1、(1)第七節(jié) 重組DNA篩選與鑒定基因工程之基因工程之Screening of recombinant DNA通常將攝取外源通常將攝取外源DNA 分子并能使該分子在分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)克隆子克隆子；把采用轉(zhuǎn)化方法獲得的克隆子叫做把采用轉(zhuǎn)化方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子。一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。 重組體重組體DNADNA分子經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑引入宿主分子經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑引入宿主細(xì)胞會(huì)得到重組體細(xì)胞和噬菌體，其中有多種細(xì)胞會(huì)得到重組體細(xì)胞和噬菌體，其中有多種DNADNA發(fā)生：發(fā)生： 自連（末連入外源片段的

2、載體）自連（末連入外源片段的載體） 一個(gè)載體分子與數(shù)個(gè)外源片段連接一個(gè)載體分子與數(shù)個(gè)外源片段連接 單純外源片段連成的多聚體（由于沒(méi)有單純外源片段連成的多聚體（由于沒(méi)有復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制基因不能長(zhǎng)期存活）復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制基因不能長(zhǎng)期存活） 目的重組子（載體與一個(gè)目的片段相連目的重組子（載體與一個(gè)目的片段相連接）接） 因而對(duì)于得到的大量克隆群體要進(jìn)行篩選和鑒因而對(duì)于得到的大量克隆群體要進(jìn)行篩選和鑒定定從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選含有陽(yáng)性重組從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選含有陽(yáng)性重組DNADNA分子分子的菌落，并鑒定重組的菌落，并鑒定重組DNADNA分子的正確性。分子的正確性。目的基因的篩選和鑒定目的基因的篩選和鑒定（

3、篩篩）1、針對(duì)遺傳表型篩選、針對(duì)遺傳表型篩選2 2、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選快速裂解菌落，鑒定分子大小快速裂解菌落，鑒定分子大小內(nèi)切酶圖譜鑒定內(nèi)切酶圖譜鑒定PCRPCR篩選重組子篩選重組子核酸分子雜交核酸分子雜交1.1 根據(jù)載體標(biāo)記基因篩選根據(jù)載體標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，呈現(xiàn)出標(biāo)記基因在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，主要作為篩選特殊的表型或遺傳學(xué)特性，主要作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。常用的標(biāo)記基因常用的標(biāo)記基因主要是抗性基因以及表達(dá)主要是抗性基因以及表達(dá)產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因。產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因

4、。1、針對(duì)遺傳表型篩選、針對(duì)遺傳表型篩選抗生素篩選法抗生素篩選法(1) 單抗生素篩選單抗生素篩選 大多數(shù)克隆載體帶有抗生素抗性基因，如大多數(shù)克隆載體帶有抗生素抗性基因，如氨芐青霉素（氨芐青霉素（ampicillin, Amp）、四環(huán)素）、四環(huán)素(tetracycline,Tet)、卡那霉素、卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性基因。帶有完整抗生素基因的載體轉(zhuǎn)化宿抗性基因。帶有完整抗生素基因的載體轉(zhuǎn)化宿主菌后，其宿主菌能在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂主菌后，其宿主菌能在含有相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長(zhǎng)。平板上生長(zhǎng)。 （2）雙抗生素篩選）雙抗生素篩選雙抗生素篩選結(jié)果示意圖雙抗生素篩選結(jié)果示意圖插入失

5、活篩選法插入失活篩選法當(dāng)外源當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。素的培養(yǎng)平板上。 抗生素平板篩選抗生素平板篩選（插入失活插入失活）互補(bǔ)：互補(bǔ)：lazlaz編碼的編碼的肽鏈；肽鏈；半乳糖苷酶突變體半乳糖苷酶突變體-互補(bǔ)（互補(bǔ)（-complementation）：）：許多載體（如許多載體（如M13M13系列、系列、pUCpUC系列、系列、pGEMpGEM系列）都含系列）都含有有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（laclacZ Z）的調(diào)控序列和氨基端的調(diào)控序列和氨

6、基端145145個(gè)氨基酸的編碼序列個(gè)氨基酸的編碼序列。 （又稱(chēng)（又稱(chēng)-肽）；肽）；這類(lèi)載體對(duì)應(yīng)的宿主菌（如這類(lèi)載體對(duì)應(yīng)的宿主菌（如JMJM、DH5DH5系列）系列）-半半乳糖苷酶基因失去了編碼乳糖苷酶基因失去了編碼-肽堿基序列肽堿基序列只有當(dāng)這類(lèi)載體引入到宿主菌后，載體上的只有當(dāng)這類(lèi)載體引入到宿主菌后，載體上的-半乳半乳糖苷酶糖苷酶N-N-端片端才能與宿主菌的缺陷端片端才能與宿主菌的缺陷-半乳糖苷酶半乳糖苷酶互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，這種作用稱(chēng)為半乳糖苷酶，這種作用稱(chēng)為-互補(bǔ)。互補(bǔ)。藍(lán)藍(lán)-白白篩選篩選顯色反應(yīng)選擇法顯色反應(yīng)選擇法(-互補(bǔ)法互補(bǔ)法)藍(lán)藍(lán)- -白白篩選篩選:

7、 : （互補(bǔ)）互補(bǔ)）載體：載體：編碼編碼-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 編碼編碼-半乳糖半乳糖 苷苷酶酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列細(xì)菌表達(dá)細(xì)菌表達(dá)： - -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性 （ X-gal） 形成形成當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不能與宿主不能與宿主-半乳糖半乳糖苷苷酶的酶的C端端進(jìn)行進(jìn)行-互補(bǔ)互補(bǔ)產(chǎn)生產(chǎn)生（IPTG 存在下）存在下） - -互補(bǔ)互補(bǔ)IPTG（異丙基（異丙基-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷 ）存在下，）存在下，（誘導(dǎo)（誘導(dǎo)LacZ及及LacZ(F因子上因子上)表達(dá)）表達(dá)）白色菌落。白

8、色菌落。 (5-溴溴-4氯氯-3-吲哚吲哚-D- 半乳糖苷半乳糖苷) 藍(lán)色菌落藍(lán)色菌落互補(bǔ)顯色反應(yīng)互補(bǔ)顯色反應(yīng) 互補(bǔ)顯色反應(yīng)互補(bǔ)顯色反應(yīng) 報(bào)告基因的檢測(cè)報(bào)告基因的檢測(cè)法法 是一種快速而簡(jiǎn)易地區(qū)分轉(zhuǎn)基因生物和非是一種快速而簡(jiǎn)易地區(qū)分轉(zhuǎn)基因生物和非轉(zhuǎn)基因生物的方法。轉(zhuǎn)基因生物的方法。報(bào)告基因檢測(cè)法：指在構(gòu)建目的基因時(shí)將一報(bào)告基因檢測(cè)法：指在構(gòu)建目的基因時(shí)將一種報(bào)告基因種報(bào)告基因( (如如GUSGUS基因基因) )構(gòu)建在一起，當(dāng)目的構(gòu)建在一起，當(dāng)目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因一同被轉(zhuǎn)入?；蜣D(zhuǎn)入受體細(xì)胞時(shí)，報(bào)告基因一同被轉(zhuǎn)入。 報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或報(bào)告基因：是一種編碼可被檢測(cè)的蛋

9、白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。容易被鑒定的基因。1.2根據(jù)報(bào)道（告）基因篩選根據(jù)報(bào)道（告）基因篩選 gus gus的基因產(chǎn)物的基因產(chǎn)物-葡萄葡萄糖酸酶（糖酸酶（GUSGUS）能夠催化）能夠催化4-4-甲基傘形花酮甲基傘形花酮-D-D-葡萄糖葡萄糖苷酸，苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-4-甲基甲基傘形花酮，以此篩選含傘形花酮，以此篩選含gusgus基因的轉(zhuǎn)化子?；虻霓D(zhuǎn)化子。 由于植物細(xì)胞由于植物細(xì)胞GUSGUS本底非本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。選植物轉(zhuǎn)化子。 尤其是尤其是gusg

10、us基因的基因的33端端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達(dá)，產(chǎn)嵌合基因仍能正常表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有生的融合蛋白中仍有GUSGUS活活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。生物體中的定位分析。 luc luc表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲(chóng)熒光素表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲(chóng)熒光素酶（酶（LUCLUC）在）在MgMg2+2+的作用下的作用下，可以可以與熒光素和與熒光素和ATPATP底物發(fā)生反應(yīng)底物發(fā)生反應(yīng)，形成與酶結(jié)合的形成與酶結(jié)合的腺苷酸熒光素酰腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物化復(fù)合物，經(jīng)過(guò)氧化脫羧作用后經(jīng)過(guò)氧化脫羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為

11、處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測(cè)定的氧化熒光素，可以用熒光測(cè)定儀快速靈敏地檢測(cè)出產(chǎn)生的熒光，儀快速靈敏地檢測(cè)出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因很好用是目前研究動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報(bào)告基因。的一種報(bào)告基因。 LucLuc基因檢測(cè)十分迅速，靈基因檢測(cè)十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測(cè)對(duì)人體健康和環(huán)境生同位素檢測(cè)對(duì)人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒(méi)有內(nèi)源熒態(tài)所造成的危害，也沒(méi)有內(nèi)源熒光產(chǎn)牛的背景干擾，因此，光產(chǎn)牛的背景干擾，因此，LucLuc是一種理想的報(bào)告基因。是一種理想的報(bào)告基因。 -葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（gus）螢火蟲(chóng)熒光素酶

12、基因（螢火蟲(chóng)熒光素酶基因（luc）gus gus 基因基因（葡醛糖酸酶，（葡醛糖酸酶，GUSGUS） 4-4-甲基傘形花酮甲基傘形花酮-D-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-4-甲基傘甲基傘形花酮形花酮 易檢測(cè)、定量、靈敏度高易檢測(cè)、定量、靈敏度高 熒光素酶基因熒光素酶基因lucluc， 營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)法營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)法 已知蛋白質(zhì)中的亮氨酸（已知蛋白質(zhì)中的亮氨酸（LeuLeu）為）為L(zhǎng)euLeu營(yíng)養(yǎng)缺陷菌營(yíng)養(yǎng)缺陷菌所必需所必需, , 當(dāng)外源目的基因可表達(dá)亮氨酸當(dāng)外源目的基因可表達(dá)亮氨酸, , 將該基因的將該基因的重組子轉(zhuǎn)入重組子轉(zhuǎn)入LeuLeu缺陷菌中缺陷菌中, , 在

13、不含亮氨酸的基本培養(yǎng)基在不含亮氨酸的基本培養(yǎng)基平板中平板中, , 只有重組子表達(dá)的亮氨酸才能被只有重組子表達(dá)的亮氨酸才能被LeuLeu缺陷菌所缺陷菌所利用而能生長(zhǎng)繁殖利用而能生長(zhǎng)繁殖, ,形成菌落。因而能生長(zhǎng)的細(xì)菌集落，形成菌落。因而能生長(zhǎng)的細(xì)菌集落，均為陽(yáng)性的重組子克隆，而無(wú)該重組子的均為陽(yáng)性的重組子克隆，而無(wú)該重組子的LeuLeu缺陷菌在缺陷菌在不含亮氨酸的平板上則不能生長(zhǎng)，不能形成菌落。不含亮氨酸的平板上則不能生長(zhǎng)，不能形成菌落。營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)：營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)： 細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖細(xì)胞在缺乏一種或幾種營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，不能生長(zhǎng)繁殖即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞

14、營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原即營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞。利用兩種親本細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)作用原理可以篩選雜種細(xì)胞。如：理可以篩選雜種細(xì)胞。如： A A：色氨酸缺陷型；：色氨酸缺陷型；B B：蘇氨酸缺陷型：蘇氨酸缺陷型 雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，雜種細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。而親本細(xì)胞均會(huì)死亡。 通過(guò)系列篩選方法獲得轉(zhuǎn)化子后，為通過(guò)系列篩選方法獲得轉(zhuǎn)化子后，為了確定獲得的轉(zhuǎn)化子是真正需要的重了確定獲得的轉(zhuǎn)化子是真正需要的重組子，還須進(jìn)一步分析鑒定重組子基組子，還須進(jìn)一步分析鑒定重組子基因組中的外源因組中的外源DNADNA片段、目的基因轉(zhuǎn)錄片段、目的基因轉(zhuǎn)錄的的mRNA

15、mRNA或翻譯的多肽（蛋白質(zhì)、酶）?；蚍g的多肽（蛋白質(zhì)、酶）。2、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選2.1根據(jù)重組根據(jù)重組DNA 分子大小鑒定分子大小鑒定 主要是根據(jù)主要是根據(jù)有外源有外源DNADNA片段插入載體后的重組片段插入載體后的重組DNADNA與載與載體體DNADNA之間的大小差異之間的大小差異來(lái)鑒定重組子。來(lái)鑒定重組子。 分別提取不同轉(zhuǎn)化子的分別提取不同轉(zhuǎn)化子的DNADNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由于，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，由于重組重組DNADNA是載體是載體DNADNA中插入了外源中插入了外源DNADNA片段，其分子量大片段，其分子量大于載體于載體DNADNA分子，在瓊脂

16、糖凝膠板上出現(xiàn)的分子，在瓊脂糖凝膠板上出現(xiàn)的DNADNA帶中，帶中，落后的帶是重組落后的帶是重組DNADNA的帶的帶。 這是對(duì)重組子進(jìn)行分析鑒定的最基本、最簡(jiǎn)單的方法，這是對(duì)重組子進(jìn)行分析鑒定的最基本、最簡(jiǎn)單的方法，直觀快捷，只須獲得質(zhì)粒直觀快捷，只須獲得質(zhì)粒DNADNA分子的粗制裂解液即可進(jìn)分子的粗制裂解液即可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，尤其適用于插入片段較大的重組行瓊脂糖凝膠電泳，尤其適用于插入片段較大的重組子的篩選。子的篩選。 此方法只用于重組子的初步鑒定。此方法只用于重組子的初步鑒定。2.2酶切鑒定酶切鑒定 用抗生素篩選、藍(lán)白篩選等方法篩選出的菌落需進(jìn)一步進(jìn)行用抗生素篩選、藍(lán)白篩選等方法篩選出

17、的菌落需進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析，鑒定插入片段的大小和插入方向。酶切分析，鑒定插入片段的大小和插入方向。 （1） 插入片段大小的鑒定插入片段大小的鑒定 （2） 插入片段方向性的鑒定插入片段方向性的鑒定限制性?xún)?nèi)切酶圖譜鑒定限制性?xún)?nèi)切酶圖譜鑒定 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷酶解片段向陽(yáng)極移動(dòng)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力和凝膠阻力 不同遷移率分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物l 酶切和電泳方法2.32.3利用利用PCRPCR方法篩選確定重組子方法篩選確定重組子 由于在載體由于在載體DNADNA分子中，分子中，外源外源DNADNA插入位點(diǎn)的兩側(cè)插入位點(diǎn)的兩側(cè)序列多數(shù)是已知的，序列多數(shù)是已知的，可以可以設(shè)計(jì)合成相應(yīng)

18、的設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的PCRPCR引物，引物，以待鑒定的轉(zhuǎn)化子或重組以待鑒定的轉(zhuǎn)化子或重組子的子的DNADNA為模板進(jìn)行為模板進(jìn)行PCRPCR反反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，膠電泳，若出現(xiàn)特異性擴(kuò)若出現(xiàn)特異性擴(kuò)增增DNADNA帶，并且其分子量帶，并且其分子量同預(yù)期的一致，同預(yù)期的一致，則可確定則可確定含此重組含此重組DNADNA分子的重組分子的重組子是期待的重組子。子是期待的重組子。PCR篩選法篩選法主混合池主混合池行混合池行混合池列混合池列混合池分別分別PCR擴(kuò)增擴(kuò)增引物：引物：1）同源引物，即）同源引物，即 鄰近種屬的相應(yīng)基因鄰近種屬的相應(yīng)基因2）根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引

19、物）根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物2.42.4核酸分子雜交檢測(cè)法核酸分子雜交檢測(cè)法 基本原理是基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸：具有一定同源性的兩條核酸(DNA(DNA或或RNA)RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特異地復(fù)性形成雙可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈。鏈。 該技術(shù)也可用于重組子的篩選鑒定，雜交的雙該技術(shù)也可用于重組子的篩選鑒定，雜交的雙方是待測(cè)的核酸序列和用于檢測(cè)的已知核酸片方是待測(cè)的核酸序列和用于檢測(cè)的已知核酸片段段( (稱(chēng)為稱(chēng)為探針探針) )。 核酸雜交核酸雜交：兩種不同來(lái)源單鏈：兩種不同來(lái)源單鏈D

20、NA或或RNA相互配對(duì)的過(guò)程相互配對(duì)的過(guò)程分子雜交分子雜交：生物大分子之間通過(guò)相互作用結(jié)合在一起：核酸：生物大分子之間通過(guò)相互作用結(jié)合在一起：核酸之間通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)；蛋白質(zhì)之間通過(guò)抗原、抗體反應(yīng)；之間通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)；蛋白質(zhì)之間通過(guò)抗原、抗體反應(yīng)；核酸、蛋白質(zhì)之間通過(guò)疏水作用，氫鍵進(jìn)行相互作用。核酸、蛋白質(zhì)之間通過(guò)疏水作用，氫鍵進(jìn)行相互作用。 是將待測(cè)核酸變性后，用一定的方法將其固是將待測(cè)核酸變性后，用一定的方法將其固定在硝酸纖維膜定在硝酸纖維膜( (或尼龍膜或尼龍膜) )上，這個(gè)過(guò)程也稱(chēng)為上，這個(gè)過(guò)程也稱(chēng)為核酸印跡轉(zhuǎn)移核酸印跡轉(zhuǎn)移，然后用經(jīng)標(biāo)記示蹤的特異核酸探，然后用經(jīng)標(biāo)記示蹤的特異核酸探

21、針與之雜交結(jié)合，洗去其他的非特異結(jié)合核酸分針與之雜交結(jié)合，洗去其他的非特異結(jié)合核酸分子后，示蹤標(biāo)記將指示待測(cè)核酸中能與探針互補(bǔ)子后，示蹤標(biāo)記將指示待測(cè)核酸中能與探針互補(bǔ)的特異的特異DNADNA片段所在的位置。片段所在的位置。 根據(jù)待測(cè)核酸的來(lái)源以及將其分子結(jié)合到固根據(jù)待測(cè)核酸的來(lái)源以及將其分子結(jié)合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子雜交檢測(cè)法相支持物上的方法的不同，核酸分子雜交檢測(cè)法可分為可分為 菌落印跡原位雜交菌落印跡原位雜交、 斑點(diǎn)印跡雜交斑點(diǎn)印跡雜交、 southern southern印跡雜交印跡雜交 Nothern Nothern印跡雜交印跡雜交 基本做法基本做法:核酸原位雜交的基本

22、步驟核酸原位雜交的基本步驟1.1.細(xì)胞或組織的固定細(xì)胞或組織的固定（如（如載玻片）載玻片）2.2.組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理 - -用去垢劑或蛋白酶除去用去垢劑或蛋白酶除去 核酸表面蛋白質(zhì)核酸表面蛋白質(zhì)3.DNA3.DNA探針的選擇和標(biāo)記（探針的選擇和標(biāo)記（ 32P ）4.4.雜交雜交5.5.雜交結(jié)果檢測(cè)（雜交結(jié)果檢測(cè)（放射自顯影法）1.熒光染色體原位雜交熒光染色體原位雜交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是將基本原理是將DNA探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體上，來(lái)

23、檢測(cè)的探針直接原位雜交到染色體上，來(lái)檢測(cè)DNA序列在染序列在染色體上的定位。色體上的定位。 2.多色熒光染色體原位雜交多色熒光染色體原位雜交(multicolor FISH; mFISH )3.比較基因組原位雜交比較基因組原位雜交(Comparative Genomic Hybridization；CGH )由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)由原位雜交發(fā)展起的一些新技術(shù)斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交： 將待測(cè)將待測(cè)DNA或或RNA或細(xì)胞裂解物變性后直接點(diǎn)在硝或細(xì)胞裂解物變性后直接點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，不需限制性酶進(jìn)行酶切，即可與探針?biāo)崂w維素膜上，不需限制性酶進(jìn)行酶切，即可與探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。進(jìn)行雜交反應(yīng)。 該技術(shù)對(duì)

24、于基因拷貝數(shù)多的樣品很適合，具有間接快該技術(shù)對(duì)于基因拷貝數(shù)多的樣品很適合，具有間接快速的特點(diǎn)，一般可作大批量樣品的篩選。速的特點(diǎn)，一般可作大批量樣品的篩選。 Dot blotting（斑點(diǎn)雜交）（斑點(diǎn)雜交）Southern blotting(DNA印跡印跡)Southern雜交紀(jì)念發(fā)明者Edward Southern（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析DNA樣品限制酶樣品限制酶 酶解酶解電泳電泳鑒定克隆-Southern分子雜交 探針可以探針可以是是DNADNA，也可，也可以是以是RNARNA； 可以

25、用可以用放放射性同位素射性同位素標(biāo)記，也可標(biāo)記，也可以用以用生物素生物素或熒光素或熒光素標(biāo)標(biāo)記。記。 裂解細(xì)胞，使裂解細(xì)胞，使DNA釋放，用釋放，用Tris液液溶解，交替使用酚、氯仿兩種蛋白溶解，交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，有效去除蛋白質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)變性劑，有效去除蛋白質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)程序：酚程序：酚酚酚-氯仿氯仿氯仿）氯仿）硝酸纖維素硝酸纖維素(NC)膜、膜、尼龍膜尼龍膜 毛細(xì)管虹吸印跡法、電毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)印法電轉(zhuǎn)印法真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管虹吸印跡法毛細(xì)管虹吸印跡法 在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)

26、用最廣的一種固相支持物，但它也存在一些不足之處：種固相支持物，但它也存在一些不足之處：第一、硝酸纖維素濾膜是依賴(lài)疏水性相互作用結(jié)合第一、硝酸纖維素濾膜是依賴(lài)疏水性相互作用結(jié)合DNADNA的，這的，這種結(jié)合并不十分牢固。種結(jié)合并不十分牢固。第二、硝酸纖維素濾膜質(zhì)地校脆弱，容易碎裂，因此操作須小第二、硝酸纖維素濾膜質(zhì)地校脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎心謹(jǐn)慎( (待別是經(jīng)烘烤后待別是經(jīng)烘烤后) )。第三、硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴(lài)于高鹽濃度，在低鹽第三、硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴(lài)于高鹽濃度，在低鹽濃度時(shí)結(jié)合濃度時(shí)結(jié)合DNADNA效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。

27、第四、硝酸纖維素濾膜對(duì)于小分子質(zhì)量的第四、硝酸纖維素濾膜對(duì)于小分子質(zhì)量的DNADNA片段片段( (特別是小于特別是小于200bp200bp的的DNADNA片段片段) )結(jié)合能力不強(qiáng)。結(jié)合能力不強(qiáng)。硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜 現(xiàn)在人們更傾向于使用現(xiàn)在人們更傾向于使用尼龍膜尼龍膜。 尼龍膜結(jié)合尼龍膜結(jié)合DNADNA和和RNARNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對(duì)小分的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對(duì)小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合，經(jīng)烘烤或紫外線(xiàn)照射后，子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合，經(jīng)烘烤或紫外線(xiàn)照射后，這種結(jié)合更加牢固。同時(shí)尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)這種結(jié)合更加牢固。同時(shí)尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)離子濃

28、度要求不高，可重復(fù)用于雜文。但其雜交信號(hào)本底離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜文。但其雜交信號(hào)本底較硝酸纖維素濾膜高，這可通過(guò)增加預(yù)雜交液中的非待異較硝酸纖維素濾膜高，這可通過(guò)增加預(yù)雜交液中的非待異性封閉試劑用量的方法加以克服。性封閉試劑用量的方法加以克服。尼龍膜尼龍膜放射自顯影照片放射自顯影照片GGATCCATCCCCTGCTC AGGAGGCAAGAGGCATGGGGACGAGTCCTCCGTTCTP32Target geneDNAdenaturationSingle colonyLysedHybridizationProbe is labeled with radioactive 32PJu

29、ang RH (2004) BCbasics如果核苷酸序列測(cè)定結(jié)果如果核苷酸序列測(cè)定結(jié)果與預(yù)期與預(yù)期DNA 片段的核苷片段的核苷酸序列一致，表明待鑒定酸序列一致，表明待鑒定的重組子是真正含有預(yù)期的重組子是真正含有預(yù)期DNA 片段的重組子。片段的重組子。2.5根據(jù)根據(jù)DNA 核苷酸序列鑒定核苷酸序列鑒定3 根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定根據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定采用雜交法鑒定采用雜交法鑒定主要采用的是主要采用的是Northern雜交法，類(lèi)似于雜交法，類(lèi)似于Southern 雜交，不同的是用雜交，不同的是用DNA 探針探針檢測(cè)檢測(cè)RNA 分子。分子。RNA操作?。坎僮鳎?？Northern吸印雜交吸印雜交具

30、體做法是具體做法是： 提取重組體總提取重組體總RNARNA或或mRNAmRNA，在強(qiáng)變性劑如甲基汞或甲醛，在強(qiáng)變性劑如甲基汞或甲醛存在的情況下存在的情況下( (防止防止RNARNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)環(huán)) )，進(jìn)行瓊脂糖，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后，將電泳分離開(kāi)的凝膠電泳，電泳后，將電泳分離開(kāi)的RNARNA原位吸印到經(jīng)原位吸印到經(jīng)化學(xué)處理過(guò)的紙或硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的探化學(xué)處理過(guò)的紙或硝酸纖維素膜上，用同位素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，然后放射自顯影，根據(jù)針進(jìn)行雜交，然后放射自顯影，根據(jù)X X光片上的條帶，光片上的條帶，可以了解與探針互補(bǔ)的可以了解與探針互補(bǔ)的RNARNA的大小及數(shù)量。的

31、大小及數(shù)量。由于由于RNARNA比比DNADNA更易受到各種因素的降解，整個(gè)操作過(guò)程必更易受到各種因素的降解，整個(gè)操作過(guò)程必須十分小心，按規(guī)程操作。須十分小心，按規(guī)程操作。對(duì)轉(zhuǎn)基因生物對(duì)轉(zhuǎn)基因生物NorthernNorthern雜交顯示陽(yáng)性，說(shuō)明外源基因已經(jīng)雜交顯示陽(yáng)性，說(shuō)明外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入受體基因組中，并且順利地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成轉(zhuǎn)入受體基因組中，并且順利地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，形成mRNAmRNA。 基本原理與基本原理與Southern大致相同，只是檢測(cè)的對(duì)象大致相同，只是檢測(cè)的對(duì)象不是不是DNA，而是，而是RNA。Northern 印跡雜交印跡雜交(Northern bloting)檢測(cè)檢測(cè)RNA（主要

32、是（主要是mRNA）的方法）的方法 與與Southern雜交的不同雜交的不同 靶核酸：靶核酸：RNA，不需用限制酶消化，不需用限制酶消化 RNA電泳電泳 轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后不需變性轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后不需變性(一般不能采用堿變一般不能采用堿變性處理性處理) 應(yīng)用：檢測(cè)外源基因在宿主中能否轉(zhuǎn)錄RNARNA提取注意事項(xiàng)提取注意事項(xiàng)：1.1.樣品細(xì)胞的有效破碎樣品細(xì)胞的有效破碎 2.2.使核蛋白復(fù)合體變性使核蛋白復(fù)合體變性 3.3.對(duì)內(nèi)源對(duì)內(nèi)源RNARNA酶的有效抑制酶的有效抑制4.4.有效地將有效地將RNARNA從從DNADNA和蛋白混合物中分離和蛋白混合物中分離4 根據(jù)目的基因翻譯產(chǎn)物鑒定根據(jù)目的基因

33、翻譯產(chǎn)物鑒定4.1蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定20.1 kD14.3 kD97.2 kD18 kD4.2免疫檢測(cè)法鑒定免疫檢測(cè)法鑒定酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)必須制備特異必須制備特異性抗原的酶標(biāo)性抗原的酶標(biāo)一抗或針對(duì)一一抗或針對(duì)一抗的酶標(biāo)二抗抗的酶標(biāo)二抗 主要用于檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)情況，主要用于檢測(cè)外源基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)情況，即是否進(jìn)行了翻譯，產(chǎn)生了外源基因所編碼的蛋白即是否進(jìn)行了翻譯，產(chǎn)生了外源基因所編碼的蛋白質(zhì)質(zhì)主要步驟：主要步驟： 蛋白質(zhì)樣品的制備蛋白質(zhì)樣品的制備 SDS-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：蛋白質(zhì)

34、的電轉(zhuǎn)移： 靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)（靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)（抗體與抗原結(jié)合反應(yīng)抗體與抗原結(jié)合反應(yīng)） 靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng)靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng) 與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng) 顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)Western吸印雜交吸印雜交：如何從所克隆到基因重組體中鑒定目的基因如何從所克隆到基因重組體中鑒定目的基因的存在和正確性？的存在和正確性？根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)行篩選根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)行篩選 只有當(dāng)已知需克隆基因所編碼蛋白質(zhì)的功能只有當(dāng)已知需克隆基因所編碼蛋白質(zhì)的功能, , 且且該蛋白質(zhì)又為細(xì)菌的生命活動(dòng)所必需時(shí)該蛋白質(zhì)又為細(xì)菌的生命活

35、動(dòng)所必需時(shí), , 即可用該即可用該方法篩選。方法篩選。 如：已知蛋白質(zhì)中的亮氨酸（如：已知蛋白質(zhì)中的亮氨酸（LeuLeu）為）為L(zhǎng)euLeu營(yíng)養(yǎng)缺陷營(yíng)養(yǎng)缺陷菌所必需菌所必需, , 當(dāng)外源目的基因可表達(dá)亮氨酸當(dāng)外源目的基因可表達(dá)亮氨酸, , 將該基將該基因的重組子轉(zhuǎn)入因的重組子轉(zhuǎn)入LeuLeu缺陷菌中缺陷菌中, , 在不含亮氨酸的基本在不含亮氨酸的基本培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)基平板中, , 只有重組子表達(dá)的亮氨酸才能被只有重組子表達(dá)的亮氨酸才能被LeuLeu缺陷菌所利用而能生長(zhǎng)繁殖缺陷菌所利用而能生長(zhǎng)繁殖, ,形成菌落。因而能生長(zhǎng)形成菌落。因而能生長(zhǎng)的細(xì)菌集落，均為陽(yáng)性的重組子克隆，而無(wú)該重組的細(xì)菌集落

36、，均為陽(yáng)性的重組子克隆，而無(wú)該重組子的子的LeuLeu缺陷菌在不含亮氨酸的平板上則不能生長(zhǎng)，缺陷菌在不含亮氨酸的平板上則不能生長(zhǎng)，不能形成菌落。不能形成菌落。根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選(1). 重組子大小鑒別篩選重組子大小鑒別篩選 重組子中因裝有一段較大分子量的外源基因重組子中因裝有一段較大分子量的外源基因D DNA, NA, 因此其分子量明顯比原載體大得多因此其分子量明顯比原載體大得多, , 因此可因此可從平板上挑取菌落分別提取重組載體（如質(zhì)粒重從平板上挑取菌落分別提取重組載體（如質(zhì)粒重組子）和原載體（質(zhì)粒），組子）和原載體（質(zhì)粒），無(wú)需用限制性?xún)?nèi)切酶無(wú)需用限制性?xún)?nèi)切酶

37、消化，直接進(jìn)行凝膠電泳，攜帶外源性目的基因消化，直接進(jìn)行凝膠電泳，攜帶外源性目的基因的重組子質(zhì)粒因分子量大，電泳遷移率較小，的重組子質(zhì)粒因分子量大，電泳遷移率較小，其其電泳條帶在后，而原載體質(zhì)粒因分子量較小，電電泳條帶在后，而原載體質(zhì)粒因分子量較小，電泳遷移率較大，其電泳條帶在前。通過(guò)比較可初泳遷移率較大，其電泳條帶在前。通過(guò)比較可初步判斷重組子中是否插入外源基因片段步判斷重組子中是否插入外源基因片段。本方法本方法適用于插入片段較大的重組子的初步篩選。適用于插入片段較大的重組子的初步篩選。(2). 酶切鑒定酶切鑒定 對(duì)于篩選出的具有重組子的菌株，應(yīng)經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別對(duì)于篩選出的具有重組子的菌

38、株，應(yīng)經(jīng)小量培養(yǎng)后，再分別提取原載體或重組體載體（重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體提取原載體或重組體載體（重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNADNA），根），根據(jù)已知重組時(shí)外源基因兩端的酶切位點(diǎn)，分別用相應(yīng)的兩種內(nèi)據(jù)已知重組時(shí)外源基因兩端的酶切位點(diǎn)，分別用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，原載體因無(wú)外源性目的基因，切酶進(jìn)行酶解，經(jīng)瓊脂糖電泳后，原載體因無(wú)外源性目的基因，切開(kāi)后變成線(xiàn)性，電泳呈一條帶，若載體上有外源性目的基因切開(kāi)后變成線(xiàn)性，電泳呈一條帶，若載體上有外源性目的基因插入，切開(kāi)后電泳出現(xiàn)兩條帶：一條為載體質(zhì)粒線(xiàn)性條帶，一插入，切開(kāi)后電泳出現(xiàn)兩條帶：一條為載體質(zhì)粒線(xiàn)性條帶，一條為釋放出的插入基因片斷的

39、小分子條帶，這樣就可以看出載條為釋放出的插入基因片斷的小分子條帶，這樣就可以看出載體中是否有插入的目的基因片斷，以及由體中是否有插入的目的基因片斷，以及由DNA markerDNA marker條帶對(duì)比條帶對(duì)比分析可得知插入基因片段的大小分析可得知插入基因片段的大小(3). 目的基因序列測(cè)定目的基因序列測(cè)定1.化學(xué)降解法也叫化學(xué)降解法也叫Maxam-Gilbert法。法。 2. 酶促法酶促法 又叫又叫Sanger法和鏈終止法。法和鏈終止法。3.自動(dòng)化測(cè)序法自動(dòng)化測(cè)序法 小小 結(jié)結(jié)重組重組DNADNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的

40、基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 Cre-LoxP重組酶系統(tǒng) P36(自學(xué)) Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用，是條件性基因打靶、誘導(dǎo)性基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心。 Cre重組酶和LoxP序列 ： 于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于Int酶超基因家族。 Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X03453），編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。Cre重組酶Lo

41、xP（locus of X-over P1）序列：）序列： 來(lái)源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過(guò)程中與 DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下：5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 33 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 CreCre重組酶介導(dǎo)兩個(gè)重組酶介導(dǎo)兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)間的重位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程，可組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可

42、逆的過(guò)程，可以以分成三種情況分成三種情況：1 1、如果兩個(gè)、如果兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)位于一條位點(diǎn)位于一條DNDNA A鏈上，且方向相同，鏈上，且方向相同，CreCre重組酶能重組酶能有效切除兩個(gè)有效切除兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)間的序列；位點(diǎn)間的序列；2 2、如果兩個(gè)、如果兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)位于一條位點(diǎn)位于一條DNDNA A鏈上，但方向相反，鏈上，但方向相反，CreCre重組酶能重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)導(dǎo)致兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)間的序列倒位；位點(diǎn)間的序列倒位；3 3、如果兩個(gè)、如果兩個(gè)LoxPLoxP位點(diǎn)分別位于兩位點(diǎn)分別位于兩條不同的條不同的DNADNA鏈或染色體上，鏈或染色體上，CreC

43、re酶酶能介導(dǎo)兩條能介導(dǎo)兩條DNADNA鏈的交換或染色體易鏈的交換或染色體易位。位。 另外，另外，Cre不僅可以識(shí)別不僅可以識(shí)別LoxP的的2個(gè)個(gè)13bp的反向重的反向重復(fù)序列和復(fù)序列和8bp的間隔區(qū)的間隔區(qū)域，而且當(dāng)一個(gè)域，而且當(dāng)一個(gè)13bp的的反向重復(fù)序列或者反向重復(fù)序列或者8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變時(shí)仍的間隔區(qū)發(fā)生改變時(shí)仍能識(shí)別并發(fā)生重組。利能識(shí)別并發(fā)生重組。利用這一特點(diǎn)，人們?cè)跇?gòu)用這一特點(diǎn)，人們?cè)跇?gòu)建載體時(shí)可以根據(jù)需要建載體時(shí)可以根據(jù)需要改造改造LoxP位點(diǎn)序列，以位點(diǎn)序列，以用于特定的基因突變或用于特定的基因突變或修復(fù)，增加了該系統(tǒng)的修復(fù)，增加了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。應(yīng)用范圍。 Cre-Lo

44、xP系統(tǒng)的特性 Cre-LoxPCre-LoxP重組酶系統(tǒng)在基因打靶中的應(yīng)用策略重組酶系統(tǒng)在基因打靶中的應(yīng)用策略 基于Cre-LoxP的基因打靶要分兩步來(lái)進(jìn)行。首先要在胚胎干細(xì)胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過(guò)打靶載體的設(shè)計(jì)和對(duì)同源重組子的篩選來(lái)實(shí)現(xiàn)。下一步通過(guò)Cre介導(dǎo)的重組來(lái)實(shí)現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。 Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細(xì)胞水平上用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，通過(guò)識(shí)別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在個(gè)體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠?；蛘邔re基因置于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)

45、Cre重組酶而將LoxP位點(diǎn)之間的基因切除（誘導(dǎo)性基因敲除），實(shí)現(xiàn)特定基因在特定時(shí)間或者組織中的失活。 五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控五、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控 基因工程的最終目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)Щ蚬こ痰淖罱K目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋入合適的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。白質(zhì)產(chǎn)品。 克隆基因表達(dá)有三個(gè)條件克隆基因表達(dá)有三個(gè)條件 基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷; ; 基因轉(zhuǎn)錄要有啟動(dòng)子，而啟動(dòng)子必須能被宿主基因轉(zhuǎn)錄要有啟動(dòng)子，而啟動(dòng)子必須能被宿主 細(xì)胞的細(xì)胞的RNARNA聚合酶有效地

46、識(shí)別聚合酶有效地識(shí)別; ; mRNA mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外 源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。 科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。 然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。 目的基

47、因表達(dá)，是否有合適的啟動(dòng)子，用外來(lái)基因目的基因表達(dá)，是否有合適的啟動(dòng)子，用外來(lái)基因的啟動(dòng)子；啟動(dòng)子與受體細(xì)胞的的啟動(dòng)子；啟動(dòng)子與受體細(xì)胞的RNA聚合酶是否協(xié)聚合酶是否協(xié)調(diào)；外源調(diào)；外源DNA插入方向與轉(zhuǎn)錄方向是否一致插入方向與轉(zhuǎn)錄方向是否一致 目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因、目的基因b、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)大腸桿菌作為基因工程受體菌的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？?jī)?yōu)點(diǎn)：大腸桿菌培養(yǎng)方便、

48、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等方面的背景知識(shí)清楚，對(duì)其基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理也比較了解，而且歷經(jīng)二十年的基因工程實(shí)踐，大腸桿菌已發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，有多種適用的寄主菌株和載體系列，大腸桿菌易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。缺點(diǎn)：在通常情況下，細(xì)菌的RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)翻譯后的加工修飾，如正確的折疊和組裝，而細(xì)菌中通常并沒(méi)有這樣的修飾機(jī)制，從而可能導(dǎo)致真核基因在大腸桿菌中的翻譯產(chǎn)物無(wú)法產(chǎn)生有活性的蛋白；外源真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子往往能夠被細(xì)菌的蛋白酶識(shí)別，并被當(dāng)做“異已分子”降解掉?；虮磉_(dá)的四大表達(dá)系統(tǒng)分別為 大腸桿菌、酵母

49、菌、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 、昆蟲(chóng)細(xì)胞 。1. 原核表達(dá)體系原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子 翻譯調(diào)控序列翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)多接頭克隆位點(diǎn)E.coli表達(dá)體系的不足表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白很難表達(dá)大量可溶性蛋白優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋

50、白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)：操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程方法：方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射顯微注射 2. 真核表達(dá)體系真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲(chóng)、乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞酵母、昆蟲(chóng)、乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞 重組重組 DNA DNA 分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，還有很大差別。因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，還有很大差別。表達(dá)表達(dá)通常是指目的基因編碼的蛋白質(zhì)合成。通常是指目的基因編碼的

51、蛋白質(zhì)合成?；蚬こ痰幕蚬こ痰淖詈笠徊?，是把所獲得的蛋白質(zhì)最后一步，是把所獲得的蛋白質(zhì)分離純化分離純化，得到蛋，得到蛋白質(zhì)產(chǎn)品。白質(zhì)產(chǎn)品。分離基因用于基因診斷、分離基因用于基因診斷、基因治療或基因結(jié)構(gòu)與基因治療或基因結(jié)構(gòu)與功能研究功能研究基因工程的產(chǎn)品如乙肝疫基因工程的產(chǎn)品如乙肝疫苗、胰島素、生長(zhǎng)激素、苗、胰島素、生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、干擾素等干擾素等基因工程菌基因工程菌基因工程反應(yīng)器基因工程反應(yīng)器一、反義基因技術(shù)的基本概念和原理一、反義基因技術(shù)的基本概念和原理 反義反義RNA(antisenseRNA)RNA(antisenseRNA)： 反義反義RNA

52、RNA是指與是指與mRNAmRNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的RNARNA分子分子, , 也包括與也包括與其它其它RNARNA互補(bǔ)的互補(bǔ)的RNARNA分子分子. .由于核糖體不能翻譯雙鏈由于核糖體不能翻譯雙鏈的的RNARNA，所以反義，所以反義RNARNA與與mRNAmRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合特異性的互補(bǔ)結(jié)合, , 即抑制了該即抑制了該mRNAmRNA的翻譯。的翻譯。 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNARNA的基因稱(chēng)之為反義基因。的基因稱(chēng)之為反義基因。 通過(guò)反義通過(guò)反義RNARNA控制控制mRNAmRNA的翻譯是原核生物的翻譯是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，最早是在基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，最早是在E.coli E

53、.coli 的產(chǎn)腸桿菌素的的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的, ,許多實(shí)許多實(shí)驗(yàn)證明在真核生物中也存在反義驗(yàn)證明在真核生物中也存在反義RNARNA。反義基因技術(shù) 反義反義RNARNA的來(lái)源的來(lái)源 細(xì)胞中反義細(xì)胞中反義RNA的來(lái)源有兩種途徑的來(lái)源有兩種途徑 第一是反向第一是反向轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在多數(shù)情況下轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在多數(shù)情況下, 反義反義RNA是特定靶基因是特定靶基因互補(bǔ)鏈反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)鏈反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 即產(chǎn)生即產(chǎn)生mRNA和反義和反義RNA的的DNA是同一區(qū)段的互補(bǔ)鏈。第二種來(lái)源是不同基因產(chǎn)是同一區(qū)段的互補(bǔ)鏈。第二種來(lái)源是不同基因產(chǎn)物，如物，如OMPF基因是大腸桿菌

54、的膜蛋白基因，與透性基因是大腸桿菌的膜蛋白基因，與透性有關(guān)，其反義基因有關(guān)，其反義基因MICFZE則為另一基因則為另一基因 反義子反義子：編碼反義：編碼反義RNA的的DNA稱(chēng)為反義子。稱(chēng)為反義子。反義子在反義子在DNA的的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。起調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。 復(fù)制水平的調(diào)節(jié)復(fù)制水平的調(diào)節(jié)直接抑制直接抑制反義反義RNA與引物與引物RNA前體互補(bǔ)，使得引物前體互補(bǔ)，使得引物RNA無(wú)法與無(wú)法與DNA模板結(jié)合，進(jìn)而抑制模板結(jié)合，進(jìn)而抑制DNA復(fù)制的頻率。復(fù)制的頻率。間接抑制間

55、接抑制反義反義RNA通過(guò)阻斷復(fù)制激活蛋白因子的合成通過(guò)阻斷復(fù)制激活蛋白因子的合成而間接抑制而間接抑制DNA的復(fù)制。的復(fù)制。 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)反義反義RNA通過(guò)與通過(guò)與mRNA的的5 端互補(bǔ)結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的延伸；端互補(bǔ)結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的延伸；作用于作用于mRNA的的poly(A)區(qū)域，抑制區(qū)域，抑制mRNA的成熟及其運(yùn)輸；的成熟及其運(yùn)輸；與真核生物與真核生物mRNA結(jié)合而影響其剪切加工。結(jié)合而影響其剪切加工。 翻譯水平的調(diào)節(jié)翻譯水平的調(diào)節(jié)通過(guò)與通過(guò)與mRNA的的5 端端SD序列結(jié)合，改變其空間構(gòu)象，從而序列結(jié)合，改變其空間構(gòu)象，從而影響核糖體在影響核糖體在mRNA上的定位；上的定位；通

56、過(guò)與通過(guò)與mRNA的的5端編碼區(qū)（如起始密碼）結(jié)合，直接抑端編碼區(qū)（如起始密碼）結(jié)合，直接抑制翻譯的起始。制翻譯的起始。SD序列（序列（SD sequence）：系：系Shine-Dalgarno序列的簡(jiǎn)稱(chēng)，序列的簡(jiǎn)稱(chēng)，此為紀(jì)念最早發(fā)現(xiàn)該序列的研究者而命名的。它此為紀(jì)念最早發(fā)現(xiàn)該序列的研究者而命名的。它是原核生物是原核生物中核糖體的結(jié)合位點(diǎn)中核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，亦即存在于，亦即存在于mRNA分子分子AUG起始密碼起始密碼子之前的多聚嘌呤序列子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可與的部分或全部，可與16S rRNA的的3 -末端序列互補(bǔ)。末端序列互補(bǔ)。SD序列在核糖體同序列在核糖體同m

57、RNA的結(jié)合的結(jié)合過(guò)程中起重要作用。過(guò)程中起重要作用。 指把一段指把一段DNADNA序列以反義方向插入到合適的啟序列以反義方向插入到合適的啟動(dòng)子和終止子之間，然后把此基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到動(dòng)子和終止子之間，然后把此基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中去受體細(xì)胞中去( (通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法通常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法) )，通過(guò)，通過(guò)選擇培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化生物體的技術(shù)。選擇培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化生物體的技術(shù)。反義反義RNA技術(shù)：技術(shù)： 就是應(yīng)用反義技術(shù)(antisense technology)特異封閉某些基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制某些有害基因的表達(dá)。 基因失活基因失活(gene inactivation)(gene inactiv

58、ation)反義基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法：反義基因的表達(dá)載體構(gòu)建方法：第一步，分離得到的第一步，分離得到的mRNAmRNA為模板，合成反義為模板，合成反義DNADNA；第二步，以此反義鏈為模板合成有義第二步，以此反義鏈為模板合成有義DNADNA鏈；鏈；第三步，以細(xì)菌質(zhì)粒第三步，以細(xì)菌質(zhì)粒(DNA)(DNA)為載體，用限制性?xún)?nèi)切酶為載體，用限制性?xún)?nèi)切酶在靠近啟動(dòng)子處切割一缺口；在靠近啟動(dòng)子處切割一缺口；第四步，將有義第四步，將有義DNADNA插入表達(dá)載體的缺口中，即得到插入表達(dá)載體的缺口中，即得到一表達(dá)質(zhì)粒，如果啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)載體即轉(zhuǎn)錄一表達(dá)質(zhì)粒，如果啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)載體即轉(zhuǎn)錄原來(lái)的原來(lái)

59、的mRNAmRNA；如果將插入的表達(dá)載體用限制性?xún)?nèi)切酶；如果將插入的表達(dá)載體用限制性?xún)?nèi)切酶切割后，以相反的方向插入載體切割后，以相反的方向插入載體DNADNA環(huán)中，即表達(dá)載環(huán)中，即表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄形成反義體轉(zhuǎn)錄形成反義RNARNA。 二、二、 反義基因技術(shù)的特點(diǎn)反義基因技術(shù)的特點(diǎn) 1 1、反義、反義RNARNA可以高度專(zhuān)一地調(diào)節(jié)某一特定基因可以高度專(zhuān)一地調(diào)節(jié)某一特定基因的表達(dá)，不影響其他基因的表達(dá)。的表達(dá)，不影響其他基因的表達(dá)。 2 2、轉(zhuǎn)化到植物中的反義、轉(zhuǎn)化到植物中的反義RNARNA的作用類(lèi)似于遺傳的作用類(lèi)似于遺傳上的缺陷型，表現(xiàn)為顯性。所以被轉(zhuǎn)化的植物上的缺陷型，表現(xiàn)為顯性。所以被轉(zhuǎn)化的植物

60、材料不必為純合體就可表現(xiàn)相應(yīng)的性狀，從而材料不必為純合體就可表現(xiàn)相應(yīng)的性狀，從而避免了二倍體內(nèi)等位基因的顯隱性干擾。避免了二倍體內(nèi)等位基因的顯隱性干擾。 3 3、反義基因整合到植物的基因組中可獨(dú)立表、反義基因整合到植物的基因組中可獨(dú)立表達(dá)和穩(wěn)定遺傳，后代符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。達(dá)和穩(wěn)定遺傳，后代符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。 4 4、反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋、反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可省去對(duì)基因產(chǎn)物的研究工作。白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可省去對(duì)基因產(chǎn)物的研究工作。 5 5、反義基因不改變目的基因的結(jié)構(gòu)，在應(yīng)用、反義基因不改變目的基因的結(jié)構(gòu)，在應(yīng)用上更加安全。上更加安全。 三、三、 反義基因