1、會計學1DNA測序技術及其應用測序技術及其應用第一頁，編輯于星期六：六點 十七分。引言引言測序技術的應用與展望測序技術的應用與展望第一代測序技術第一代測序技術第二代測序技術第二代測序技術第1頁/共65頁第二頁，編輯于星期六：六點 十七分。第2頁/共65頁第三頁，編輯于星期六：六點 十七分。人類基因組計劃（人類基因組計劃（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于于19901990年正式啟動，其主要目標有：識別人類年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNADNA中中所有基因（超過所有基因（超過1010萬個）；測定組成人類萬個）；測定組成人類DN

2、ADNA的的3030億堿億堿基對的序列基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；開發(fā)出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能出有關數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于20032003年完成年完成。人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工人類基因組計劃是當代生命科學一項偉大的科學工程，它奠定了程，它奠定了2121世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技世紀生命科學發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術產(chǎn)業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨術產(chǎn)業(yè)化的基礎，具有科學上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。大價值。第3頁/共65頁第

3、四頁，編輯于星期六：六點 十七分。 測序技術最早可以追溯到測序技術最早可以追溯到20世紀世紀50年代。年代。 早在早在1945年年就已經(jīng)出現(xiàn)了關于早期測序技術的報導，就已經(jīng)出現(xiàn)了關于早期測序技術的報導，即即Whitfeld等用化學降解的方法測定多聚核糖核苷酸等用化學降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。序列。19771977年年Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法等發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技標志著第一代測序技術的誕生術的誕生。 此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測序技術此后在三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測序

4、技術，包括，包括Roche公司的公司的454技術技術、Illumina公司的公司的SolexaSolexa技術技術和和ABI公司的公司的SOLiD技術技術。第4頁/共65頁第五頁，編輯于星期六：六點 十七分。 最近，最近，Helicos公司的單分子測序技術、公司的單分子測序技術、Pacific Biosciences公司的單分子實時公司的單分子實時( (Single Molecule Real Time, SMRT) )測序技術和測序技術和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術公司正在研究的納米孔單分子測序技術被認為是第三代測序技術。被認為是

5、第三代測序技術。 測序技術正在向著高通量、低成本、長讀取長度測序技術正在向著高通量、低成本、長讀取長度的方向發(fā)展。的方向發(fā)展。第5頁/共65頁第六頁，編輯于星期六：六點 十七分。第6頁/共65頁第七頁，編輯于星期六：六點 十七分。第7頁/共65頁第八頁，編輯于星期六：六點 十七分。第8頁/共65頁第九頁，編輯于星期六：六點 十七分。第9頁/共65頁第十頁，編輯于星期六：六點 十七分。第10頁/共65頁第十一頁，編輯于星期六：六點 十七分。第11頁/共65頁第十二頁，編輯于星期六：六點 十七分。第12頁/共65頁第十三頁，編輯于星期六：六點 十七分。 POHdNTPddNTP POHOH P P

6、 P POH第13頁/共65頁第十四頁，編輯于星期六：六點 十七分。第14頁/共65頁第十五頁，編輯于星期六：六點 十七分。第15頁/共65頁第十六頁，編輯于星期六：六點 十七分。第16頁/共65頁第十七頁，編輯于星期六：六點 十七分。3730全自動測序儀第17頁/共65頁第十八頁，編輯于星期六：六點 十七分。第18頁/共65頁第十九頁，編輯于星期六：六點 十七分。第19頁/共65頁第二十頁，編輯于星期六：六點 十七分。 第一代測序技術在分子生物學研究中發(fā)揮第一代測序技術在分子生物學研究中發(fā)揮過重要的作用過重要的作用, ,如人類基因組計劃如人類基因組計劃(human (human genome

7、 project,HGP)genome project,HGP)主要基于第一代主要基于第一代DNADNA測序測序技術。目前基于熒光標記和技術。目前基于熒光標記和SangerSanger的雙脫氧鏈的雙脫氧鏈終止法原理的終止法原理的熒光自動測序儀熒光自動測序儀仍被廣泛地應用仍被廣泛地應用。第20頁/共65頁第二十一頁，編輯于星期六：六點 十七分。第21頁/共65頁第二十二頁，編輯于星期六：六點 十七分。 基因組基因組DNA DNA DNA DNA片段（片段（cDNAcDNA）構建構建ssDNAssDNA文庫文庫測序測序（聚合酶合成測序聚合酶合成測序，連接酶合成測序連接酶合成測序） 由于所有的克隆都

8、在同一平面上，這些反應就能夠大規(guī)模平行進行由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應就能夠大規(guī)模平行進行，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，從而獲得，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行，從而獲得測序數(shù)據(jù)。測序數(shù)據(jù)。DNADNA序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經(jīng)過計算機分析就可序列延伸和成像檢測不斷重復，最后經(jīng)過計算機分析就可以獲得完整的以獲得完整的DNADNA序列信息序列信息。 第22頁/共65頁第二十三頁，編輯于星期六：六點 十七分。 在在聚合酶聚合酶、硫酸化酶硫酸化酶、熒光素酶熒光素酶和和雙磷酸酶雙磷酸酶的作用下，將每一個的作用下，將每一個的聚合的聚合與一次化

9、學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測序列的目的。序列的目的。第23頁/共65頁第二十四頁，編輯于星期六：六點 十七分。硫化酶硫化酶熒光素酶熒光素酶第24頁/共65頁第二十五頁，編輯于星期六：六點 十七分。第25頁/共65頁第二十六頁，編輯于星期六：六點 十七分。指示器指示器相機相機PTPPTP盒盒第26頁/共65頁第二十七頁，編輯于星期六：六點 十七分。 454 454測序法的突測序法的突出優(yōu)勢是出優(yōu)勢是較長的讀長較長的讀長，目前，目前GS GS FLXFLX測序系統(tǒng)的序列讀長已

10、超過測序系統(tǒng)的序列讀長已超過400 bp400 bp。雖然。雖然454454平臺的測序成本比其他新一代測序平臺要平臺的測序成本比其他新一代測序平臺要高很多，但對于那些需要長讀長的應用，如從高很多，但對于那些需要長讀長的應用，如從頭測序，它仍是最理想的選擇。頭測序，它仍是最理想的選擇。 缺點是缺點是無法準確測量同聚物的長度無法準確測量同聚物的長度。第27頁/共65頁第二十八頁，編輯于星期六：六點 十七分。 Illumina公司的新一代測序儀公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由最早由Solexa公公司研發(fā)，利用合成測序司研發(fā)，利用合成測序( (Sequencingby Synth

11、esis) )的原理，實現(xiàn)自動的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序?；瘶颖局苽浼按笠?guī)模平行測序。原理：原理： 將基因組將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即面（即Flow cell），這些），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在后，在Flow cell上形成了數(shù)以億上形成了數(shù)以億Cluster，每個，每個Cluster是是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序

12、）技術對待測的模板邊合成邊測序）技術對待測的模板DNA進行測序進行測序。第28頁/共65頁第二十九頁，編輯于星期六：六點 十七分。第29頁/共65頁第三十頁，編輯于星期六：六點 十七分。第30頁/共65頁第三十一頁，編輯于星期六：六點 十七分。第31頁/共65頁第三十二頁，編輯于星期六：六點 十七分。 GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的系統(tǒng)需要的樣品量低樣品量低至至100ng，文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到，配對末端讀長可達到250bp，每次運行后可獲，每次運行后可獲得超過得超過20 GB的高質量過濾數(shù)據(jù)，且運

13、行成本較低的高質量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術。，是性價比較高的新一代測序技術。第32頁/共65頁第三十三頁，編輯于星期六：六點 十七分。 SOLID通過連接反應進行測序。其基本原理是以四通過連接反應進行測序。其基本原理是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：合酶連接反應。具體步驟包括：文庫準備文庫準備擴增擴增微珠與玻片連接微珠與玻片連接連接測序連接測序第33頁/共65頁第三十四頁，編輯于星期六：六點 十七分。第34頁/共65頁第三十五頁，編輯于星期六：六點 十七分。第35頁

14、/共65頁第三十六頁，編輯于星期六：六點 十七分。第36頁/共65頁第三十七頁，編輯于星期六：六點 十七分。 超高通量超高通量是是SOLID系統(tǒng)最突出的特點，系統(tǒng)最突出的特點，目前目前SOLID 3單次運行可產(chǎn)生單次運行可產(chǎn)生50 GB的序列數(shù)的序列數(shù)據(jù)，相當于據(jù)，相當于17倍人類基因組覆蓋度。倍人類基因組覆蓋度。第37頁/共65頁第三十八頁，編輯于星期六：六點 十七分。第38頁/共65頁第三十九頁，編輯于星期六：六點 十七分。 第二代的高通量測序技術已經(jīng)得到了很好的發(fā)第二代的高通量測序技術已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應用展和應用, , 但是由于其但是由于其測序速度、成本、準確度測序速度、成本、準確

15、度等關鍵等關鍵問題的解決仍存在困難問題的解決仍存在困難, ,研究者們很快將目光轉向了研究者們很快將目光轉向了更高更新的測序解決方案。更高更新的測序解決方案。 單分子測序也就應運而單分子測序也就應運而生。生。 20092009年年1212月月, ,中科院北京基因組研究所與浪潮成立中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所中科院北京基因組研究所浪潮基因組科學聯(lián)合浪潮基因組科學聯(lián)合實驗室實驗室”第39頁/共65頁第四十頁，編輯于星期六：六點 十七分。三代測序技術是以三代測序技術是以單分子測序單分子測序為特點的測序技術為特點的測序技術v 單分子即時單分子即時DNA測測序技術序技術( (S

16、MRT) )v HeliScope單分子測序單分子測序v 基于熒光共振能量轉移的即時基于熒光共振能量轉移的即時DNA測序測序v 納米孔單分子測序技術納米孔單分子測序技術第40頁/共65頁第四十一頁，編輯于星期六：六點 十七分。第三代測序技術第三代測序技術1 1、目前一期的讀取速度為目前一期的讀取速度為3bp/ s3bp/ s2 2、它實現(xiàn)了、它實現(xiàn)了DNADNA聚合酶內(nèi)在自身的聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是延續(xù)性，也就是DNADNA聚合酶一次可以合成很長的聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。片段），一個反應就可以測非常長的序列。 3 3、它的

17、精度非常高，達到、它的精度非常高，達到99.9999%99.9999%。第41頁/共65頁第四十二頁，編輯于星期六：六點 十七分。標記熒光基因標記熒光基因DNA聚合酶作用 顯微鏡下進行熒光探測顯微鏡下進行熒光探測 零級波導的納米結構零級波導的納米結構來實現(xiàn)來實現(xiàn)即時觀察和背景熒光干擾即時觀察和背景熒光干擾第42頁/共65頁第四十三頁，編輯于星期六：六點 十七分。DNA聚合酶第43頁/共65頁第四十四頁，編輯于星期六：六點 十七分。 優(yōu)點：優(yōu)點：采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)，能夠直接記錄到采用了一種新的熒光類似物和更加靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)，能夠直接記錄到單單個堿基個堿基的熒光，從而克服

18、了第二代測序必須用的熒光，從而克服了第二代測序必須用PCRPCR擴增出數(shù)千個拷貝以增加信號亮度的缺陷擴增出數(shù)千個拷貝以增加信號亮度的缺陷。DNADNA聚聚合合酶酶熒光標記熒光標記的的dNTPdNTP產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光 CCD記錄記錄發(fā)生了堿基延伸反應發(fā)生了堿基延伸反應平面基板模擬圖平面基板模擬圖第44頁/共65頁第四十五頁，編輯于星期六：六點 十七分。能量第45頁/共65頁第四十六頁，編輯于星期六：六點 十七分。 DNADNA分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔, ,利用核酸外切酶的特性來識別出不同的利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNADNA堿基堿

19、基 優(yōu)點：納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對優(yōu)點：納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對DNADNA進行標記進行標記，也就省去了昂貴的熒光試劑和，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCDCCD照相機。照相機。內(nèi)部：核酸外切酶和環(huán)式糊精由生物分子組成的納米孔由生物分子組成的納米孔第46頁/共65頁第四十七頁，編輯于星期六：六點 十七分。第47頁/共65頁第四十八頁，編輯于星期六：六點 十七分。第48頁/共65頁第四十九頁，編輯于星期六：六點 十七分。第49頁/共65頁第五十頁，編輯于星期六：六點 十七分。第50頁/共65頁第五十一頁，編輯于星期六：六點 十七分。完成全基因組測序的部分的物種完成全基因組測序的部分的物

20、種第51頁/共65頁第五十二頁，編輯于星期六：六點 十七分。第52頁/共65頁第五十三頁，編輯于星期六：六點 十七分。第53頁/共65頁第五十四頁，編輯于星期六：六點 十七分。 轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉錄出來的所有能狀態(tài)下所能轉錄出來的所有RNARNA的總和，包括的總和，包括mRNAmRNA和非編碼和非編碼RNARNA。轉錄組測序是指用新一代高通。轉錄組測序是指用新一代高通量測序技術對物種或者組織的轉錄本進行測序并量測序技術對物種或者組織的轉錄本進行測序并得到相關的轉錄本信息。得到相關的轉錄本信息。第54頁/共65頁第五十五頁，編輯于星期六：六點 十七分。第55頁/共65頁第五十六頁，編輯于星期六：六點 十七分。第56頁/共65頁第五十七頁，編輯于星期六：六點 十七分。第57頁/共65頁第五十八頁，編輯于星期六：六點 十七分。第58頁/共65頁第五十九頁，編輯于星期六：六點 十七分。第59頁/共65頁第六十頁，編輯于星期六：六點 十七分。第60頁/共65頁第六十一頁，編輯于星