1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上植物激素檢測(cè)技術(shù)-科標(biāo)檢測(cè) 植物激素是植物體內(nèi)合成的一系列痕量有機(jī)化合物，它在植物的某一部位產(chǎn)生，運(yùn)輸?shù)搅硪粋€(gè)或一些部位，在極低的濃度下便可引發(fā)生理反應(yīng)，幾乎參與了調(diào)控植物從種子休眠、萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)和分化到生殖、成熟和衰老的每個(gè)生命過(guò)程，既可調(diào)控植物自身的生長(zhǎng)發(fā)育，又通過(guò)與植物所生存的外部環(huán)境互相作用調(diào)節(jié)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。通過(guò)調(diào)控如細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯和生長(zhǎng)素等植物激素的代謝可顯著地改良作物的株型結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量構(gòu)成，從而大幅度提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。青島科標(biāo)檢測(cè)研究院-生物實(shí)驗(yàn)室，擁有先進(jìn)的儀器設(shè)備和豐富檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)國(guó)內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)，可以根據(jù)不同樣品不同檢測(cè)需求，值得最優(yōu)檢

2、測(cè)方案為企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)提供精確、公正的數(shù)據(jù)支持。1 植物激素主要包括生長(zhǎng)素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin，CTK)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇類(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水楊酸類(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等，它們?cè)谥参矬w內(nèi)的含量極低(通常在ng/g，甚至pg/g水平上)，且周圍共存的基體成分非常復(fù)雜，幾乎不可能同時(shí)分析所有植物激素。此外，多數(shù)

3、植物激素的性質(zhì)不穩(wěn)定，對(duì)溫度等外界條件敏感，在各器官中呈現(xiàn)定的動(dòng)態(tài)分布。因此精確可靠地對(duì)超微量的植物激素進(jìn)行定性和定量分析尤為重要。 本文僅就近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在茉莉酸及其甲酯、脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素和多肽激素等植物激素分析檢測(cè)技術(shù)的最新發(fā)展及應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。2 主要分析技術(shù) 生物鑒定法是一類經(jīng)典的植物激素檢測(cè)方法，它利用激素作用于植物的組織或器官時(shí)產(chǎn)生的特異性反應(yīng)對(duì)植物激素進(jìn)行測(cè)定。1928年，Went首先將這種方法運(yùn)用于生長(zhǎng)素的測(cè)定，利用生長(zhǎng)素能使燕麥胚芽鞘彎曲的特性來(lái)測(cè)定生長(zhǎng)素濃度。生物鑒定法雖然簡(jiǎn)便，但對(duì)樣品純度要求較高，需要復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)，同時(shí)由于其專一性和重復(fù)性較差，因而這

4、種方法的應(yīng)用逐漸減少。 免疫檢測(cè)技術(shù)是測(cè)定植物激素的常用方法。該方法是基于抗原和抗體的特異性結(jié)合，因此有較好的專一性。采用放射性元素標(biāo)記的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其檢測(cè)靈敏度高，重復(fù)性好，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較高。酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-1inked immunosorbent assay，ELISA)是一種簡(jiǎn)單易行并被廣泛應(yīng)用的分析檢測(cè)技術(shù)，其原理主要是將抗原或抗體固定在載體表面，再與酶標(biāo)記的抗體或抗原進(jìn)行結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的部分后進(jìn)行檢測(cè)。Maldiney等在ELISA中引入抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物體系，測(cè)定了生長(zhǎng)素、脫落酸和玉米素核苷三

5、種激素，檢測(cè)限能夠達(dá)到35pg。此外，免疫傳感器也開始用于植物激素的測(cè)定，主要利用抗原和抗體間的相互作用進(jìn)行識(shí)別，當(dāng)被分析物(抗原)與抗體結(jié)合后，檢測(cè)信號(hào)利用轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，從而進(jìn)行定量檢測(cè)。免疫檢測(cè)的方法一來(lái)容易受到交叉反應(yīng)的干擾；二來(lái)由于抗體的不通用性以及制備時(shí)間較長(zhǎng)，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。 近年來(lái)，色譜技術(shù)的飛速發(fā)展使其在植物激素檢測(cè)中的應(yīng)用越米越廣泛，主要利用各組分在色譜固定相上保留性質(zhì)的差異實(shí)現(xiàn)分離，并根據(jù)色譜圖中得出樣品含量及純度信息。氣相色譜火焰離子化檢測(cè)法(GC-FID)和氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)能夠?qū)λ治鰳悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確、高靈敏度測(cè)量，但由于氣相色譜對(duì)樣品的特殊要求，使

6、得待測(cè)組分需具有一定揮發(fā)性，因此在植物激素樣品的前處理過(guò)程中需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化。高效液相色譜紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)、高效液相色譜熒光檢測(cè)法(HPLC-FL)和高效液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)法(HPLC-MS)也大量用于植物激素的純化及定量分析，其中MS因?yàn)榫哂辛己玫倪x擇性和靈敏度，并且能夠給出化合物的結(jié)構(gòu)信息，在實(shí)際檢測(cè)中得到了更普遍的運(yùn)用。以MS作檢測(cè)器時(shí)，常采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的化合物作為內(nèi)標(biāo)，這樣既扣除了萃取步驟中樣品損失的影響，同時(shí)也能排除背景基質(zhì)干擾，因此使得定量分析結(jié)果更為準(zhǔn)確。此外，毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)的樣品消耗量少、分離效果好，因而也是分離檢測(cè)植物激素的有效手段，但由于靈敏度和重現(xiàn)

7、性等方面的限制阻礙了其進(jìn)一步的運(yùn)用。 另外，目前還有一些其他的分析方法也被用于植物激素的檢測(cè)，如光譜法、電化學(xué)法等。本文主要介紹以色譜法為主的植物激素分析檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展。3 各類植物激素檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀3.1 茉莉酸及其甲酯 茉莉酸(JA)是十二碳的環(huán)戊烷酮酸，具有多種生物功能，可作為植物在應(yīng)對(duì)外界傷害時(shí)產(chǎn)生的抵御信號(hào)，如植物在受到昆蟲取食或非生物脅迫等傷害時(shí)，植株內(nèi)茉莉酸含量就會(huì)增多。Zadra等測(cè)定了番茄在經(jīng)臭氧刺激后，其茉莉酸含量的變化情況。實(shí)驗(yàn)中首先將茉莉酸衍生為具有一定揮發(fā)性的茉莉酸甲酯，然后采用頂空固相微萃取(HS-SPME)-GC-FID/MS進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在停止臭氧熏蒸后9h，

8、番茄葉中檢測(cè)到的榮莉酸的量最高，增加了13倍。該方法快速簡(jiǎn)單，消耗的植物原料少，靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)2ng/g，對(duì)正常植物產(chǎn)生的茉莉酸甲酯含量也可利用此方法進(jìn)行測(cè)定。 Matsuura等建立了利用UPLC-MS/MS MRM(multiple reaction monitoring)方式同時(shí)測(cè)定植物內(nèi)源的茉莉酸、水楊酸及其相關(guān)化合物的方法。采用氘代化合物作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，無(wú)需對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行其他修飾，尤其對(duì)相關(guān)化合物如水楊酸葡萄糖苷(salicylic acid glucoside，SAG)和塊莖酸葡萄糖苷(tuberonic acid glucoside，TAG)等的直接測(cè)定，與傳統(tǒng)的分析方

9、法相比大大節(jié)省了分析時(shí)間。由于SAG、TAG等化合物在植物體內(nèi)的累積會(huì)對(duì)茉莉酸和水楊酸含量有一定影響，通過(guò)測(cè)定這些相關(guān)化合物的含量能夠給出更多關(guān)于茉莉酸和水楊酸的信息，因此對(duì)其進(jìn)行同時(shí)測(cè)定也具有重要的意義。 此外，CE技術(shù)也被用于茉莉酸的分析檢測(cè)。Zhang等利用5-溴甲基熒光素(5-bromomethylfluorescein，5-BMF)作為熒光衍生劑，通過(guò)柱前衍生的方式標(biāo)記茉莉酸，采用CZE-LIF分析模式，檢測(cè)了橡膠樹皮提取物中的茉莉酸含量，并研究了外加損傷情況下和正常生長(zhǎng)樹皮中榮莉酸含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明受到損傷的樣品中茉莉酸含量比正常生長(zhǎng)樣品中高近5倍，這一結(jié)果與茉莉酸的生物功能

10、是一致的。該方法的衍生檢測(cè)限為 5x10-7 mol/L，柱上檢測(cè)靈敏度為2nmol/L。 Flores等將在線RPLC-GC聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于茉莉酸甲酯的分析檢測(cè)中。LC-GC的主要優(yōu)點(diǎn)在于能夠?qū)⒑蟹治鰧?duì)象的樣品餾分從全部轉(zhuǎn)移至GC，而不需要借助其他離線手段從復(fù)雜基質(zhì)里分離目標(biāo)化合物，簡(jiǎn)化了樣品制備過(guò)程，同時(shí)避免了樣品損失，提高了檢測(cè)靈敏度。LC-GC間采用爐轉(zhuǎn)移吸附-解吸接口(through oven transfer adsorption杁esorption,TOTAD)，能夠?qū)崿F(xiàn)從LC到GC間組分轉(zhuǎn)移、去溶劑化等過(guò)程的在線自動(dòng)化操作。該方法能夠方便、快速地對(duì)商品化的茉莉香精中茉莉酸甲酯進(jìn)

11、行檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)0.01mg/L。 Ruiz del Castillo和Blanch用固相微萃取(SFME)-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分離檢測(cè)茉莉酸甲酯的兩種異構(gòu)體：（一）-(3R，7R)和(+)-(3S，7S)-，并對(duì)五種茉莉?qū)僦参锶~、三種迷迭香葉和多種商品化的茉莉、迷迭香香料樣品進(jìn)行了分析比較。發(fā)現(xiàn)在茉莉?qū)僦参镏写嬖谝欢ǚ秶膶?duì)映體過(guò)量(13%95%)，而在所有迷迭香樣品中只存在純的（一）-茉莉酸甲酯異構(gòu)體。另外，在香料樣品中不同的對(duì)映體過(guò)量情況能夠反映出生產(chǎn)工藝中是否有外添加的情況。 Blanch等利用HPLC分離了茉莉酸甲酯的四種手性異構(gòu)體，實(shí)驗(yàn)采用全甲基化的環(huán)糊精手性柱(Nucleode

12、x- -PM column)，當(dāng)流動(dòng)相甲醇(含0.l%乙酸三乙銨)和水的比例為55:45時(shí)，四種異構(gòu)體能夠得到較好的分離。該方法無(wú)需其他柱前衍生步驟即可直接借助HPLC對(duì)四種化合物進(jìn)行分離檢測(cè)，方便快捷，通過(guò)組分收集可以得到純的(-)-和(+)-茉莉酸甲酯，提供了一種制備光學(xué)純茉莉酸甲酯的簡(jiǎn)單方法。3.2 脫落酸 脫落酸(ABA)是一類單環(huán)倍半萜化合物，能夠調(diào)節(jié)植物種子萌發(fā)、氣孔閉合等生理過(guò)程，并且與許多脅迫誘導(dǎo)的基因控制表達(dá)有關(guān)，從而調(diào)節(jié)植物適應(yīng)干旱、鹽度、寒冷等環(huán)境脅迫。因此，通過(guò)考查植物體內(nèi)ABA的濃度變化可獲得關(guān)于ABA生物合成和降解路徑的信息，以及各種生理?xiàng)l件、外界環(huán)境變化等因素對(duì)植

13、物的影響。 Vilar6等用LC-ESI-MS在選擇離子檢測(cè)（selected ion monitoring，SIM)模式下測(cè)定了不同灌溉情況下葡萄葉中的ABA含量，采用氘代ABA作為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)限可達(dá)0.2nmol/g(以干重計(jì))。L?ez-Carbonell等運(yùn)用LC-ESI-MS/MS MRM的方法測(cè)定了微白巖薔薇中脫落酸(MBA)及其主要的葡萄糖偶聯(lián)物-脫落酸葡萄糖酯(ABA-GE)濃度。該方法在萃取樣品前加入一定量的氘代內(nèi)標(biāo)化合物，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的萃取、離心等處理，樣品便可用于LC分析，得到的色譜圖簡(jiǎn)單，易于分析，其中ABA的檢測(cè)限可達(dá)1.4ng/g(以濕重計(jì))。該方法分析了地中海氣候條件下

14、生長(zhǎng)的微白巖薔薇一年內(nèi)其ABA 于ABA-GE的含量變化，結(jié)果表明內(nèi)源ABA的合成至少在一定程度上是同ABA-GE的分解有關(guān)聯(lián)的。 免疫親和色譜技術(shù)也被用于脫落酸的高靈敏檢測(cè)。Hradecká等制備了對(duì)Cl固定的(+)-順，反脫落酸有較高選擇性的多克隆抗體，將其做成免疫親和凝膠柱，與LC-ESI-Ms結(jié)合用于煙草葉中的ABA分析。免疫親和柱的優(yōu)勢(shì)在于能夠快速純化、富集樣品，由于其較高的選擇性，大大降低了復(fù)雜基質(zhì)的影響，簡(jiǎn)化了被分析樣品的成分，使得經(jīng)LC分析得到的譜圖更簡(jiǎn)單、更易辨認(rèn)，靈敏度提高了十幾倍。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)缺水煙草和正常生長(zhǎng)的煙草的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)在缺水條件下內(nèi)源的ABA含量是

15、正常情況的57倍，其值在缺水24 h時(shí)達(dá)到極值，這一結(jié)果與ABA能夠調(diào)節(jié)干旱脅迫的生物功能是相一致的。 此外，CE也用于對(duì)ABA的分析測(cè)定。Liu等發(fā)展了CE-LIF測(cè)定煙草葉中ABA的方法。實(shí)驗(yàn)采用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸鹽(APTS)作為熒光衍生劑，在乙酸和氰基硼氧化鈉存在條件下，與ABA的羰基反應(yīng)形成具有熒光的APTS-ABA衍生物，用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)-LIF進(jìn)行分析檢測(cè)。該方法樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單，衍生檢測(cè)限為2.8×10-8mol/L，柱上檢測(cè)靈敏度可達(dá)l.1nmol/L，足夠用于檢測(cè)實(shí)際植物內(nèi)的痕量ABA。3.3 生長(zhǎng)素 生長(zhǎng)素是最先被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素，主要由

16、吲哚衍生物構(gòu)成，是主要的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、伸長(zhǎng)和分化。 Lu等利用LC-ESI-離子阱質(zhì)譜(TTMS)同時(shí)測(cè)定了四種生長(zhǎng)素：內(nèi)源性的吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸（IBA)和外源性的吲哚-3-丙酸(IPA)、l-萘乙酸(NAA)。該四種化合物在7 min內(nèi)出峰并實(shí)現(xiàn)基線分離，方法的檢測(cè)限達(dá)8.0ng/mL。Rolèík等利用固相萃取(SPE)技術(shù)提取和純化植物葉中IAA，并優(yōu)化了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分兩步使用C18-SPE柱，第一步將粗提溶液過(guò)柱除去葉綠素和其他殘?jiān)缓笤谙♂尩南疵撘褐屑尤爰姿崾笽AA質(zhì)子化成中性結(jié)構(gòu)，中性的IAA再次經(jīng)

17、C18柱保留、甲醇洗脫后進(jìn)行分析。用氚標(biāo)記的IAA作標(biāo)準(zhǔn)溶液，閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量IAA在不同洗脫強(qiáng)度下的保留情況，從而優(yōu)化洗脫液成分。純化后的樣品再經(jīng)中基化衍生后用GC-MS測(cè)定IAA含量。采用該方法測(cè)定了天竺葵屬植物葉中的IAA，其含量為84 ng/g(以濕重計(jì))。 Dobrev等發(fā)展了二維液相技術(shù)分離測(cè)定生長(zhǎng)素的方法。經(jīng)過(guò)SPE處理后的樣品進(jìn)入第一維進(jìn)行初步分離后，采用"中心切割(heart cutting)"的方法，將第一維的部分組分引入第二維進(jìn)行再次分離，使分離純化效果明顯提高，即使不采用質(zhì)譜檢測(cè)的選擇離子檢測(cè)模式，而利用選擇檢測(cè)性不高的紫外或熒光檢測(cè)器時(shí)，得到的分離效果

18、依然令人滿意，用熒光檢測(cè)器對(duì)IAA的檢測(cè)限可達(dá)0.4 pmol。3.4 赤霉素 赤霉素(GA)是一類四環(huán)二萜羧酸化合物，能夠調(diào)節(jié)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如種子萌發(fā)、莖的伸長(zhǎng)、葉的伸展和開花等過(guò)程。Taylor等利用GC-MS分析了在短日照草莓葉分泌物中GA的含量情況，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比全譜掃描和Kovats保留指數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中存在GA1、GA3、3-epi GAl和GA3-異內(nèi)酯。 Ge等發(fā)展了一種CE-MS的方法，利用陽(yáng)離子聚合物涂層的毛細(xì)管分離了11種GA(GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA7、GA13、GAl9、GA20、GA24和GA53)的混合液，存25min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，對(duì)

19、11種化合物的檢出限達(dá)亞微摩爾濃度，在實(shí)際樣品椰汁的分析中檢出了GA1和GA3。實(shí)驗(yàn)中用SPE處理樣品時(shí)，采用同時(shí)具有反相和陰離子交換性質(zhì)的混合型吸附材料，有較好的純化效果，回收率能達(dá)95%。隨后，他們又進(jìn)一步發(fā)展了部分填充(PF)-子表面活性劑十六烷基三甲基銨，分離了八種GA混合物，檢測(cè)限仍為亞微摩爾濃度級(jí)別，同樣在椰汁中檢出了GA1和GA3。3.5 多肽激素 長(zhǎng)期以來(lái)，人們認(rèn)為植物細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是由生長(zhǎng)素、脫落酸、茉莉酸、細(xì)胞分裂素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等親脂小分子完成的，因而將它們作為經(jīng)典的植物激素；但近二十年間的研究表明，一些植物多肽同樣參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，同樣能夠作為被傳遞

20、的信號(hào)，行使激素的功能。對(duì)于植物多肽激素的認(rèn)識(shí)還在進(jìn)一步的深入中，多肽激素的種類也在逐漸增加，較公認(rèn)的多肽激素有系統(tǒng)素、植物硫肽素、SCR/SPl1、CLV3和快速堿化因子等。 系統(tǒng)素是一類研究得相對(duì)較多的多肽激素，含有18個(gè)氨基酸，是系統(tǒng)性防御反應(yīng)的信號(hào)分子，當(dāng)植物受到傷害時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生防衛(wèi)性蛋白。1991年，Pearce等從番茄葉中首次分離鑒定出系統(tǒng)素，實(shí)驗(yàn)中取2kg番茄葉，經(jīng)過(guò)勻漿、凝膠過(guò)濾及反復(fù)多次的C18反相柱和強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱純化，得到近1g較純的系統(tǒng)素，其氨基酸序列為AVQSKPpSKR-DPPKMQTD。 Mucha等發(fā)展了用CE檢測(cè)系統(tǒng)素純化效果的方法，以合成的系統(tǒng)素作為標(biāo)準(zhǔn)物，追

21、蹤各個(gè)色譜步驟中內(nèi)源系統(tǒng)素的提純效果。實(shí)驗(yàn)中利用簡(jiǎn)單的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE)模式便可以較好的將系統(tǒng)素分離，用于分析經(jīng)過(guò)各個(gè)提純步驟后的樣品，從而判斷系統(tǒng)素的純度情況。3.6 多種激素同時(shí)測(cè)定 由于各類植物激素在植物體內(nèi)同時(shí)存存，它們?cè)谡{(diào)控植物的各種生理過(guò)程中具有協(xié)同作用，因此，同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定多類植物激素對(duì)研究植物激素的作用機(jī)理非常重要。 Schmelz等采用GC-MS方法同時(shí)測(cè)定了玉米、煙草、番茄和擬南芥等植物中的JA、IAA、ABA及其相應(yīng)的甲酯，并研究了環(huán)境脅迫條件下植物體內(nèi)各激素含量的變化情況及其對(duì)植物體揮發(fā)性物質(zhì)的影響。Zhang等利用GC-MS方法分析了五角楓、白蠟槭和玉米中JA、ABA和IAA的含量。實(shí)驗(yàn)中以氘代或13C標(biāo)記的化合物為內(nèi)標(biāo)，只需少量植物