1、    老年性癡呆相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性分析作者：李中， 丘東海， 劉紅英， 方瑩瑩   作者單位：中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科， 廣東 廣州 【摘要】  【目的】 分析老年性癡呆（?。┫嚓P(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性（），探討其基因表達(dá)可能的分子調(diào)控機(jī)制。【方法】 擴(kuò)增基因上游約 啟動(dòng)子區(qū)片段，與螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體-進(jìn)行重組質(zhì)粒的克隆與鑒定，確立啟動(dòng)子區(qū)候選功能及其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。應(yīng)用 對(duì)包含功能的重組質(zhì)粒進(jìn)行-細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，雙熒光素酶相對(duì)活性分析及電泳遷移率變動(dòng)分析?！窘Y(jié)果】 基因啟動(dòng)子

2、區(qū) 片段內(nèi)存在功能 - ，與其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子為 （）， - 的序列結(jié)構(gòu)對(duì)啟動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)功能較 - 的序列結(jié)構(gòu)強(qiáng)（ ， ）。 【結(jié)論】 基因核心啟動(dòng)子應(yīng)該在 片段內(nèi)， - 可能是啟動(dòng)子區(qū)有功能位點(diǎn)突變，包含 - 的核苷酸序列結(jié)構(gòu)可能通過(guò)與在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)差異的調(diào)控。【關(guān)鍵詞】  ??；啟動(dòng)子；單核苷酸多態(tài)性；電泳遷移率變動(dòng)分析            ， -， -， -    （ ， ， - ， ， ） 

3、0;  ： 【】 （） （） 【】 - （） - （） （）   【】 - ， （） - - （ ，） 【】 - ， -   ： ； ； ； ；     老年性癡呆又稱?。?， ），是一種以進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類壽命普遍延長(zhǎng)，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，但是， 的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制至今尚不明了，亦無(wú)有效治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白（- ， ）沉積（老年斑形成）是腦神經(jīng)細(xì)胞主要變性區(qū)域的核心病理特征之一，并能導(dǎo)致其他病理結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，。來(lái)源于腦內(nèi)分泌酶（-）對(duì)型跨膜蛋白（- ）

4、跨膜區(qū)的切割。分泌酶是一種大分子質(zhì)量多蛋白復(fù)合體， 由-、 、 -和-四種蛋白組成，缺一不可，相互起著穩(wěn)定因子的作用，其中任一種蛋白表達(dá)水平的變化將直接影響其他蛋白的穩(wěn)定性、水解成熟、糖基化或向細(xì)胞表面的運(yùn)輸，進(jìn)而影響分泌酶的活性，產(chǎn)生難以消除的不可溶性片斷，導(dǎo)致腦內(nèi)沉積。本文將從相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)研究入手，分析研究基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性（ ， ）及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（ ， ）情況，探討基因啟動(dòng)子區(qū)表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，期望能為闡明該基因表達(dá)調(diào)控與分泌酶功能以及發(fā)病相關(guān)性提供新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步揭示發(fā)病機(jī)制和為臨床尋找防治新的藥物及其他干預(yù)治療手段打下基礎(chǔ)。  &#

5、160;    材料和方法      材  料    大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和-細(xì)胞株（來(lái)源于人腦神經(jīng)母細(xì)胞）為本室保存。-和-螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體、-水母熒光素酶載體及雙熒光素酶活性分析試劑盒均為公司產(chǎn)品；反應(yīng)、產(chǎn)物純化以及質(zhì)粒提取試劑盒均為公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、及 連接酶為公司產(chǎn)品；、-細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清、合成引物及探針、脂質(zhì)體 均為公司產(chǎn)品；細(xì)胞核蛋白抽提及電泳遷移率變動(dòng)分析（ ，）試劑盒為公司產(chǎn)品，同位素-為 公司產(chǎn)品。      基因啟動(dòng)子

6、的克隆與鑒定    登陸查詢?nèi)祟惢蚪M序列，通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息網(wǎng)確定基因組 翻譯起始點(diǎn)位置并結(jié)合文獻(xiàn)確定轉(zhuǎn)錄本大小及大致定位其啟動(dòng)子位置。結(jié)合-報(bào)告基因載體多克隆酶切位點(diǎn)分析設(shè)計(jì)引物， 多聚酶擴(kuò)增其上游約 的片段并純化，此擴(kuò)增片段經(jīng)凝膠電泳觀察并測(cè)序驗(yàn)證。參照分子克?。ǖ诎妫┫嚓P(guān)技術(shù)指南， -與上述擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切、連接、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、回收陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒并雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定及測(cè)序驗(yàn)證。   啟動(dòng)子區(qū)功能的選擇及其的確立    針對(duì)上述啟動(dòng)子片段序列，登陸和 進(jìn)行比對(duì)，推斷基因啟動(dòng)子區(qū)的候選功能并運(yùn)用

7、-的和的 數(shù)據(jù)庫(kù)及程式，匹配出與候選功能相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合的最可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。      瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性分析    -細(xì)胞在含 胎牛血清的高糖培養(yǎng)液及 、體積分?jǐn)?shù) 和適合濕度的條件下傳代培養(yǎng)。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)技術(shù)指南進(jìn)行孔板脂質(zhì)體 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系如下：每孔細(xì)胞數(shù) × ，脂質(zhì)體與質(zhì)粒質(zhì)量比為 ，待檢及對(duì)照質(zhì)粒與內(nèi)對(duì)照-的質(zhì)量比為 ，補(bǔ)充無(wú)抗生素及無(wú)血清-培養(yǎng)液至總體積 ；每個(gè)質(zhì)粒至少單獨(dú)轉(zhuǎn)染次。    轉(zhuǎn)染 后收集細(xì)胞，參照公司試劑盒操作手冊(cè)在熒光檢測(cè)儀上進(jìn)行相對(duì)熒光素酶活性（

8、 ，）測(cè)定，每孔測(cè)次求均值。機(jī)器對(duì)各孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率通過(guò)內(nèi)對(duì)照活性進(jìn)行自動(dòng)校正，校正后的轉(zhuǎn)染活性減去陰性對(duì)照值，再除以陽(yáng)性對(duì)照值，最后得到各樣品相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照啟動(dòng)子的相對(duì)活性。對(duì)此相對(duì)活性數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣品檢驗(yàn)和單因素方差分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行均數(shù)間兩兩比較（）。      電泳遷移率變動(dòng)分析    設(shè)計(jì)合成包含啟動(dòng)子區(qū)候選功能及其相應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的約 大小的核苷酸序列作為探針，并在其-末端用同位素- 標(biāo)記， -過(guò)柱純化后于 保存?zhèn)溆?。按核蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提-細(xì)胞核蛋白，并進(jìn)行-蛋白質(zhì)量檢測(cè)。按以下程序進(jìn)行-蛋白

9、結(jié)合反應(yīng)： 陰性對(duì)照反應(yīng)（僅有標(biāo)記探針）； 陽(yáng)性反應(yīng)（核蛋白標(biāo)記的已知探針）； 探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（核蛋白標(biāo)記探針倍標(biāo)記探針量的同源未標(biāo)記探針）； 突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（核蛋白 標(biāo)記探針 倍標(biāo)記探針量的未標(biāo)記突變探針）； 突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)（核蛋白標(biāo)記突變探針倍標(biāo)記突變探針量的未標(biāo)記探針）。反應(yīng)樣品于質(zhì)量濃度聚丙烯酰胺凝膠電泳，干膠后線片壓片并進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)。       結(jié)   果      基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的克隆與鑒定    根據(jù)載體多克隆酶切位點(diǎn)

10、，確定和兩個(gè)酶切位點(diǎn)，運(yùn)用 程序設(shè)計(jì)上下游引物分別為- - （）和- - （）， 多聚酶擴(kuò)增出 大小的片段，此擴(kuò)增片段和陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒及其雙酶切后經(jīng)質(zhì)量濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖，產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。      分析與  經(jīng)比對(duì)，推斷出 - 為基因啟動(dòng)子區(qū)的候選功能并匹配出與其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合的最可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子為 （， ， 下劃線結(jié)構(gòu)為）。采用帶啟動(dòng)子與增強(qiáng)子的-螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體作為陽(yáng)性對(duì)照，未連接克隆片段的空-作為陰性對(duì)照，-水母熒光素酶載體作為每個(gè)轉(zhuǎn)染的內(nèi)對(duì)照（用于校正背景值），由此構(gòu)成雙熒光素酶活性分析系統(tǒng)，其結(jié)果如圖（

11、兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， ，），提示啟動(dòng)子區(qū)包含 - 的序列結(jié)構(gòu)對(duì)啟動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)功能較包含 - 的序列結(jié)構(gòu)要強(qiáng)。進(jìn)一步的分析結(jié)果也顯示 - 的核苷酸序列結(jié)構(gòu)能與核蛋白中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子 結(jié)合并成為凝膠電泳遷移時(shí)相對(duì)獨(dú)立的泳動(dòng)帶（圖 ）。       討   論    自年基因被克隆伊始，就發(fā)現(xiàn)它可與其他種蛋白相互作用形成分泌酶，并對(duì)腦的病理結(jié)構(gòu)形成起重要作用，。屬型跨膜糖蛋白，它可能作為分泌酶的底物結(jié)合位點(diǎn)參與酶與底物的選擇性結(jié)合；因此， 表達(dá)的差異對(duì)分泌酶的功能具有一定的調(diào)節(jié)作用

12、，。    等研究發(fā)現(xiàn)，在人類神經(jīng)元細(xì)胞系中 對(duì)早老素功能起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。等報(bào)道了荷蘭人家族早發(fā)性與基因內(nèi)含子多態(tài)性相關(guān)。等對(duì)基因缺陷小鼠胚胎研究認(rèn)為，是分泌酶的重要組件，在介導(dǎo)信號(hào)通路和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的加工與運(yùn)輸中不可缺少。等對(duì)意大利家族性和散發(fā)性病人基因突變研究發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性。    分泌酶的功能不正常可以造成的腦內(nèi)異常沉積，從而產(chǎn)生腦的病理結(jié)構(gòu)變化；因此，作為分泌酶重要組件之一的有可能與的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性。那么在分子水平上，的表達(dá)調(diào)控如何？它的表達(dá)調(diào)控差異是否與發(fā)病有關(guān)？該問(wèn)題的解答將為揭示的發(fā)病機(jī)制與創(chuàng)立新的治療途徑提

13、供依據(jù)。    本文通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，推斷出人基因啟動(dòng)子區(qū) 大小的片段內(nèi)存在候選功能 - 及與其相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合的最可能的轉(zhuǎn)錄因子。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用基因重組分子克隆與基因表達(dá)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了包含 - 序列結(jié)構(gòu)對(duì)啟動(dòng)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)功能較包含 - 的相對(duì)要強(qiáng)；而且 - 的核苷酸序列結(jié)構(gòu)能與來(lái)源于人腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤的-細(xì)胞系核蛋白中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合；提示基因核心啟動(dòng)子應(yīng)該在擴(kuò)增的 大小的片段內(nèi)， - 可能是啟動(dòng)子區(qū)有功能位點(diǎn)突變，而包含 - 的核苷酸序列結(jié)構(gòu)可能通過(guò)與包括在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)差異的調(diào)控。    楊眉

14、等研究認(rèn)為，基因啟動(dòng)子很可能位于翻譯起始位點(diǎn)上游-處，與本研究的位點(diǎn)不同。筆者認(rèn)為，由于受質(zhì)粒構(gòu)建以及存在組織表達(dá)差異的影響，僅從啟動(dòng)子區(qū)截?cái)嗥螌?duì)報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度的差異而不驗(yàn)證其在轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子作用的大小，是不能真正說(shuō)明其是否為有功能的啟動(dòng)子核心片段的。等對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)位于- 和   - 兩個(gè)的研究表明與家族性及其發(fā)病年齡均無(wú)相關(guān)性。筆者認(rèn)為，是發(fā)病關(guān)鍵因素分泌酶的重要組件之一，基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸多態(tài)性從一定程度上說(shuō)明了發(fā)病多基因遺傳的復(fù)雜性，提示我們今后的研究工作應(yīng)多著眼于分子轉(zhuǎn)錄水平的功能表達(dá)以及蛋白的結(jié)構(gòu)功能上，而不僅僅是研究基因的結(jié)構(gòu)差異。 （感謝香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院基因研究中心宋又強(qiáng)博士在分子克隆及生物信息學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)支持與幫助）【參考文獻(xiàn)】  楊志勇，汪華僑，張 革，等 國(guó)人外周血抗?茁-淀粉樣蛋白抗體水平的依齡性變化 中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版， ，（）：-陳 輝，張?zhí)?，范海虹，?阿爾茨海默病患者外周血 水平的變化 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志， ，（）：-， ， ， ， ，（-）：- ， ，