1、 濕熱滅菌工藝驗(yàn)證方案山東鑫科生物科技有限公司目錄1. 引言32. 滅菌設(shè)備和公用系統(tǒng)的測試3 2.1 滅菌柜特性3 2.2 滅菌介質(zhì)4 2.3 容器類別4 2.4 設(shè)備壓力表、安全閥等合格證5 2.5 其他合格證見附圖53. 空熱載和熱穿透實(shí)驗(yàn)6 3.1 滅菌工作程序6 3.2 滅菌對象6 3.3 驗(yàn)證目的6 3.4 實(shí)驗(yàn)過程63.4.1 滅菌柜準(zhǔn)備階段63.4.2 操作步驟73.4.3 熱載實(shí)驗(yàn)73.4.4 培養(yǎng)液在滅菌柜內(nèi)的排放73.4.5 探頭在滅菌室內(nèi)的排放83.4.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果9 3.5 熱穿透試驗(yàn)3.5.1 驗(yàn)證步驟3.5.2 合格標(biāo)準(zhǔn)3.5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果103.5.4 結(jié)果分析

2、4. 生物指示劑實(shí)驗(yàn) 4.1 生物指示劑說明 4.2 生物指示劑實(shí)驗(yàn)步驟 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4.4 驗(yàn)證合格標(biāo)準(zhǔn) 4.5 結(jié)果分析及評價 4.6 偏差及評估意見5.附圖 1. 引言 概述本公司采用張家港市環(huán)宇制藥設(shè)備有限公司生產(chǎn)的MQS0.25型滅菌柜，張家港市環(huán)宇制藥設(shè)備有限公司始建于2001年，是國內(nèi)滅菌柜設(shè)計制造領(lǐng)域的佼佼者，公司擁有D1、D2壓力容器制造許可證，醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證，通過了ISO9001質(zhì)量管理體系認(rèn)證，所生產(chǎn)的各種消毒滅菌設(shè)備涵蓋了制藥、醫(yī)療、生物、食品等領(lǐng)域，符合國家GMP驗(yàn)證和特種設(shè)備安全監(jiān)察、衛(wèi)生防疫等部門的相關(guān)要求。本公司主要對瓶裝液體培養(yǎng)基進(jìn)行消毒，該滅菌

3、柜采用飽和蒸汽的方式進(jìn)行滅菌，該設(shè)備廣泛適用于制藥、醫(yī)療、科研等行業(yè)對生物制品、醫(yī)療器械、無菌衣物、工器具、器皿、培養(yǎng)基等物品的高溫滅菌操作和冷卻干燥處理。性能簡介該設(shè)備嚴(yán)格按照壓力容器規(guī)范（GB150）和“脈動真空滅菌柜”標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計制作。主體為臥式矩形內(nèi)外雙層結(jié)構(gòu)；前期采用脈動真空排氣方式消除滅菌室內(nèi)殘存冷空氣對溫度的影響（排除率99%），既加快了升溫速度，減少了對被滅菌物品的損傷，又充分保證了滅菌溫度均勻性；滅菌后真空抽濕結(jié)合套層烘干使物品干燥和冷卻。滅菌器裝載能力： 50ml 420瓶2 .滅菌設(shè)備和公用系統(tǒng)的測試 2.1 滅菌柜特性 2.2滅菌介質(zhì)：飽和水蒸汽。調(diào)制0.5麥?zhǔn)系木鷳乙?，?/p>

4、入玻璃瓶中，放入蒸汽式的高壓鍋，121，高壓30min后，將細(xì)菌轉(zhuǎn)種到細(xì)菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48小時，沒有細(xì)菌生長，說明高壓蒸汽滅菌有效。 2.3 容器類別為一類，套層和內(nèi)層溫度和壓力試驗(yàn)（見滅菌柜產(chǎn)品技術(shù)特性）符合標(biāo)準(zhǔn)GB150-1998、YY/T0084-2-92、JB/T4709-2000、容規(guī)，因此此設(shè)備壓力設(shè)計安全。 2.4該設(shè)備壓力表、安全閥等合格證如圖 2.5其他合格證明見附圖。3.空熱載和熱穿透實(shí)驗(yàn) 3.1滅菌工作程序：準(zhǔn)備階段：打開蒸汽、自來水、壓縮空氣等能源管道上的閥門；每天第一次使用前排除蒸汽管道內(nèi)的冷凝水；確認(rèn)各種能源壓力符合設(shè)備工作要求；打開電器箱中得電源開關(guān)并確認(rèn)正常。

5、操作階段：打開電源，確認(rèn)觸摸屏進(jìn)入主操作界面。設(shè)定參數(shù)，然后按門操作鍵進(jìn)入門操作界面。打開門后裝入滅菌對象。關(guān)閉前門。啟動階段：在主操作界面上，按自動/手動選擇鍵，選擇滅菌程序。確認(rèn)后進(jìn)入滅菌階段。結(jié)束階段：滅菌完成后，在主操作界面按門操作鍵進(jìn)入門操作界面，解除門密封狀態(tài)。然后在后操作界面上，按開門鍵，打開后門，取出滅菌后的物品。最后，在后操作面板上按關(guān)門鍵，關(guān)閉后門。至此，完成一個滅菌周期。清潔階段：清洗滅菌室；關(guān)閉各種能源閥門；關(guān)閉電源。本方案依據(jù)濕熱滅菌的指導(dǎo)原則制訂，主要進(jìn)行設(shè)備滅菌程序的驗(yàn)證。 3.2 滅菌對象本公司主要生產(chǎn)臨床檢驗(yàn)細(xì)菌用的試劑盒、培養(yǎng)瓶，以及配套的培養(yǎng)液與稀釋液。需

6、要高壓滅菌的主要是培養(yǎng)液與稀釋液。 培養(yǎng)液成分：重蒸水、腦心浸液（濃度為3.7%） 稀釋液成分：重蒸水、氯化鈉（濃度為9%）原材料名稱廠家名稱規(guī)格批號腦心浸液英國OXOID公司500g/瓶1079013氯化鈉天津市大茂化學(xué)試劑廠500g/瓶20100508腦心浸液主要作用是為細(xì)菌提供碳源及氮源，高溫高壓下對其沒有影響。氯化鈉主要為稀釋細(xì)菌用，并且高溫高壓下氯化鈉化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。因此這兩種物質(zhì)適于高壓高溫滅菌的方法。 3.3 驗(yàn)證目的安裝確認(rèn)主要檢查滅菌柜安裝符合設(shè)計要求，滅菌柜有關(guān)資料和文件符合GMP 的管理要求。運(yùn)行確認(rèn)主要檢查滅菌柜各單元的性能及整機(jī)運(yùn)行是否達(dá)到供貨單位設(shè)計要求。性能確認(rèn)主要

7、驗(yàn)證滅菌柜在裝載情況下不同位置的熱分布狀況，確定滅菌柜中冷點(diǎn)的位置；確定產(chǎn)品滅菌程序有關(guān)的參數(shù)，如溫度、壓力及滅菌時間等，以確保產(chǎn)品滅菌后達(dá)到低于106 的微生物污染率，同時驗(yàn)證滅菌器運(yùn)行的可靠性及滅菌程序的重現(xiàn)性。3.4 實(shí)驗(yàn)過程滅菌柜準(zhǔn)備階段： 在打開電源之前，必須做好準(zhǔn)備工作； （1）、檢查設(shè)備狀態(tài)是否良好； （2）、打開自來水閥門，包括進(jìn)水泵用自來水和真空用自來水； （3）、關(guān)閉水箱排放閥； （4）、檢查空氣壓縮機(jī)放氣閥是否已關(guān)閉，關(guān)閉后再打開空氣壓縮機(jī)，壓縮機(jī)工作幾分鐘后，達(dá)到設(shè)定壓力，停止工作，看壓縮機(jī)上壓力表讀數(shù)是否在0.50.8Mpa范圍內(nèi)，再看滅菌柜上進(jìn)氣口處壓力表讀數(shù)是否也

8、在0.50.8Mpa范圍內(nèi)，都正常后再進(jìn)行下面操作。 操作步驟 （1）、打開控制電源：按下主操作面板上的電源按鈕，確認(rèn)觸摸屏后進(jìn)入主操作界面，此時，PLC上電后先檢測四個門接近開關(guān)是否都亮燈。若都亮，開始往水箱注水。大約一分鐘后，顯示低液位，并顯示制蒸汽，大約再過一分鐘，顯示高液位，停止進(jìn)水。進(jìn)水時間一般不超過三分鐘，若超過三分鐘，檢查設(shè)備是否有異常情況。進(jìn)水過程中，觀察套層壓力表讀數(shù)變化，若其讀數(shù)超過0.2Mpa，為不正常，此時應(yīng)關(guān)閉設(shè)備電源，打開水箱排放閥。 （2）、參數(shù)設(shè)置：在參數(shù)設(shè)定界面上，按工藝要求設(shè)定好工作壓力、滅菌溫度、滅菌時間、干燥時間等工作參數(shù)，選擇好所用滅菌程序，參數(shù)設(shè)定完

9、成并確認(rèn)無誤后，按該界面的確定鍵返回主操作界面。 （3）、物品裝載：在門操作界面上，按開前門鍵，打開設(shè)備前門，將待滅菌物品從前門裝入滅菌室內(nèi)，裝載完成后，關(guān)閉前門。確認(rèn)前門已關(guān)好，且該界面前、后門關(guān)閉指示燈顯示正常。按該界面上的門密封鍵并確認(rèn)門密封指示正常。 （4）、啟動滅菌程序：在主操作界面上，按自動鍵，選擇自動程序，按啟動鍵，設(shè)備開始按選定的設(shè)定程序運(yùn)行，自動進(jìn)行滅菌操作。滅菌過程中，應(yīng)注意各參數(shù)變化情況，以及設(shè)備運(yùn)行情況，若出現(xiàn)異常，應(yīng)根據(jù)情況，采取適當(dāng)措施。滅菌結(jié)束后套層開始排放蒸汽，待滅菌室壓力降低到70Kpa左右時，停止程序。然后，選擇手動程序，按其中的排放鍵，滅菌室開始排放蒸汽，

10、其壓力逐漸降低到10Kpa左右。再點(diǎn)動按真空鍵，讓滅菌室壓力降到0. （5）、物品卸載：在主操作界面按門操作鍵進(jìn)入門操作界面。在該界面上，按門真空鍵3-5秒，以解除門密封狀態(tài)，然后按開前門鍵，打開前門，取出滅菌后的物品。 （6）、設(shè)備使用結(jié)束后，清潔滅菌室及設(shè)備，關(guān)閉電源、關(guān)閉自來水閥門，關(guān)閉壓縮機(jī)，打開水箱排放閥，打開壓縮機(jī)放氣閥。 熱載實(shí)驗(yàn)： （1）、 首先空載運(yùn)行三次驗(yàn)證滅菌柜內(nèi)溫度的均勻性；（2）、 將瓶裝培養(yǎng)液密封后，排放在不銹鋼托盤上，每瓶之間留有3cm的空間放入滅菌室，作為最小裝載運(yùn)行三次，每次都是完全冷卻后再運(yùn)行第二次；（3）、 將瓶裝培養(yǎng)液密封后，排放在不銹鋼托盤上，每瓶之間

11、不留空間放入滅菌室，作為最大裝載運(yùn)行三次，每次都是完全冷卻后再運(yùn)行第二次；（4）、 將瓶裝培養(yǎng)液密封后，排放在不銹鋼托盤上，每瓶之間留有1cm的空間放入滅菌室，典型裝載運(yùn)行三次，每次都是完全冷卻后再運(yùn)行第二次；（5）、 記錄每次實(shí)驗(yàn)各點(diǎn)的溫度。 培養(yǎng)液在滅菌柜內(nèi)的排放（如下圖） 探頭在滅菌室內(nèi)的排放（數(shù)字代表幾個探頭的位置如下圖） 探頭采用北京賽億凌科技有限公司生產(chǎn)的STT-R系列鉑電阻溫度傳感器，溫度檢測范圍為-50-250，精度為0.1。 3.4.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目最冷點(diǎn)和腔室平均溫度差值空載熱分布第一次各個點(diǎn)平均差值1.0?？拷鼙谂c熱源處溫度較高。其他部位基本一致空載熱分布第二次各個點(diǎn)平

12、均差值1.0。靠近管壁與熱源處溫度較高。其他部位基本一致空載熱分布第三次各個點(diǎn)平均差值1.0?？拷鼙谂c熱源處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（最小裝載）第一次各個點(diǎn)平均差值1.0?？拷鼙谂c熱源處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（典型裝載）第一次各個點(diǎn)平均差值1.0?？拷鼙谂c熱源處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（最大裝載）第一次各個點(diǎn)平均差值1.0?？拷鼙谂c熱源處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（最小裝載）第二次各個點(diǎn)平均差值在2.0?？拷鼙谂c進(jìn)氣孔處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（典型裝載）第二次各個點(diǎn)平均差值在2.0?？拷鼙谂c進(jìn)氣孔處溫度較高。其他部位基本

13、一致裝載熱分布（最大裝載）第二次各個點(diǎn)平均差值在2.0?？拷鼙谂c進(jìn)氣孔處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（最小裝載）第三次各個點(diǎn)平均差值在2.0。靠近管壁與進(jìn)氣孔處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（典型裝載）第三次各個點(diǎn)平均差值在2.0?？拷鼙谂c進(jìn)氣孔處溫度較高。其他部位基本一致裝載熱分布（最大裝載）第三次各個點(diǎn)平均差值在2.0?？拷鼙谂c進(jìn)氣孔處溫度較高。其他部位基本一致3.5 熱穿透試驗(yàn)(滅菌程序的驗(yàn)證) （與生物指示劑同時進(jìn)行）目的：熱穿透試驗(yàn)是在熱分布試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定裝載中的“最冷點(diǎn)”，并確認(rèn)該點(diǎn)在滅菌過程中獲的F0不小于8。 驗(yàn)證步驟測試過程：將1支探頭置于由熱分布試驗(yàn)

14、確定的冷點(diǎn)位置，其余探頭按溫度探頭裝載圖均勻分布在滅菌產(chǎn)品中并固定好(鉑電阻安裝時不要與塑料袋接觸)，記下探頭編號，關(guān)上滅菌柜的門，運(yùn)行滅菌程序，啟動驗(yàn)證儀記錄滅菌溫度、F0，每30s 采集一次，直到滅菌程序結(jié)束。裝載類型：10 ml螺口瓶裝培養(yǎng)液,包含最小裝載、典型裝載和最大裝載三種，每種重復(fù)三次。以檢查其重現(xiàn)性。滅菌程序：121，30 min 合格標(biāo)準(zhǔn)對于此滅菌程序產(chǎn)品來說，腔室內(nèi)各點(diǎn)（包括最冷點(diǎn)）F08，冷點(diǎn)F0值和產(chǎn)品F0 的平均值之間的差值不超過2.5。3.5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目最冷點(diǎn)F0差值裝載熱穿透（最小裝載）第一次8.40.1裝載熱穿透（典型裝載）第一次8.10.4裝載熱穿透（最

15、大裝載）第一次8.90.4裝載熱穿透（最小裝載）第二次8.20.3裝載熱穿透（典型裝載）第二次8.30.2裝載熱穿透（最大裝載）第二次9.00.5裝載熱穿透（最小裝載）第三次8.20.3裝載熱穿透（典型裝載）第三次8.40.1裝載熱穿透（最大裝載）第三次9.00.5 結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證合格。4. 生物指示劑試驗(yàn) 4.1 生物指示劑說明 生物指示劑：生物指示劑是一類特殊的活微生物制品,可用于確認(rèn)滅菌設(shè)備的性能,滅菌程序的驗(yàn)證,生產(chǎn)過程滅菌效果的監(jiān)控等. 對特定滅菌處理有確定的抗力，并裝在內(nèi)層包裝中可供使用的染菌載體。生物指示劑重量質(zhì)量特性：a、芽孢含量；b、D值。本次使用的指示劑為

16、四環(huán)牌ME-壓力蒸汽滅菌生物指示劑，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所研制，北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠有限公司出品，生產(chǎn)地址：北京市豐臺區(qū)東大街20號。型號為ME-型，批準(zhǔn)文號：衛(wèi)消字（2002）第0146號，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：Q/SHY 03-2002，衛(wèi)生許可證：京衛(wèi)消證字2002第0055號，ISO9001:2000國際質(zhì)量管理體系認(rèn)證企業(yè)，批號：20110406，本品由嗜熱脂肪桿菌芽孢(ATCC7953)菌片，培養(yǎng)基（密封在玻璃管內(nèi)）及塑料外殼組成自含式生物指示劑。菌片含菌量為5×1055×106cfu/片。D值為1.31.9分鐘。在121±0.5飽和蒸汽條件下，存活時間

17、3.9分鐘，殺滅時間19分鐘。該產(chǎn)品功能：不需要無菌操作，培養(yǎng)簡單； 在24個月內(nèi)保證穩(wěn)定的芽孢數(shù)； 根據(jù)標(biāo)簽的化學(xué)指示劑變化，可確認(rèn)是否滅菌完全； 經(jīng)24小時、48小時或4天培養(yǎng)，可確認(rèn)滅菌效果，并且信賴度高。使用方法：a. 將生物指示劑管放入標(biāo)準(zhǔn)檢測包的中心，置于滅菌器的規(guī)定位置； b. 按規(guī)定的滅菌溫度和時間進(jìn)行滅菌處理。 c. 滅菌結(jié)束即刻將指示劑管取出，蓋朝上垂直握于手中，用鑷子夾住指示管下端尖部，將管內(nèi)甌夾碎，讓培養(yǎng)液流出，浸沒菌片，充分振搖。然后將置于56培養(yǎng)箱內(nèi)或配套的微型培養(yǎng)器內(nèi)，同時放一支未經(jīng)滅菌處理的生物指示管作為陽性對照，一并培養(yǎng)48小時，觀察結(jié)果。 結(jié)果判定： 培養(yǎng)后

18、當(dāng)生物指示劑管內(nèi)培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色，即表示有菌生長，判定滅菌不合格；如仍為紫色即表示無菌生長，同時陽性對照生長正常，判定為滅菌合格。注意事項(xiàng)：1、生物指示劑管從壓力蒸汽滅菌器內(nèi)取出后需在室溫下放10min左右，再將安甌夾碎； 2、未用完的生物指示劑隨時放入4冰箱內(nèi)； 3、本生物指示劑在4條件下存儲。 4.2 生物指示劑實(shí)驗(yàn)步驟1、選用嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillus stereatherno philus,測定生物指示劑的D值(1.8)；2、將驗(yàn)證用生物指示劑接種入被驗(yàn)證產(chǎn)品的包裝容器中（如圖2），裝有生物指示劑的容器要緊挨于裝有測溫探頭的容器，在滅菌設(shè)備的最“冷點(diǎn)”處必須放置生物指示劑。樣

19、品總數(shù)為20只。 圖2圖3圖43、 驗(yàn)證時，按產(chǎn)品設(shè)定的滅菌程序運(yùn)行，滅菌后樣品經(jīng)過濾處理后56培養(yǎng)48h、計數(shù)。共進(jìn)行3次試驗(yàn)。（溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基）。 圖3為滅菌后將安甌夾碎 圖4為將生物指示劑培養(yǎng)液放入56培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時接種量計算：根據(jù)SLRF0/ D bi8/1.8=4.44，SLR=lgAlgB，B2.303×lg(20/19)0.0513計算得A10 3.15 (CFU/瓶)。即生物指示劑每包裝的接種量約為1.5×103CFU/瓶。4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果D值驗(yàn)證結(jié)果：滅菌方法微生物溫度（）介質(zhì)或樣品D值（min）蒸氣滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌1055葡萄糖水溶液87.8蒸氣滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌1215葡萄糖水溶液2.4蒸氣滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌121生理鹽水3.0蒸氣滅菌產(chǎn)芽胞梭狀芽孢桿菌1055葡萄糖水溶液1.3測定F0值，t=1（min）時間(min)012345678-38溫度()100102104106108110112114115時間(min)3940414243444546溫度()114112110108106104102100F0=1*(10(100-121)/10)+(10(102-121)/10)+(10(104-121)/10)+.+(10(100-121)/10) =8.41(min)規(guī)定F