1、分子細(xì)胞遺傳學(xué)診斷技術(shù)簡(jiǎn)介 u熒光原位雜交技術(shù)（熒光原位雜交技術(shù)（FISH)FISH)快速產(chǎn)前診斷快速產(chǎn)前診斷常見(jiàn)非整倍體常見(jiàn)非整倍體u熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)(FISH)(FISH)診斷診斷DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS綜合征綜合征u光譜核型分析技術(shù)（光譜核型分析技術(shù)（SKY)SKY)檢測(cè)染色體異檢測(cè)染色體異常常uaCGHaCGH快速檢測(cè)間期細(xì)胞全基因組拷貝數(shù)快速檢測(cè)間期細(xì)胞全基因組拷貝數(shù)熒光原位雜交技術(shù)快速產(chǎn)前診熒光原位雜交技術(shù)快速產(chǎn)前診斷常見(jiàn)非整倍體斷常見(jiàn)非整倍體項(xiàng)目概述 出生缺陷是影響人口素質(zhì)的重大問(wèn)題，每年估計(jì)有80100萬(wàn)出生缺陷兒誕生，給家庭和社會(huì)帶

2、來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。70%的出生缺陷是遺傳因素所致，染色體非整倍體異常最常見(jiàn)，如常染色體異常13、18、21 三體等及性染色體異常 Turner 綜合征、Klinefelter 綜合征等。其中最常見(jiàn)的是21三體綜合征又稱(chēng)唐氏綜合征(DS)，新生兒的發(fā)病率高達(dá)1/800 。項(xiàng)目概述 產(chǎn)前診斷是避免異?；純撼錾牡闹匾夹g(shù)手段。傳統(tǒng)的核型分析方法是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)。然而,標(biāo)準(zhǔn)的核型分析必須對(duì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)數(shù)天培養(yǎng)，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，操作復(fù)雜。FISH 解除了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)的限制，能夠在短至24小時(shí)的時(shí)間排除占活嬰染色體異常的95%的五種常見(jiàn)異常，對(duì)于檢查者無(wú)疑是一大福音。適應(yīng)癥u（1）孕婦年齡大于等于35歲

3、。u（2）孕婦曾經(jīng)生育過(guò)染色體異常患者史。u（3）夫婦一方有染色體結(jié)構(gòu)異常者。u（4）母血清生化篩查高風(fēng)險(xiǎn)。u（5）超生檢查發(fā)現(xiàn)胎兒異常。技術(shù)原理 熒光原位雜交技術(shù)（flourescence in situ hybridization FISH）為分子生物學(xué)（探針）與細(xì)胞遺傳學(xué)（染色體）的結(jié)合。FISH技術(shù)是指將熒光標(biāo)記的染色體區(qū)帶特異性的DNA作為探針，與分裂期或間期細(xì)胞原位雜交于熒光顯微鏡下觀察染色體畸變的技術(shù)。技術(shù)優(yōu)勢(shì) 重復(fù)性好、穩(wěn)定； 高靈敏性及特異性； 可用于間期細(xì)胞，不需要細(xì)胞培養(yǎng)； 目前，F(xiàn)ISH已成為一種常見(jiàn)檢測(cè)手段，國(guó)外廣泛地用于產(chǎn)前、產(chǎn)后遺傳病診斷及血液腫瘤、實(shí)體瘤等方面的

4、檢測(cè)。在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)用FISH產(chǎn)前診斷檢測(cè)染色體異常占30-40%。技術(shù)原理與方法 產(chǎn)前診斷檢測(cè)非整倍體需要21、13、18、X和Y染色體上的五種探針。其中21號(hào)和13號(hào)染色體檢測(cè)探針列為一組，為位點(diǎn)特異探針，分別用Rhodamine (紅色和FITC (綠色)標(biāo)記。18號(hào)、X和Y染色體探針列為一組，為染色體著絲粒特異性重復(fù)序列探針,分別用DEAC(藍(lán)色) FITC (綠色)和Rhodamine (紅色)標(biāo)記。檢測(cè)正常結(jié)果 異常結(jié)果 21三體 18三體技術(shù)難點(diǎn) 試劑的離子成分和PH值對(duì)雜交的好壞有直接的影響。因而在實(shí)驗(yàn)的試劑配置準(zhǔn)備過(guò)程中要注意使用超純水進(jìn)行配置，同時(shí)配好的試劑要使用PH試紙

5、或PH儀校準(zhǔn)。 細(xì)胞質(zhì)較多時(shí)也會(huì)引起雜交率低下，信號(hào)弱，因而在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)特別注意消化時(shí)間的掌握。熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS綜合征綜合征臨床指征（包括兒童及胎兒）n圓錐動(dòng)脈干畸形,如法洛四聯(lián)癥,肺動(dòng)脈閉鎖/室間隔缺損,右室雙出口,永存主動(dòng)脈干,以及B 型主動(dòng)脈弓離斷；n異常面容；n胸腺發(fā)育不良；n腭裂； n低鈣血癥；DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS綜合征綜合征 DiGeorge/VCFS 綜合征臨床特征包括心臟畸形（錐干部畸形為主）、T細(xì)胞功能缺陷、腭裂、異常面容和低鈣血癥。 該綜合征涉及多個(gè)基因的缺失,而T

6、BX1基因可能是主要致病基因。這些基因的丟失影響了胚胎期心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞的正常功能,從而造成出生后神經(jīng)嵴相關(guān)組織(胸腺,腭,圓錐動(dòng)脈干)的畸形 。DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS綜合征綜合征 DiGeorge 綜合征或 Velocardiofacial（VCFS)綜合征，是由于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂近著絲粒端微片段缺失引起的遺傳綜合征。 在活產(chǎn)胎兒兒中發(fā)生率約1/4 000，是造成小兒先天性心臟病最常見(jiàn)的單一基因因素。群體檢測(cè)證實(shí)近90DiGeorge綜合癥病人和約85VCFS綜合癥病人存在22q11微缺失。 項(xiàng)目概述 目前世界上唯一有效的方法就是手術(shù)治療。 DiGeorge/VC

7、FS綜合征綜合征除了先心病 （CHD） 最容易早期發(fā)現(xiàn)外，其他異常(如低鈣血癥、細(xì)胞免疫功能缺陷、氣管支氣管畸形等) 則相對(duì)隱匿。此類(lèi)CHD患者如不能早期診斷與適當(dāng)干預(yù)，手術(shù)時(shí)則可能發(fā)生難以預(yù)測(cè)的感染、心臟停搏、呼吸衰竭等，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)大大增加，預(yù)后不良。因此，如能通過(guò)本項(xiàng)目確診早期干預(yù)，其社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益是顯而易見(jiàn)的。 項(xiàng)目概述 此外，該綜合征還經(jīng)常合并智力障礙及認(rèn)知功能障礙和精神行為異常，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，給社會(huì)和家庭造成的經(jīng)濟(jì)和精神損失是巨大的。為此常推薦終止妊娠。進(jìn)行22q11 微缺失檢測(cè)，可以幫助準(zhǔn)確產(chǎn)前咨詢，為孕婦決定終止妊娠提供全面充分的證據(jù)。目前國(guó)外此項(xiàng)檢查常規(guī)開(kāi)展，國(guó)內(nèi)也有部分單位

8、已經(jīng)開(kāi)展。技術(shù)方法 檢測(cè)DiGeorge/VCFS綜合征需要22號(hào)長(zhǎng)臂上的一組探針，分別為GLP TUPLE1和GLP ARSA。 該方法只能檢測(cè)出DiGeorge/VCFS綜合征最常見(jiàn)的缺失，對(duì)于少數(shù)患者發(fā)生其他缺失或易位不能檢出。應(yīng)用范圍及意義通過(guò)羊水檢測(cè)判斷胎兒發(fā)生先心病的情況。檢測(cè)患有先心病的新生兒及兒童，明確病因。生育過(guò)先天性心臟病患兒父母進(jìn)行檢測(cè)，可以預(yù)測(cè)下一胎兒患先心病的可能性。光譜核型分析技術(shù)檢測(cè)染色體異常光譜核型分析技術(shù)檢測(cè)染色體異常項(xiàng)目概述項(xiàng)目概述 染色體畸變80%為染色體數(shù)目異常，其次為染色體結(jié)構(gòu)重排、丟失、重復(fù)、平衡或非平衡易位、嵌合體、標(biāo)記染色體等。染色體病患者大多有

9、嚴(yán)重的智力障礙、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和某些組織器官畸形等，同時(shí)染色體畸變也是導(dǎo)致妊娠早期自然流產(chǎn)和不孕不育的重要原因，且目前尚無(wú)有效地治療方案。準(zhǔn)確地對(duì)染色體病進(jìn)行診斷和產(chǎn)前診斷，有利于控制出生缺陷，指導(dǎo)遺傳咨詢和評(píng)估預(yù)后。 項(xiàng)目概述項(xiàng)目概述n傳統(tǒng)的染色體畸變?cè)\斷方法為G顯帶染色體核型分析，可以觀察染色體的數(shù)目和整套染色體的主要帶形，其分辨率約為350450個(gè)染色體條帶。但對(duì)于標(biāo)記染色體（來(lái)源不明的染色體）、復(fù)雜的染色體易位或重排，以及微小的染色體結(jié)構(gòu)畸變則難以進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。項(xiàng)目概述項(xiàng)目概述n光譜核型分析技術(shù)（spectral karyotyping, SKY）是1996年發(fā)展起來(lái)的一種將光譜干涉成

10、像技術(shù)與FISH相結(jié)合的細(xì)胞遺傳學(xué)檢查的新技術(shù)；n使24種染色體同時(shí)以不同的顏色顯示出來(lái)，染色體之間的易位可以很直接地觀察到；nSKY的分辨率較高，可達(dá)1.5Mb DNA；而常規(guī)的G顯帶核型分析技術(shù)對(duì)小于5-10Mb DNA則難以分辨了。 項(xiàng)目概述項(xiàng)目概述 SKY在診斷標(biāo)記染色體、復(fù)雜的染色體易位或重排，以及微小的染色體結(jié)構(gòu)畸變等方面有較大的優(yōu)勢(shì)，逐漸在臨床疑難染色體病的診斷和產(chǎn)前診斷、植入前遺傳學(xué)診斷以及腫瘤遺傳學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,為臨床染色體病的診斷、處理、預(yù)后評(píng)估和遺傳咨詢提供依據(jù)。適應(yīng)癥n常規(guī)G顯帶染色體檢查顯示復(fù)雜染色體易位、標(biāo)記染色體、衍生染色體；n具有臨床表現(xiàn)而常規(guī)核型分析技術(shù)

11、未發(fā)現(xiàn)異常的病例禁忌癥n對(duì)于一條染色體中發(fā)生的倒位、重復(fù)、缺失，因無(wú)色彩的變化，SKY不能直接檢出；n不能精確判斷染色體畸變的斷裂點(diǎn)（即區(qū)帶）；光譜核型分析技術(shù)（spectral karyotyping, SKY）基本原理 用5種不同的熒光素或其組合標(biāo)記出不同的24種人類(lèi)染色體涂染探針，然后將不同標(biāo)記的24種探針同時(shí)與中期染色體進(jìn)行原位抑制雜交。通過(guò)Fourier分光鏡、CCD成像和光學(xué)顯微鏡捕捉和測(cè)量所有染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射光譜，按照一種光譜分類(lèi)算法將一特定的分類(lèi)色（假顏色）分配到所有的人類(lèi)染色體上，然后通過(guò)計(jì)算機(jī)成像軟件分析，使不同的染色體顯示出不同的假顏色，從而進(jìn)行核型分析 。技術(shù)難點(diǎn)

12、 玻片標(biāo)本質(zhì)量的好壞和玻片變性時(shí)間的控制是SKY實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。制備本底干凈、核型分布好、沒(méi)有胞漿的標(biāo)本，選擇較好的變性時(shí)間。技術(shù)局限 對(duì)微小的標(biāo)記染色體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于熒光閃爍可能會(huì)出現(xiàn)顏色混雜現(xiàn)象，需要相應(yīng)的FISH進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，以明確診斷。試劑及設(shè)備成本高。aCGHaCGH快速檢測(cè)間期細(xì)胞全基因快速檢測(cè)間期細(xì)胞全基因組拷貝數(shù)組拷貝數(shù)21世紀(jì)細(xì)胞遺傳學(xué)的革命 aCGH簡(jiǎn)稱(chēng)：aCGH英文名：array-comparative genomic hybridization； Microarray based Comparative Genomic Hybridization ）中文名：微陣列

13、- 比較基因組雜交aCGH適用范圍naCGH將作為染色體分析的一種選擇方法，替代FISH和許多標(biāo)準(zhǔn)染色體組型分析，其也可用于檢測(cè)各種樣本上的拷貝數(shù)變化。naCGH是一種高尖端技術(shù)，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前和產(chǎn)后診斷、植入前診斷、癌癥診斷和預(yù)后、個(gè)體化治療、干細(xì)胞和細(xì)胞系研究、藥物發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域。 aCGH 革命 主觀的主觀的G-Banding “低”分辨率 全基因組 = + = 高分辨率 FISH= + 靶基因 = 勞動(dòng)強(qiáng)度大，勞動(dòng)強(qiáng)度大， 耗時(shí)耗時(shí) 客觀的客觀的全基因組 高分辨率 aCGH = + = aCGH工作流程n步驟1：從質(zhì)控和實(shí)驗(yàn)組織上提取基因組DNA。 必要時(shí)擴(kuò)增。n步驟2：使用青色素-3 d

14、CTP和青色素-5dCTP以 區(qū)分標(biāo)記檢測(cè)DNA和參考DNA。n步驟3：將標(biāo)記DNA與芯片R雜交。n步驟4：使用掃描儀和軟件對(duì)芯片信號(hào)進(jìn)行掃描和分析。 試驗(yàn)方案要求時(shí)間為小于兩個(gè)工作日。結(jié)果可在36hr內(nèi)收到。不需要細(xì)胞培養(yǎng)，也不需要在載玻片上進(jìn)行冗長(zhǎng)的中期染色體制備。工作原理示意圖n直接比較兩個(gè)經(jīng)過(guò)不同標(biāo)記基因組之間DNA拷貝數(shù)的差異。 a CGH 提供客觀和定量的結(jié)果SpectralWare software provides a visual representation of the data generated from the microarray Perkinelmer a CG

15、H 技術(shù)-靶陣列或全基因組陣列設(shè)計(jì)，您的選擇！對(duì)已知病癥提供清晰的對(duì)已知病癥提供清晰的信號(hào)信號(hào)n避免實(shí)驗(yàn)室反復(fù)用避免實(shí)驗(yàn)室反復(fù)用FISH 方法來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)診斷方法來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)診斷n結(jié)果易懂結(jié)果易懂n將錯(cuò)失不覆蓋區(qū)域的基因?qū)㈠e(cuò)失不覆蓋區(qū)域的基因缺失和增加缺失和增加n如果病人有明顯的綜合病如果病人有明顯的綜合病癥，染色體分析或癥，染色體分析或FISH 可能更適合可能更適合n廣泛覆蓋基因，廣泛覆蓋基因，1MB分分辨率辨率n發(fā)現(xiàn)新易感基因發(fā)現(xiàn)新易感基因n更多的噪信號(hào)更多的噪信號(hào)n數(shù)據(jù)難以解釋和理解數(shù)據(jù)難以解釋和理解靶向芯片的臨床應(yīng)用n在實(shí)際的臨床分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域中，靶向微陣列最受歡迎，因?yàn)樗竞w基因

16、組中所有已知的重大臨床意義的特定區(qū)域，在應(yīng)用中可以達(dá)到最佳的平衡：最大限度地檢測(cè)與臨床有關(guān)的染色體不平衡異常，又能夠盡可能地減少涵蓋人類(lèi)基因組中多態(tài)性拷貝數(shù)變異（CNVs）的數(shù)量。 靶向芯片可檢測(cè)40幾種微缺失綜合征1p36先天性腎上腺發(fā)育不良癥先天性腎上腺發(fā)育不良癥Alagille綜合征綜合征安琪兒綜合征安琪兒綜合征無(wú)精子因子無(wú)精子因子A無(wú)精子因子無(wú)精子因子B無(wú)精子因子無(wú)精子因子CBruton酪氨酸激酶酪氨酸激酶巨大舌巨大舌-臍膨出綜合征臍膨出綜合征1A型腓骨肌萎縮癥型腓骨肌萎縮癥貓鳴癥侯群貓鳴癥侯群DiGeorge 1/VCF綜合征綜合征DiGeorge 2 = 10p13唐氏綜合征唐氏綜

17、合征Duchenne肌肉萎縮癥肌肉萎縮癥甘油激酶缺乏癥甘油激酶缺乏癥Greig綜合征綜合征 GLI3遺傳性壓迫易感性神經(jīng)病遺傳性壓迫易感性神經(jīng)病甲狀旁腺功能不全、感音神經(jīng)性聾和腎發(fā)育不良甲狀旁腺功能不全、感音神經(jīng)性聾和腎發(fā)育不良卡爾曼綜合征卡爾曼綜合征Langer-Giedion綜合征綜合征 EXT1 andTRPSI敏敏-迪綜合征迪綜合征Potocki-Shaffer癥侯群癥侯群包括多發(fā)性外生軟骨瘤包括多發(fā)性外生軟骨瘤2神經(jīng)纖維瘤病神經(jīng)纖維瘤病1佩佩-梅病梅病I型多囊腎疾病型多囊腎疾病Prader-Willi綜合征綜合征視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤1Rubinstein-Taybi氏癥侯群氏癥侯群Saethre-Chotzen綜合征綜合征Y染色體性別決定區(qū)染色體性別決定區(qū)Smith-Magenis綜合征綜合征Sotos綜合征綜合征固醇硫酸酶缺乏癥固醇硫酸酶缺乏癥毛發(fā)毛發(fā)-鼻鼻-指指（趾趾）綜合征綜合征結(jié)節(jié)性硬化癥結(jié)節(jié)性硬化癥1威廉斯綜合征威廉斯綜合征腎母細(xì)胞瘤腎母細(xì)胞瘤威爾姆氏腫瘤威爾姆氏腫瘤Wolf-Hirschhorn癥侯群癥侯群a CGH 優(yōu)越性：n