1、實(shí)驗(yàn) 1 植物總 DNA 的提取生物總 DNA 的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要內(nèi)容。由于不同的生物材料細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞是提取總DNA 的關(guān)鍵步驟。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)也根據(jù)生物種類的不同而有差異， 因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根據(jù)具體的情況來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)介紹采用CTAB 法提取植物總DNA 的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握學(xué)習(xí)CTAB 法提取植物總DNA 的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握紫外光吸收法鑒定DNA 的純度和濃度。實(shí)驗(yàn)原理植物葉片經(jīng)液氮研磨，可使細(xì)胞壁破裂，加入去污劑(如CTAB) ，可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀，DNA 進(jìn)入水相，

2、再用酚、氯仿抽提純化。本實(shí)驗(yàn)采用CTAB 法，其主要作用是破膜。CTAB 是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB 的處理下，結(jié)合65 水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、 DNA 被釋放出來(lái)。CTAB 與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽(0.7mM)濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度(0.1-0.5mMNaCl)下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)過(guò)氯仿/ 異戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來(lái)純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來(lái)。由于核酸、蛋白質(zhì)、多糖在特定的紫外波長(zhǎng)都有特征

3、吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。純的DNA 樣品A260/280 1.8，純的 RNA 樣品A260/280 2.0，并且1 g/m lDNA 溶液A260=0.020。實(shí)驗(yàn)器材1、高壓滅菌鍋2、冰箱3、恒溫水浴鍋4、高速冷凍離心機(jī)5、紫外分光光度計(jì)6、剪刀7、陶瓷研缽和杵子8、磨口錐形瓶（50ml） 9、滴管10、細(xì)玻棒11、小燒杯（50ml） 12、離心管（50ml） 13、植物材料實(shí)驗(yàn)試劑1、 3 CTAB buffer（ pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2%-巰基乙醇2、 TE 緩沖液（pH8.0）10mmol/L Tr

4、is HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-異戊醇混合液（24： 1， V/V）4、 95乙醇5、液氮1、稱取 2g 新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。2、將葉片剪成1cm 長(zhǎng)，置預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快研磨成粉末。3、待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL 預(yù)熱（60）的CTAB 提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65水浴保溫0.5h，不時(shí)地輕輕搖動(dòng)混勻。4、加等體積的氯仿/異戊醇，蓋上瓶塞，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。5、將錐形瓶中的液體倒入50ml 離心管中，在4下8000rpm 離心10min。6、離心管中出現(xiàn)3 層，用滴管小心地將上層清液吸入另一干凈的離心管中，棄去中間層的細(xì)胞

5、碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。（根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。）7、收集上層清液，并將其倒入小燒杯。沿?zé)诼尤? 倍體積預(yù)冷的95乙醇。邊加邊用細(xì)玻棒沿同一方向攪動(dòng)，可看到纖維狀的沉淀（主要為DNA）迅速纏繞在玻棒上。8、小心取下這些纖維狀沉淀，加1 2 mL 70% 乙醇沖洗沉淀，輕搖幾分鐘，除去乙醇，即為DNA 粗制品。9、將粗制品溶于TE 緩沖液。10、在分光光度計(jì)上測(cè)定該溶液在260nm/280nm 紫外光波長(zhǎng)下的光密度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一組：得到純化的DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，樣品DNA 溶液A260=0.022，A280=0.012，A260/2801.83第

6、二組：得到純化的DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，樣品DNA 溶液A260=0.020，A280=0.011，A260/2801.81第三組：得到純化的DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，樣品DNA 溶液A260=0.024，A280=0.013，A260/2801.84注意事項(xiàng)1、液氮研磨時(shí)，小心操作，以免凍傷。2、所有操作均需溫和，避免劇烈震蕩。思考題CTAB、 EDTA、巰基乙醇的作用分別是什么？液氮研磨的原理是什么？實(shí)驗(yàn)二瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA瓊脂糖是從瓊脂中分離制備的鏈狀多糖，其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。 許多瓊脂糖分子依靠氫鍵及其他力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成

7、大網(wǎng)孔型凝膠。該物質(zhì)對(duì)尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強(qiáng)的抵抗力。在pH4.0-9.0 的緩沖液中穩(wěn)定。由于其分子上無(wú)帶電基團(tuán)，在緩沖液離子強(qiáng)度大于0.05 時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)吸附作用，也無(wú)電滲現(xiàn)象，因而分辨率和重現(xiàn)性均較好，是一種優(yōu)良的電泳材料。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，如DNA 分子的電泳遷移率與其分子量、分子構(gòu)型和所用緩沖液對(duì)遷移率相關(guān)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和原理，以及溴化乙錠染色檢測(cè)核酸的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA 分子的高于等電點(diǎn)的pH 溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。 由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)

8、上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA 幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即 DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子，如pUC19 質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（ covalently closed circularDNA, 簡(jiǎn)稱cccDNA） ，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1

9、條鏈斷裂（open circular DNA ,簡(jiǎn)稱 OCDNA） ，線狀質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2 條鏈發(fā)生斷裂（linear DNA, 簡(jiǎn)稱 L DNA） 。這 3 種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA 分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈 3 條帶， 超螺旋質(zhì)粒DNA 泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA， 最慢的為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。溴化乙錠可以嵌入核酸分子，并且在紫外燈下產(chǎn)生熒光，可用于 檢測(cè)核酸物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)器材 1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、凝膠成像系統(tǒng)3、 DNA marker4、檢測(cè)樣品5、瓊脂糖實(shí)驗(yàn)試劑1、 5 TBE（ 5倍體積的 配 1000ml 5 TBE：Tris 硼酸0.5mol/l

10、 EDTA2、凝膠加樣緩沖液（6 ）溴酚藍(lán) 蔗糖3、溴化乙錠溶液（EB）實(shí)驗(yàn)步驟（一）制備瓊脂糖凝膠TBE 貯存液）54g27.5g20ml（ pH 8.0）0.25%40%0.5 g/ml1、按照被分離DNA 的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚涵傊悄z濃度/%線性 DNA 的有效分離范圍/kb0.35-600.60.70.91.21.52.01-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-32、稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml 0.5 TBE 緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液。（二）膠板的制備1、取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈

11、，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙）。2、有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3、將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4、待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)。5、加入電泳緩沖液至電泳槽中，讓緩沖液蓋過(guò)凝膠。（三）加樣用移液槍將將上樣緩沖液與DNA 樣品按 1:5 比例混合，加入加樣孔中（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。（四）電泳1、接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA 片段從負(fù)極向正5V/cm。極移動(dòng)） 。 DNA 的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過(guò)2、當(dāng)溴酚藍(lán)染料

12、移動(dòng)到距凝膠前沿12cm 處，停止電泳。3、將凝膠小心放入溴化乙錠溶液中，染色30min。4、將染色后的凝膠放入凝膠成像儀中拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到較為明顯的條帶，分子量大的條帶落后。注意事項(xiàng)因?yàn)?EB 是強(qiáng)致癌物質(zhì)，因此染色操作中應(yīng)注意安全不要接觸，并且保持環(huán)境的潔凈。參考文獻(xiàn)精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南（第四版）美 F M 奧斯伯， R E 金斯頓等主編科學(xué)出版社2005實(shí)驗(yàn)三PCR 基因擴(kuò)增PCR 技術(shù)是在1985 年由美國(guó)PE-Cetus 公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)。這一技術(shù)具有劃時(shí)代意義的。其原理類似于DNA 的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合

13、適的條件-摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合適的緩沖體系，DNA 變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握PCR 反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)原理多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction , PCR）的原理類似于DNA 的天然復(fù)制過(guò)程。在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增 2n 倍。1、變性：加熱使模板DNA 在高溫下（94）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。2、退火：使溶液溫度降至5060，模板DNA 與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段。3、延伸：溶液反應(yīng)

14、溫度升至72，耐熱DNA 聚合酶以單鏈DNA 為模板，在引物的引導(dǎo)下， 利用反應(yīng)混合物中的4 種脫氧核苷三磷酸（ dNTP） ， 按 5 3方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA，即引物的延伸階段。上述 3 步為一個(gè)循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3 個(gè)階段。從理論上講，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA 量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)2530 個(gè)循環(huán)后DNA 可擴(kuò)增 106109 倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA 模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、 MgCl2、兩個(gè)合成的 DNA 引物、耐熱Taq 聚合酶。 實(shí)驗(yàn)器材1、 PCR 熱循環(huán)儀2、 tip 頭、冰盒3、 PCR 管

15、 4、超純水5、6、移液槍 實(shí)驗(yàn)試劑2、 10緩沖液500mmol/l KCl100mmol/l Tris?HCl（pH8.3 , 室溫 ）15mmol/l MgCl20.1% 明膠3、 4 dNTP1mmol/l dATP1mmol/l dCTP1mmol/l dGTP1mmol/l dTTP4、 Taq 酶5U/ L5、 DNA 模板1ng/ L5、引物1 、引物 2引物溶液濃度10pmol/ l 實(shí)驗(yàn)步驟1、在PCR 管內(nèi)配制20 L 反應(yīng)體系：反應(yīng)物10 bufferdNTP引物1引物2Taq 酶TemplateddH2O總體積202、按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：、95預(yù)變性、95變性、55退

16、火、72延伸、重復(fù)步驟 30 次；、72延伸3、瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 結(jié)果配制0.7%瓊脂糖凝膠，取10 L 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電流觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物體積/ L2.01.01.01.00.5113.55min1min1min1min10min40mA。電泳結(jié)束后，紫外燈下紫外燈下能明顯看到條帶。 注意事項(xiàng)1、 PCR 加樣時(shí)，盡量保持低溫操作，避免酶失活和模板、引物降解。2、取樣時(shí)注意不要污染藥品。 思考題1、什么是引物二聚體？出現(xiàn)引物二聚體的原因是什么？2、 PCR 儀的熱蓋設(shè)置有什么優(yōu)點(diǎn)？ 參考文獻(xiàn)1、 PCR 技術(shù)操作和應(yīng)用指南主編 林萬(wàn)明人民軍醫(yī)出版社19

17、95 年2、 PCR 技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南美 C.W.迪芬巴赫G.S.德維克斯勒科學(xué)出版社2003 年 實(shí)驗(yàn)四 目的基因片段與克隆載體質(zhì)粒的連接儀器設(shè)備：低溫水浴鍋、冰箱、T4 連接酶、外源DNA 與酶切的載體等。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模褐亟MDNA 連接及鑒定重組子的方法?；疽螅簩W(xué)會(huì)按一定比例用T4 噬菌體 DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理及步驟：外源 DNA 與載體分子的連接就是DNA 重組， 這種重新組合的DNA 叫做重組子。重新組合的DNA 分子是在連接酶的作用下進(jìn)行連接的。DNA 連接酶有兩種：T4噬菌體 DNA 連接酶和大腸桿菌DNA 連接酶。連接反應(yīng)總體積為10L ，體系組成如下：回收純化的PC

18、R 擴(kuò)增目的基因片段7.0 L10 Ligation buffer1.0 LT 載體（ 10ng/ L ）1.0 LT4 DNA ligase1.0 L共 10.0ul混均后，4連接18-24 小時(shí)，連接所得克隆載體命名為TA-VP4-STI 。轉(zhuǎn)化操作方法1）取一管-80保存的感受態(tài)細(xì)胞，置冰上融化；一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100ul, 應(yīng)注意所用DNA 體積不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。以100ul 為例：2）加入連接物（50ul 的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA 所飽和） ，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min ；3）將離心管置于42熱擊60-90 秒，

19、然后迅速置冰浴2-3 分鐘，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管；4）向每個(gè)離心管中加入500ul 液體 LB 培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37搖床振蕩培養(yǎng) 45 分鐘（ 150 轉(zhuǎn) /分鐘）；目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。5）將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100ul 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上（含50 ug/ml 氨芐青霉素），用無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37培養(yǎng)12-16 小時(shí)。至紅、白斑區(qū)分明顯為止。涂布用量可根據(jù)具體試驗(yàn)來(lái)調(diào)整：如轉(zhuǎn)化的DNA 總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA 總

20、量較少，可取200-300ul 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過(guò)離心（4000rpm,2min ）后析除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)板上有已轉(zhuǎn)化的菌斑生成。注意事項(xiàng)：1、感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70，不可多次凍融和放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。2、進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件的要求進(jìn)行。3、為防止轉(zhuǎn)化試驗(yàn)不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到最低。4、氨芐青霉素(Amp) ：使用前用無(wú)菌純水配制母液，濃度為50mg/mL 。實(shí)驗(yàn)五

21、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R， M )， 它可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握CaCl 2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及熱激轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌處于容易吸收外源DNA 的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指

22、質(zhì)粒DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2 低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA 形成抗 DNA 酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA 復(fù)合物。將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型(如Ampr 等)得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。 實(shí)驗(yàn)器材1、超凈工作臺(tái)2、低溫離心機(jī)3、恒溫?fù)u床4、恒溫箱5、恒溫水浴器6、 ppendorf 管、 Tip 頭7、轉(zhuǎn)化的目的質(zhì)粒8、大腸桿菌菌株DH59、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶 實(shí)驗(yàn)試劑1、 1mol/

23、l CaCl 2溶液(高壓滅菌)2、 LB 液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml 去離子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g酵母提取液(bacto-yeast extract)5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.0， 加入去離子水至總體積1L， 121 濕熱滅菌20 min。3、 LB 固體培養(yǎng)基1000ml 加 15g 瓊脂。4、氨芐青霉素（Amp） ，用無(wú)菌水配制成100mg/ml 溶液，置-20冰箱保存。 實(shí)驗(yàn)步驟1、從大腸桿菌DH5 平板上挑取一個(gè)單菌落接于2mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、取0.5m

24、l 菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50ml LB 液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37振蕩培養(yǎng)23 h。 （此時(shí)， OD600 0.40.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必108/ml，此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵）。3、吸菌液1ml 加入 Eppendorf 管， 10,000rpm 離心 15sec回收細(xì)胞。4、用冰預(yù)冷的0.1mol/l CaCl 2500 L 懸浮沉淀。5、再離心15 sec（ 10000rpm ） ，回收細(xì)胞。6、再用冰預(yù)冷的0.1mol/l CaCl 260 L 重懸沉淀。7、在-4下可保存2 周（ 24 d 時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高）。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。8、同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照管：受體菌對(duì)照：60 L 感受態(tài)細(xì)胞+ 2 L 無(wú)菌

25、水質(zhì)粒對(duì)照：60 L 0.1mol/L CaCl 2溶液 + 2 L 質(zhì)粒 DNA 溶液9、將管放到42循環(huán)水浴12min。10、冰浴2min。11、每管加800 L LB 液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1 h（慢搖） 。12、將適當(dāng)體積（200 L ）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。13、倒置平皿37培養(yǎng)1216 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中有菌斑生成 注意事項(xiàng)1、超凈上無(wú)菌操作注意安全。2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡量避免雜菌污染。 思考題1、 CaCl2制備感受態(tài)的可能原因是什么？2、如果平板培養(yǎng)后出現(xiàn)衛(wèi)星斑的可能原因是什么？3、如何提高轉(zhuǎn)化的效率？ 參考文獻(xiàn)精編分

26、子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南（第四版）美 F M 奧斯伯，R E 金斯頓等主編科學(xué)出版社2005部分試劑配法：配制 1MTris-HCl （中文名：三羥甲基氨基甲烷，氨基丁三醇，緩血酸銨）, pH8.5，500ml ，配法是：60.55g Tris + 400ml H2O + 約 20 ml 濃 HCl ， pH 調(diào)至 8.5，定容至500ml.EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定1 .EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（約0.02mol L-1 ）稱取 2.0g 乙二胺四乙酸二鈉（ Na2H2Y 2H2O） 溶于 250mL 蒸餾水中，轉(zhuǎn)入聚乙烯塑料瓶中保存。2 .EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定用 20mL 移液管移取Mg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液于250mL 錐形瓶中，加入10mL 氨性緩沖溶液和34 滴 EBT 指示劑，用0.02mol L -1EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)色即為終點(diǎn)。平行標(biāo)定3 次。1） 2 CTAB 提取液（PH 8.0） ： 2% CTAB ， 1.4MNacl ， 0.02MEDTA ， 0.1MTris-cl ， 0.2%巰基乙醇。 即稱取 CTAB 2 g 加蒸餾水40ml， 加 1M Tris-cl（ PH8.0） 10ml， 0.5M EDTA（ PH 8.0）4ml 和 5M NaCl 28ml,