1、編號(hào)：時(shí)間：2021年x月x日書(shū)山有路勤為徑，學(xué)海無(wú)涯苦作舟頁(yè)碼：第11頁(yè) 共11頁(yè)實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的制備與滅菌技術(shù)一、試驗(yàn)原理馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂類及多種維生素經(jīng)煮沸后可把這些營(yíng)養(yǎng)成分從中溶出以供酵母和霉菌生長(zhǎng)需要，加入葡萄糖或蔗糖以補(bǔ)充微生物所需的碳源。此培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握培養(yǎng)基的制備方法，2、學(xué)會(huì)高壓蒸汽滅菌技術(shù)。三、實(shí)驗(yàn)材料和儀器：1、馬鈴薯、葡萄糖（或蔗糖）、瓊脂。2、燒杯、漏斗、試管、三角瓶、量筒、玻璃棒、紗布、棉花、細(xì)繩、牛皮紙、試管架、培養(yǎng)皿。3、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、天平、電爐。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟：（1）選無(wú)芽、無(wú)腐爛的馬鈴薯、洗凈、削皮、稱4

2、0g切碎加水200ml,放入1000ml燒杯中煮沸0.5hr、冷卻用紗布過(guò)濾去渣。（2）在清液中加入4g葡萄糖溶解補(bǔ)水至200ml，此時(shí)到入一試管10ml。余下溶液加3.8g瓊脂加熱熔化。（3）試管分裝：取玻璃漏斗裝在漏斗架上，漏斗下連一橡膠管，與玻璃管嘴相接，橡皮管上夾一彈簧夾，培養(yǎng)基倒入漏斗，通過(guò)彈簧夾控制培養(yǎng)基的流量。（4）余下的培養(yǎng)基分裝在兩個(gè)250ml的三角瓶中。（5）高壓蒸汽滅菌：把溶解完的培養(yǎng)基用棉塞塞上并用牛皮紙把棉花包住，在121，0.1Mpa下滅菌20min即可，滅菌時(shí)要注意放凈閥氣。取出滅菌物品時(shí)一定要等到壓力降到零時(shí)打開(kāi)滅菌鍋蓋。（6）斜面擺放：將分裝滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基

3、試管置于水平放置的試管上，凝固后即成斜面。（7）培養(yǎng)皿培養(yǎng)基的傾倒：先用酒精棉球擦拭桌面及雙手,在靠近酒精燈火焰的上方把冷卻到45左右的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每只倒入15ml左右。注意：溫度太低培養(yǎng)基會(huì)凝固。五、思考題：1培養(yǎng)基配制好后為什么要滅菌？2蒸汽滅菌應(yīng)注意幾個(gè)問(wèn)題？為什么？實(shí)驗(yàn)二 微生物接種和無(wú)菌操作技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解無(wú)菌操作在微生物接種過(guò)程中的重要性，掌握無(wú)菌操作的基本環(huán)節(jié)。2、掌握幾種常用微生物的接種方法，為微生物的形態(tài)觀察作準(zhǔn)備。二、實(shí)驗(yàn)材料1、菌種 （1）細(xì)菌 大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,(2)酵母 釀

4、酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,(3)霉菌 黑曲霉（Aspergillus niger）2、培養(yǎng)基（1）肉湯培養(yǎng)基 固體斜面培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基。（2）PDA培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基。3、接種工具 接種針，接種鉤，接種環(huán)。4、酒精燈，標(biāo)簽紙，火柴，鑷子，75%酒精棉球，試管架，電爐，鋁鍋，無(wú)菌平皿。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1、斜面接種 用接種環(huán)在肉湯斜面培養(yǎng)基上劃密波蜿蜒曲線接種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，在PDA培養(yǎng)基斜面上用劃直線和點(diǎn)接的方法分別接種酵母菌和霉菌。2、液體接種：用接種環(huán)在肉湯培養(yǎng)基液體中接種細(xì)菌，在PDA液體培養(yǎng)基

5、中接種酵母菌。液體接種時(shí)取一環(huán)菌苔，沿管壁輕輕擦下菌苔，塞上棉塞輕搖試管。3、穿刺接種：在肉湯培養(yǎng)基上接種細(xì)菌，在PDA培養(yǎng)基上接種酵母菌。4、平板接種：分別在不同的培養(yǎng)基平板上點(diǎn)接不同的菌種。四、結(jié)果記錄1、斜面接種（1）檢查斜面接種情況、繪制斜面生長(zhǎng)草圖。（2）分析斜面接種好壞的原因（3）保留斜面、以便觀察形態(tài)時(shí)使用。2、液體接種觀察記錄細(xì)菌、酵母的液體培養(yǎng)特征，保留酵母液體培養(yǎng)液備用。3、穿刺接種（1）檢查穿刺接種效果，繪制草圖。（2）敘述不同微生物穿刺培養(yǎng)后的現(xiàn)象及原因。（3）分析穿刺接種好壞的原因。4、平板接種（1）檢查平板接種的生長(zhǎng)狀況，有無(wú)污染（凡沒(méi)接種地方長(zhǎng)出菌落均為染菌）。（

6、2）描述各個(gè)菌落的特征。實(shí)驗(yàn)三 顯微鏡的使用、微生物觀察和菌體大小測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)原理 應(yīng)月顯微鏡的成像原理，同時(shí)借助顯微鏡的鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺，兩尺配合使用，進(jìn)行測(cè)量和運(yùn)算，得出細(xì)胞的大小。 鏡臺(tái)測(cè)微尺系一特制的載玻片（圖13），它的中央是一具有刻度的標(biāo)尺，全長(zhǎng)為1mm，共劃分為10大格，每一大格又分成10小格，每一小格長(zhǎng)0.01mm，即10um。也有全長(zhǎng)為2mm，共分200小格，每小格的長(zhǎng)度不變。在標(biāo)尺的外圍有一小黒環(huán)，以便找到標(biāo)尺的位置。 圖13鏡臺(tái)測(cè)微尺 目鏡測(cè)微尺是放在目鏡內(nèi)的一種標(biāo)尺，它有固定式和移動(dòng)式兩種類趔。固定式目鏡測(cè)微尺為一塊圓形玻璃片，直徑為2021mm，如圖14所示。在

7、它的上面刻有各種形式的標(biāo)尺，有為直線式的（圖1一4A），有為網(wǎng)式的（圖14B）通常用以測(cè)量長(zhǎng)度的標(biāo)尺為直線式的，一般為5mm，分成5大格，每一大格分成10小格，共計(jì)50小格。也有用同樣長(zhǎng)度分為100小格的。網(wǎng)式目鏡測(cè)微尺主要用以計(jì)算數(shù)目和測(cè)量物體的面積。在它上面刻有方格的網(wǎng)狀標(biāo)尺。方格的大小和數(shù)目各有不同，有25、36和49格，也有的一個(gè)正方形大格中劃分100個(gè)方格，在中央的一個(gè)方格中再劃分25個(gè)小方格。ABCD 圖14目鏡測(cè)微尺 A.直線式 B.網(wǎng)式 C.移動(dòng)式（外形） D.移動(dòng)式（內(nèi)部） 移動(dòng)式目鏡測(cè)微尺基本上和直線式目鏡測(cè)微尺相似，所不同的是除了泣種固定的標(biāo)尺外，還有可以移動(dòng)位置的指示線

8、。它裝在一個(gè)特別的目鏡中右邊由一個(gè)能旋轉(zhuǎn)的小輪控制著，輪上有刻度，分成100格，該輪每旋轉(zhuǎn)一圈，目鏡內(nèi)能移動(dòng)的指示線就從標(biāo)尺一端向另一端移動(dòng)格。 顯微測(cè)量時(shí)，先用鏡臺(tái)測(cè)微尺標(biāo)定目鏡測(cè)微尺每小格代表的長(zhǎng)度，然后才能用目鏡微尺來(lái)測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)度。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)會(huì)測(cè)微尺的使用和計(jì)算方法。2、掌握酵母菌細(xì)胞體積的測(cè)定方法三、實(shí)驗(yàn)材料和儀器：1菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）上次實(shí)驗(yàn)的液體培養(yǎng)物2蓋玻片、載玻片、顯微鏡、鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺、酒精燈、生理鹽水、吸水紙。3擦鏡紙、濾紙條、鑷子、無(wú)菌吸管、酒精棉球。 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 測(cè)微尺的使用操作 1、卸下目鏡的

9、上透鏡將目鏡測(cè)微尺有刻度一面向下裝在回鏡鏡面上，再旋上目鏡上的透鏡。 2、將鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度的一面朝上放在載物臺(tái)上夾好，使測(cè)微尺刻度位于視野中央。調(diào)焦至能看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度。 3、小心移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺（如目鏡測(cè)微尺刻度模糊，可轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡上透鏡進(jìn)行調(diào)焦），使兩尺左邊的“0”點(diǎn)直線重合，然后由左向右找出兩尺另一次重復(fù)的直線（圖15）。 4、記錄兩條重合線間目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)。按下式計(jì)算目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度等于多少u(mài)m 目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度（um）鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)目鏡測(cè)微尺的格數(shù)X100123450.00.10.20.30.40.60.50.70.80.91.0圖l5 目鏡測(cè)微尺

10、的標(biāo)定上，目鏡測(cè)微尺；下，鏡臺(tái)測(cè)微尺例如，圖15中，在低倍鏡下所標(biāo)定的目鏡測(cè)微尺的全長(zhǎng)（50格），等于鏡臺(tái)測(cè)微尺70格，則目鏡測(cè)微尺每小格代表的長(zhǎng)度則為：目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度（um）7050X1014 取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上要測(cè)量的玻片標(biāo)本，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)度的格數(shù)，乘以每格的um數(shù)，即為細(xì)胞的實(shí)際長(zhǎng)度。 如用不同倍數(shù)的物鏡與目鏡時(shí)，就需重新計(jì)算，方法同前。 在測(cè)量時(shí)應(yīng)注意將被測(cè)量的標(biāo)本移到視野中心，因?yàn)樵谶@個(gè)位置上鏡像最清晰像差也最小，為減少誤差在測(cè)量同一物體時(shí)，要重復(fù)3次以上，再取其平均值還需注意視野中的亮度應(yīng)均勻一致，以免影響測(cè)量值的準(zhǔn)確性。 根據(jù)長(zhǎng)度測(cè)量結(jié)果可計(jì)算細(xì)胞的體積。公式如

11、下： 橢圓形V4ab2/3（a,b為長(zhǎng)短軸的半徑） 圓球形V4r3/3（r為半徑）5、酵母菌大小的測(cè)定 （1）取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上酵母菌水浸片。 （2）測(cè)量菌體的長(zhǎng)軸和軸各占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，然后換算出菌體的實(shí)際長(zhǎng)度。 （3）在同一標(biāo)本上測(cè)量510個(gè)酵母細(xì)胞，取其平均植。6、酵母菌體積的測(cè)定 用顯微測(cè)微尺測(cè)量并換算出酵母菌的長(zhǎng)軸和短軸的實(shí)際長(zhǎng)度后，代入公式求出酵母菌的體積V。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、在低倍鏡下：目鏡測(cè)微尺（ ）格鏡臺(tái)測(cè)微尺（）格，目鏡測(cè)微尺每小格（ ）um;2、在高倍鏡下：目鏡測(cè)微尺（ ）格鏡臺(tái)測(cè)微尺（）格，目鏡測(cè)微尺每小格（ ）um。3、酵母細(xì)胞長(zhǎng)=目鏡側(cè)微尺（ ）格=（ ）微米。

12、酵母細(xì)胞寬=目鏡側(cè)微尺（ ）格=（ ）微米。酵母菌細(xì)胞體積=（ ）um3。六、思考題1、為什么采用不同放大倍數(shù)目鏡和物鏡時(shí)，必須重新用鏡臺(tái)測(cè)微尺對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行標(biāo)定？2、若目鏡不變，目鏡測(cè)微尺也不變，只改變物鏡，那么，目鏡測(cè)微尺每格所測(cè)量的酵母的實(shí)際長(zhǎng)度（或?qū)挾龋┦欠裣嗤?？為什么?實(shí)驗(yàn)四 酵母菌細(xì)胞計(jì)數(shù)法及酵母出芽率的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和使用方法。2、學(xué)習(xí)并掌握利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測(cè)量和酵母出芽率的測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)材料和儀器： 1、菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）上次實(shí)驗(yàn)的液體培養(yǎng)物2、蓋玻片、載玻片、顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、酒

13、精燈、濾紙條、無(wú)菌吸管、酒精棉球、擦鏡紙等。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟： 1. 血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造:測(cè)定微生物生長(zhǎng)量的方法很多，對(duì)酵母來(lái)說(shuō)有兩大類：總菌計(jì)數(shù)和活菌計(jì)數(shù)，分別稱為直接和間接法?？偩?jì)數(shù)是利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，立即得到數(shù)值，是死細(xì)胞和活細(xì)胞的總和；活菌計(jì)數(shù)是計(jì)算活菌在平皿上形成的菌落數(shù)，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母直接計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)的同時(shí)統(tǒng)計(jì)出出芽率。血球計(jì)數(shù)板由四條平行槽而構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)，中間平臺(tái)較寬，并分為兩部分，每部分均刻有長(zhǎng)和寬各1mm的方格網(wǎng)，中間平臺(tái)下陷0.1mm，故蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的體積為0.1mm3。常用血球計(jì)數(shù)板有兩種規(guī)格。一種16x25型，稱為麥?zhǔn)涎蛴?jì)數(shù)

14、板，共有16個(gè)大格，每個(gè)大格又分為25個(gè)小格；另一種是25x16型，稱為希里格式血球計(jì)數(shù)板，共25個(gè)大格，每一大格又分為16個(gè)小格。無(wú)論 是哪一種血球計(jì)數(shù)板，都有一共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)室的小格數(shù)相同，均為400個(gè)。其結(jié)構(gòu)見(jiàn)下圖。0.01mm1/400mm2 XB-K-25計(jì)數(shù)板蓋玻片中央平臺(tái)2.酵母菌細(xì)胞計(jì)數(shù)：(1).檢查血球計(jì)數(shù)板是否有雜質(zhì)和菌體，若有用脫脂棉蘸取95%酒精輕輕擦洗計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，用蒸餾水沖洗計(jì)數(shù)板，用濾紙吸干其上水分，勿用火烤，最后用擦鏡紙揩干凈。(2).樣品稀釋：稀釋的目的在于便于計(jì)數(shù)，稀釋要求每小格內(nèi)45個(gè)細(xì)胞，一般稀釋10倍。（3）加樣：先將蓋玻片置于計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取

15、一滴稀釋好的菌液滴于蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，多余的菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待酵母細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部在進(jìn)行計(jì)數(shù)。(4).計(jì)數(shù) 將加好樣品的計(jì)數(shù)板放到顯微鏡載物臺(tái)中央，按下列步驟尋找計(jì)數(shù)室并計(jì)數(shù)。 找計(jì)數(shù)室 先用低倍物鏡尋找到大方格網(wǎng)位置。尋找時(shí)，顯微鏡的光圈要適當(dāng)縮小，使視野偏暗，然后順著大方格移動(dòng)計(jì)數(shù)板，使計(jì)數(shù)室位于視野中間。 轉(zhuǎn)換高倍鏡 轉(zhuǎn)至高倍物鏡后，適當(dāng)調(diào)節(jié)光亮度，使菌體和計(jì)數(shù)室線條清晰，然后將計(jì)數(shù)室一角的小格移至視野中。 計(jì)數(shù) 16x25型 取左上、右上、左下、右下四大格共100小格內(nèi)的細(xì)胞逐一進(jìn)行計(jì)數(shù)； 25x16型 取左上、右上、左下、右下和中間五大格共80小格進(jìn)行計(jì)數(shù)

16、，計(jì)數(shù)時(shí)遇到位于大格線上的酵母菌時(shí)，只計(jì)大格上方及右方線上的細(xì)胞（或只計(jì)下方及左方線上的細(xì)胞），將細(xì)胞數(shù)填入格中 對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值，計(jì)算酵母菌細(xì)胞數(shù)。（5）計(jì)算公式：25x16: 細(xì)胞數(shù)/ml=(80小格細(xì)胞總數(shù)÷80)x400x10x1000x稀釋倍數(shù)16x25: 細(xì)胞數(shù)/ml=（100小格細(xì)胞總數(shù)÷100）x400x10x1000x稀釋倍數(shù) (6) 清洗 計(jì)數(shù)板使用完畢后，用蒸餾水沖洗，絕不能用硬物洗刷，洗后待其自行晾干或用濾紙吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若為病原菌，則浸泡在5%石炭酸溶液中消毒后再清洗。3.酵母出芽率的測(cè)定：（1） 同上步驟數(shù)出酵母的出芽數(shù)并

17、填在上面表格中（一般需平行計(jì)數(shù)三次）。（2）觀察酵母菌出芽率時(shí)，遇到芽體大于細(xì)胞本身50%時(shí)不作為芽體計(jì)數(shù)，而作為酵母數(shù)計(jì)數(shù)。（3）計(jì)算公式：酵母出芽率=（芽體數(shù)÷酵母菌細(xì)胞總數(shù)）x100%四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞總數(shù)測(cè)定表格：計(jì)數(shù)次數(shù)各大格中的細(xì)胞數(shù)大格中細(xì)胞總數(shù)稀釋倍 數(shù)細(xì)胞濃度（個(gè)/ml）芽體數(shù)左上 右上 右下 左下 中間第一次第二次第三次平均值三次測(cè)定結(jié)果：每毫升菌液中酵母細(xì)胞數(shù)平均值_。酵母細(xì)胞出芽率的測(cè)定計(jì)算次數(shù)總酵母細(xì)胞數(shù)芽體數(shù)出芽率（%）第一次第二次第三次 三次測(cè)定結(jié)果平均值：出芽率_%五、思考題：1、試述計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理。為什么用兩種不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板來(lái)計(jì)數(shù)同一樣品，結(jié)果是

18、一樣的？2、試分析酵母計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題和影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的原因。應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？實(shí)驗(yàn)五 微生物的分離技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)原理 枯草芽孢桿菌的多數(shù)種都能產(chǎn)生大量的淀粉酶、蛋白酶，因此比較容易分離得到。目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的細(xì)菌淀粉酶、蛋白酶就是利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的，所以它是重要的工業(yè)用菌之一。 由于芽孢具有較強(qiáng)的抗高熱能力，分離純化時(shí)可以采用熱處理的方法。七原理是，通過(guò)高溫加熱處理，殺死其中所有不生成芽孢的菌類，在培養(yǎng)過(guò)程中，使芽孢得到很好得富集。利用該菌產(chǎn)酶的特性，選擇分別以淀粉、酪蛋白為主要碳源的分離培養(yǎng)基。因酶的水解作用會(huì)使菌落周?chē)霈F(xiàn)清晰的透明圈。根據(jù)透明圈的直徑（C） 與菌落直徑（H

19、）之比可初步鑒定酶活力，即C/H比值越大，酶活力越高，進(jìn)而篩選出優(yōu)良的生產(chǎn)用菌。 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握枯草芽孢桿菌的分離純化技術(shù)三、實(shí)驗(yàn)材料 1.樣品 含有機(jī)質(zhì)較豐富的土壤。 2.培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，淀粉培養(yǎng)基，酪素培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(150ml)：牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，pH7.27.4，121滅菌20min淀粉培養(yǎng)基(60ml)：牛肉膏0.5，蛋白胨0.5，NaCl0.5，可溶性淀粉2，瓊脂1.82。pH7.2，121滅菌30min酪素培養(yǎng)基(60ml)：磷酸二氫鉀0.036,七水硫酸鎂0.05，氯化鋅0.0014，七水磷酸氫二鈉0.107，NaCl0.

20、016，氯化鈣0.0002，硫酸亞鐵0.0002，酪素0.4，瓊脂2。pH值6.57.0，121滅菌20min。 3.試劑 0.02mol/l碘液，無(wú)菌水。 4.儀器 平面皿，吸管，三角瓶，無(wú)菌信封，無(wú)菌紗布，玻璃珠，搖床，涂布器。四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1.采樣 到園田用無(wú)菌小鏟采集離地面515cm深處的土壤若干，裝入無(wú)菌信封中，記錄時(shí)間、地點(diǎn)、植被和環(huán)境情況。 2. 分離 取土樣1g于250ml無(wú)菌三角瓶中，內(nèi)加99ml無(wú)菌水及數(shù)粒無(wú)菌玻璃珠，置搖床上振蕩510分鐘，用無(wú)菌紗布過(guò)濾收集濾液。 3. 富集培養(yǎng) 取5ml濾液接于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中（250ml三角瓶中裝有150ml培養(yǎng)液），置入8

21、090水浴中，加熱1015分鐘，記錄處理時(shí)間。然后30振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，鏡檢。4. 傾注分離 將培養(yǎng)液再經(jīng)一次熱處理后，以10倍稀釋法適當(dāng)稀釋，取最后三個(gè)稀釋度的稀釋液各1ml于無(wú)菌平皿中，每稀釋度平行兩個(gè)皿。5. 融化淀粉瓊脂培養(yǎng)基與酪素瓊脂培養(yǎng)基，冷卻至50傾入上述各皿，輕輕搖勻，凝固后30培養(yǎng)2448小時(shí)。6.挑菌落 蛋白酶菌株 可直接觀察在酪素平板上菌落周?chē)纬傻耐该魅?，挑C/H比值大的接入斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)備用。 淀粉酶菌株 可取0.02mol/l碘液滴加在淀粉平板中的菌落周?chē)?，觀察形成透明圈的結(jié)果。挑C/H比值大的接入斜面培基，培養(yǎng)備用。7.純種鑒定 染色后，在顯微鏡下觀察，利用細(xì)

22、胞形態(tài)及菌落形態(tài)進(jìn)行鑒別。8.純化 將選定的菌株，采用平板分離純化法。五、思考題 1、仔細(xì)分析以上菌種篩選和純化步聚試述菌種分離成功的關(guān)鍵因素。 2、采用以上方法是否能夠分離篩選出青霉素抗性菌。實(shí)驗(yàn)六 微生物染色（或發(fā)酵實(shí)驗(yàn)）微生物細(xì)胞含水量大，對(duì)光線的吸收和反射與水溶液對(duì)光線的吸收和反射差別較小，與背景沒(méi)有明顯的明暗差別，因此，對(duì)微生物的觀察除觀察活體微生物的運(yùn)動(dòng)性和直接計(jì)算菌體數(shù)外，絕大多數(shù)情況下都必須經(jīng)過(guò)染色，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀察。但在染色和制片過(guò)程中，微生物的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均發(fā)生一定程度的改變，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實(shí)情況。在實(shí)際操作中要根據(jù)觀察目的不同，選用不同的染色和制片方法。

23、一、染色的基本原理微生物染色的基本原理，是借助于物理因素（細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)對(duì)染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等）和化學(xué)因素（細(xì)胞物質(zhì)和染料性質(zhì)不同而發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)）對(duì)微生物作用來(lái)進(jìn)行的。如呈酸性的細(xì)胞核物質(zhì)易于被堿性染料染色。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性染料，必須改變它們的化學(xué)形式，才有利于吸附作用的發(fā)生。相反堿性染料也如此。細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pH25之間，在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷；堿性染料電離時(shí)帶正電荷，因此，在細(xì)菌染色時(shí)常用堿性染料進(jìn)行染色。影響染色的因素：菌體細(xì)胞的構(gòu)造、外膜的通透性、培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等。二、染料及種

24、類（一）染料的性質(zhì)染料大多是一種含有苯環(huán)的機(jī)化合物，能使其它物質(zhì)牢固地著色。大都有苯環(huán)、發(fā)色基團(tuán)（色基、呈色團(tuán)）和助色基團(tuán)（或作用基團(tuán)）組成。若苯環(huán)上只連接發(fā)色基團(tuán)，它雖然能呈色，但不能作為染料，因?yàn)樗荒茈婋x，與細(xì)胞的親和力差，與細(xì)胞的結(jié)合不牢固，用水一沖便可除去。有了助色基團(tuán)，就具有了能夠電離的性質(zhì)，能夠和適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)結(jié)合為鹽類。帶有正或負(fù)電荷的染料離子就能與細(xì)胞牢固地結(jié)合，使其呈色，所以苯環(huán)必須連接呈色和助色兩個(gè)基團(tuán)后才能作為染料使用。顏色是發(fā)色基團(tuán)所致，染色性則由助色基團(tuán)決定。（二）染料的種類根據(jù)染料電離后染料離子帶電荷的性質(zhì)，分為酸性、堿性、中性（復(fù)合）和單純?nèi)玖纤拇箢悺?、酸性染料：

25、電離后染料粒子帶負(fù)電，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等。2、堿性染料：電離后染料粒子帶正電，它們與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、番紅、孔雀綠和甲基紫等。2、中性（復(fù)合）染料：酸性染料與堿性染料的結(jié)合叫中性（復(fù)合）染料。如瑞脫氏染料和基姆薩氏染料等。三、制片與染色（一）制片在干凈的載玻片上滴一滴蒸餾水或無(wú)菌水，用接種工具進(jìn)行無(wú)菌操作，取少許培養(yǎng)物，置于水滴中做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層。也可在玻片的另一端加一滴水對(duì)第一次的懸液進(jìn)行稀釋使菌體分布均勻減少重疊，否則會(huì)使染料大面積堆積，不利于觀察。（二）干燥涂片最好是使其自然干燥，也可手持載玻片

26、菌體面向上在酒精燈的火焰高處微微加熱，以防標(biāo)本烤枯而使菌體變形。（三）固定采用高溫固定，即手持載玻片快速?gòu)脑诰凭珶艋鹧嫱鈱觼?lái)回通過(guò)3-4次，約2-3秒鐘，不斷用以載玻片接觸皮膚，溫度不超過(guò)60，待冷卻后，進(jìn)行染色。如果觀察的微生物不適宜采用此法應(yīng)采用化學(xué)方法固定。（四）染色采用合適的染色劑把固定后的標(biāo)本全部浸在染色液中進(jìn)行染色1-3分鐘之間。（五）水洗用細(xì)小的水流洗掉多余的染料，獲得清晰的視野以利于觀察。（六）干燥將洗干凈的標(biāo)本晾干或用吸水紙吸取多余的水，烘干后備用。一、實(shí)驗(yàn)原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥醫(yī)生Gram創(chuàng)立的一種重要的細(xì)菌鑒別方法。其機(jī)理是利用G+和G-菌細(xì)胞壁的組成成分和結(jié)構(gòu)的的不同。G-的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)和較少的肽聚糖。當(dāng)用乙醇或丙酮脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了壁的通透性是染料的復(fù)合物易于滲出，細(xì)胞脫色，復(fù)染后呈現(xiàn)出復(fù)染的染料顏色。G+的肽聚糖含量高，類脂質(zhì)少，乙醇或丙酮洗脫時(shí)，肽聚糖層的孔徑變小，通透