021參考文獻(xiàn)1  何鳳田，朱錫華.程序性細(xì)胞死亡的哺乳類基因調(diào)控.免疫學(xué)雜志，1996，12：712  Lennon SV，Martin SJ，Cotter TGDods-dependent induction of apoptosis in human trumor cell lines by widely diverging stimuliCell Prolif，1991，24：2033  Martin SJ，Lennon SV，Bonham AB，et alInduction of apoptosis （programmed cell death）in human leukacmic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesisJ Immunol，1990，145：18594  Williams CV，