1、禽禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)書(shū)編者：陳建紅 司興奎 張濟(jì)培佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系禽病學(xué)課程組二0一0年9月修訂說(shuō)明禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)書(shū)以佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院原禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)為基礎(chǔ)，以佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱（2007版）及禽病學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)大綱（2007版）為依據(jù)作刪減修訂。目前，本實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)書(shū)的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)部分包括“家禽的尸體剖檢及病料采取”、“家禽具有血凝性病毒病的免疫監(jiān)測(cè)”、“雞白痢與小鵝瘟的血清學(xué)診斷”、“鴨疫里默氏桿菌病的實(shí)驗(yàn)診斷”4個(gè)內(nèi)容（共8學(xué)時(shí)）；教學(xué)實(shí)習(xí)指導(dǎo)包括“雞新城疫的實(shí)驗(yàn)診斷”1個(gè)內(nèi)容（18學(xué)時(shí)）。本實(shí)驗(yàn)、實(shí)習(xí)體現(xiàn)了病禽剖檢、病料采取、血清學(xué)試驗(yàn)、病毒分離鑒定和病原菌分離

2、鑒定等禽病診斷的基本技術(shù)，學(xué)生能認(rèn)真操作并結(jié)合禽病學(xué)相關(guān)技術(shù)書(shū)籍進(jìn)行學(xué)習(xí)，將有益于其在禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面打下必要的基礎(chǔ)。本指導(dǎo)書(shū)適合于獸醫(yī)專(zhuān)業(yè)本科(或?qū)？?禽病學(xué)課程實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)，亦適合于獸醫(yī)工作人員臨床操作時(shí)參考。目 錄第一部分禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一 家禽的尸體剖檢及病料采取實(shí)驗(yàn)二家禽具有血凝性病毒病的免疫監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)三雞白痢與小鵝瘟的血清學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)四 鴨疫里默氏桿菌病的實(shí)驗(yàn)診斷第二部分 禽病學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)指導(dǎo)雞新城疫的實(shí)驗(yàn)診斷第一部分實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一 家禽的尸體剖檢及病料采取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占仪菔w剖檢、病料采取及病原分離的具體方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1病禽的剖檢；2病料的采取與病原菌的分離。三、實(shí)驗(yàn)儀器、

3、設(shè)備及材料1剖檢病禽的用材：解剖剪、解剖盤(pán)、消毒液、洗手盆、毛巾、待檢禽等。2病料采取及病原(細(xì)菌、病毒或其他微生物)分離的用材：消毒的小剪刀、小鑷子、滅菌玻璃容器、研缽、酒精棉、酒精燈、接種棒、培養(yǎng)基及上述剖檢用材。四、實(shí)驗(yàn)原理 1家禽機(jī)體在健康的情況下，各種組織器官具有正常的形態(tài)，發(fā)病后某些組織器官會(huì)發(fā)生特征性的變化，通過(guò)病禽剖檢可以為臨床診斷疾病提供依據(jù)。2家禽健康的狀況下體內(nèi)不攜帶病原或毒物，發(fā)病后，通過(guò)特定的組織器官作病原分離鑒定或?qū)χ卸静∏葑鞫疚餀z測(cè)，可以為實(shí)驗(yàn)診斷禽病提供可靠的依據(jù)。 五、實(shí)驗(yàn)步驟1病禽的剖檢進(jìn)行剖檢之前，應(yīng)首先了解發(fā)病禽群的流行病學(xué)，臨床癥狀情況，家禽的品種，飼

4、養(yǎng)情況，疫苗的接種情況，發(fā)病后的經(jīng)過(guò)和處理方法等等。剖檢時(shí)，應(yīng)注意詳細(xì)記錄各器官的病理變化，如同時(shí)剖檢多只病死禽，則應(yīng)注意編號(hào)，以免混淆。剖檢基本術(shù)式如下：（1）外貌檢查檢查天然孔：注意口、鼻、眼(包括眼下方的羽毛是否干燥，若濕潤(rùn)則表明有流淚的可能)有無(wú)異常的分泌物，分泌物的量及性狀；注意泄殖腔周?chē)鹈袩o(wú)異常糞便粘污，泄殖腔粘膜的變化及內(nèi)容物的性狀等。檢查皮膚：注意頭、冠、肉髯及身體其他部位的皮膚有無(wú)痘疹或結(jié)痂等；是否發(fā)生腐??；檢查家禽的趾爪，注意有無(wú)贅生物、外傷、化膿、失水及脛骨有無(wú)變軟等。檢查各關(guān)節(jié)及龍骨：注意各關(guān)節(jié)有無(wú)腫脹、變形及長(zhǎng)骨、龍骨有無(wú)變形、彎曲等表現(xiàn)。檢查病禽的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)：觸摸

5、感覺(jué)病禽胸肌厚薄及龍骨的顯突情況而初步判定家禽的營(yíng)養(yǎng)情況。（2）體腔檢查 第一步，用消毒水將禽體羽毛浸濕，防止病原擴(kuò)散及避免羽毛飛揚(yáng)。 第二步，用剪刀將股內(nèi)側(cè)連接腹側(cè)的皮膚剪開(kāi)，將兩大腿向外和下方翻壓，直至髖關(guān)節(jié)脫臼，使禽體以背臥位平放于瓷盆上。 第三步，橫向剪開(kāi)腹部皮膚，使切口與上述股側(cè)皮膚切口相連，握住游離皮膚，向前一直剝離到鎖骨部，檢查皮下組織和胸肌的狀態(tài)。橫向剪開(kāi)腹肌、腹膜，并沿胸骨的兩側(cè)，向前將各肋骨、鎖骨剪斷，抓住龍骨的后端，用力向前向上翻拉(此時(shí)應(yīng)注意觀(guān)察體腔內(nèi)各氣囊壁有無(wú)混濁、增厚等)，暴露整個(gè)體腔的器官。注意體腔有無(wú)積液，粘附滲出物及其他異常變化。將腺胃、肌胃、心、肝、脾、肺

6、、腸、腎、卵巢、睪丸、法氏囊等各內(nèi)臟器官先后從體腔摘出作細(xì)致檢查，先觀(guān)察外表形態(tài)、大小、色澤、質(zhì)度等變化，再分別切開(kāi)檢查內(nèi)部變化，注意有無(wú)炎性腫脹、充血、郁血、出血、潰瘍、壞死或結(jié)節(jié)等。（3）頸部檢查將下頜骨、食道、嗉囊剪開(kāi)，注意觀(guān)察口腔和食道粘膜有無(wú)出血、潰瘍、假膜或膿包等；同時(shí)，剝離頸部皮膚檢查胸腺(尤其是雛禽)有無(wú)出血、萎縮等變化；將小剪刀插入喉頭，剪開(kāi)氣管和支氣管，檢查喉頭和氣管粘膜有無(wú)滲出、充血、出血或潰瘍等。（4）頭部檢查 第一步，眼部檢查。主要觀(guān)察眼的角膜有無(wú)異常變化及眼結(jié)膜有無(wú)出血或潰瘍等。 第二步，鼻竇部檢查。沿額面經(jīng)鼻孔剪開(kāi)約l3厘米切口，將切口用手分開(kāi)即可見(jiàn)鼻竇，觀(guān)察其有

7、無(wú)出血或滲出物的特性。 第三步，腦部檢查。用剪刀將頭部皮膚剪開(kāi)、以尖剪將整個(gè)額骨、顱頂骨剪除，暴露大腦和小腦，先觀(guān)察腦膜血管的狀態(tài)，腦膜下有無(wú)水腫和積液，然后再以鈍器輕輕撥離，將前端嗅腦、腦下垂體及視神經(jīng)交叉等部逐一剪斷，將整個(gè)大腦和小腦摘出，觀(guān)察腦實(shí)質(zhì)的變化；（5）神經(jīng)檢查主要檢查的神經(jīng)為坐骨神經(jīng)干。將股內(nèi)側(cè)的肌肉鈍性分開(kāi)即可見(jiàn)乳白色有橫紋的坐骨神經(jīng)干，觀(guān)察神經(jīng)干外膜有無(wú)水腫或出血及神經(jīng)干的粗細(xì)是否均勻等。（6）剖檢時(shí)的注意事項(xiàng) 剖檢的場(chǎng)地應(yīng)盡量遠(yuǎn)離行人、水源、禽舍，并選擇易于消毒的地方，避免由于剖檢造成病原擴(kuò)散。 剖檢前后運(yùn)載病、死禽只，應(yīng)采用密封容器，避免沿途遺漏病禽羽毛、分泌物及排泄物

8、等。剖檢完畢，應(yīng)將尸體深埋或焚化，或作其他無(wú)害化處理。對(duì)剖檢場(chǎng)地及器械要隨手洗刷消毒。2病料采取與病原菌(毒)分離家禽傳染病的確診，通常必須過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷，采取病料與病原分離是實(shí)驗(yàn)診斷的前提。（1）采料時(shí)間 病毒性病料、中毒性材料(如肉毒梭菌素中毒)的采取一般應(yīng)在急性感染期，選擇典型的瀕死病禽，病前不久用過(guò)疫苗或經(jīng)抗病毒藥物處理的禽只不宜采料。（2）采取病料的方法：器械消毒：刀、剪：鑷子等采料用具可干熱滅菌或煮沸30分鐘滅菌，注射器等器皿應(yīng)干熱滅菌或高壓滅菌。采料部位：病料采取的部位應(yīng)根據(jù)不同疾病相應(yīng)地采取其臟器或內(nèi)容物，一般應(yīng)采取病原含量高而污染機(jī)會(huì)少的實(shí)質(zhì)性器官，如肝、腦、脾為好。在無(wú)法估計(jì)

9、是何種傳染病時(shí)，可進(jìn)行全面采取。各種病料的具體采集方法A病毒性病料的采取與病毒分離：用滅菌剪刀及鑷子剪取含毒量高的組織(通常為肝臟、腦、脾臟、胰臟等實(shí)質(zhì)臟器)23克，投入滅菌瓶中，加蓋，有條件的地方可即時(shí)將病料用滅菌乳缽研磨，并應(yīng)用超聲波或反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，以利于細(xì)胞內(nèi)病毒的釋放，加入510倍的滅菌生理鹽水或PBS配成懸液，30008000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1520分鐘，去除沉淀，在每毫升上清液中加入青霉素、鏈霉素(或其他有效抗生素)各20004000IU，置48ºC冰箱中感作24小時(shí)。經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，接種相應(yīng)的生物學(xué)培養(yǎng)基(禽胚或細(xì)胞培養(yǎng)物等)作病毒分離培養(yǎng)，觀(guān)察感染禽胚死亡及病變

10、情況，收集胚液做進(jìn)一步鑒定。如果病料采取后不能立即處理時(shí)，應(yīng)直接放入低溫冰箱或相應(yīng)保存劑(如Hank's液或50的甘油PBS)中，并置于冰箱保存。B細(xì)菌性病料中病原菌分離：對(duì)于各種細(xì)菌性疾病，應(yīng)在病禽剖解前備好相應(yīng)的培養(yǎng)基。對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低的病原菌，如大腸桿菌，可用普通瓊脂；對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的病原菌，如多殺性巴氏桿菌，可用血液瓊脂等；有特殊要求的病原菌，要使用特殊的培養(yǎng)基和方法進(jìn)行培養(yǎng)，如鴨疫里氏桿菌、雞副嗜血桿菌等要用巧克力瓊脂在含510CO2的空氣條件下培養(yǎng)；懷疑有雜菌污染的病料，應(yīng)盡量使用需分離細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基；病原含菌量少時(shí)應(yīng)采用液體培養(yǎng)基，或用相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后，再進(jìn)行分

11、離培養(yǎng)；未能確定病原菌的種類(lèi)時(shí)，應(yīng)同時(shí)使用多種培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，以提高病原菌的分離成功率。分離病原菌時(shí)，用接種棒直接從病禽體內(nèi)相應(yīng)臟器釣取病料在固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)或液體培養(yǎng)基上接種；如不能即時(shí)分離培養(yǎng)，則應(yīng)以無(wú)菌手續(xù)采取病料一小塊投入無(wú)菌的保存劑中，置48ºC保存，并應(yīng)盡早進(jìn)行分離培養(yǎng)。病原菌的分離應(yīng)在急性發(fā)病期和未使用過(guò)敏感藥物的前提下進(jìn)行。C血清學(xué)材料：一般都應(yīng)采取雙相血清，即在發(fā)病初期及后期(病愈期)各采取一份，進(jìn)行檢驗(yàn)，以檢查有關(guān)抗體的變化情況。具體方法為：采少量血清時(shí)，可用注射器沿向心端的方向從翅靜脈直接采取血液；如需大量血清，則可從心臟采血。血液先放在經(jīng)干熱滅菌的小瓶或其

12、他容器中自然凝固，待其自然析出血清，再將血清移至滅菌容器中凍結(jié)保存?zhèn)溆谩Ｑ迦粲腥苎獎(jiǎng)t會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。D組織學(xué)材料的采?。汗┎±斫M織切片的材料，應(yīng)將病禽典型病變部分及其相連的健康組織一并切取，隨即投入10%甲醛中固定備用。E腸道內(nèi)容物材料的采?。河妹蘧€(xiàn)將決定采取內(nèi)容的腸道兩端扎緊，然后剪下置于滅菌容器中，必要時(shí)可放入20ºC保存，并迅速送檢。不論上述哪一種材料，都不應(yīng)該在死后過(guò)長(zhǎng)時(shí)間(一般不超過(guò)死后46小時(shí))采取，否則會(huì)對(duì)正確的診斷造成一定的影響。所有病料采取后均要貼上標(biāo)簽。若要送檢時(shí)，還要用醫(yī)用膠布或石蠟封口，置于冰瓶中及時(shí)送出。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1扼要地反映病禽剖檢與病料采

13、取的基本程序。2說(shuō)明操作的注意事項(xiàng)。 3陳述實(shí)驗(yàn)體會(huì)。七、實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)(參閱實(shí)驗(yàn)步驟)八、思考題家禽尸體剖檢、病料采取及病原分離的方法與注意事項(xiàng)如何?實(shí) 驗(yàn) 二 家禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握血凝性病毒病免疫監(jiān)測(cè)的基本方法。2.學(xué)會(huì)根據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測(cè)的結(jié)果指導(dǎo)雞群血凝性病毒病免疫接種。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1.紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)抗原的HA效價(jià)及4個(gè)血凝單位抗原的配制。2.紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)檢測(cè)免疫禽只的HI抗體。3.根據(jù)血凝性病毒病免疫監(jiān)測(cè)的結(jié)果指導(dǎo)雞群相應(yīng)病毒病的免疫接種。三、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及材料1.抗原原液：購(gòu)自標(biāo)準(zhǔn)廠(chǎng)家，根據(jù)監(jiān)測(cè)抗體的種類(lèi)而確定抗原的種類(lèi)。ND免疫監(jiān)測(cè)N

14、D抗原；AI H5免疫監(jiān)測(cè)H5抗原；AI H9免疫監(jiān)測(cè)H9抗原；EDS76免疫監(jiān)測(cè)EDS抗原。2.被檢血清：隨機(jī)采取被檢禽群的血液（抽樣比例約為12，或每個(gè)禽群抽取2040只），取血液自然凝固后析出的血清作為被檢血清。3.滅菌PBS生理鹽水，PH7.0，按常規(guī)配制。4.紅細(xì)胞懸浮液：采取健康公禽（被檢測(cè)血清為雞血清時(shí)，應(yīng)采用公雞，被檢血清為鴨、鵝血清時(shí)，應(yīng)采用公鴨）血液（每次可采510mL），抗凝，加滅菌PBS生理鹽水離心洗滌35次（每次離心的速度和時(shí)間為3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘，將血漿、白細(xì)胞等充分洗去，將沉淀的紅細(xì)胞用滅菌PBS生理鹽水稀釋成1懸浮液。該紅細(xì)胞懸浮液在4存放，可用35天。

15、注意懸浮液顏色變暗應(yīng)予棄去。5.其他材料：25uL移液器，96孔V型反應(yīng)板，普通離心機(jī)等。（以下內(nèi)容主要以ND的免疫監(jiān)測(cè)為例，同學(xué)們可依此類(lèi)推探討其他血凝性病毒病免疫監(jiān)測(cè)的相關(guān)技術(shù)）四、實(shí)驗(yàn)原理雞群ND免疫后，體內(nèi)可產(chǎn)生抗ND中和抗體及紅細(xì)胞凝集抑制抗體（HI抗體）。后者在體外可抑制NDV凝集紅細(xì)胞的能力。在一系列試管中，將被檢雞血清作連續(xù)稀釋?zhuān)逯蠬I抗體越高，則能使ND病毒凝集紅細(xì)胞能力完全抑制的血清稀釋度就越高。由于HI抗體與中和抗體的消長(zhǎng)是基本一致的，故通過(guò)HI抗體水平的檢測(cè)可以達(dá)到ND免疫監(jiān)測(cè)的目的。五、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（微量法檢測(cè)ND抗原原液HA效價(jià)及配制4個(gè)血凝單

16、位ND抗原）1.分裝生理鹽水：用移液器在96孔V型反應(yīng)板的一排孔上的112孔，每孔加入PBS生理鹽水25uL，換滴頭；2.添加抗原：吸取標(biāo)準(zhǔn)ND抗原原液25uL加入第1孔，換滴頭；3.稀釋抗原：用25uL移液器將第1孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第2孔；用移液器將第2孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第3孔，如此，直至第11孔，從11孔吸取25uL溶液棄去，換滴頭；4.加入PBS生理鹽水：向1-12孔加入PBS生理鹽水，每孔25uL；5.加入紅細(xì)胞懸浮液：向1-12孔加入紅細(xì)胞懸浮液，每孔25uL；6.靜置感作20-30分鐘，然后判定

17、結(jié)果；7.判定結(jié)果（觀(guān)察、判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)概念與方法）“凝集”的概念：觀(guān)察反應(yīng)孔，當(dāng)一層紅細(xì)胞凝集顆粒均勻覆蓋于整個(gè)孔底，判定為“凝集”（將反應(yīng)板傾斜，無(wú)紅細(xì)胞流淌現(xiàn)象），記錄為“+”。“不凝集”的概念：觀(guān)察反應(yīng)孔，當(dāng)紅細(xì)胞完全自然沉降到孔底中央，形成一個(gè)邊緣光滑無(wú)凝集顆粒的紅圓點(diǎn)，判定為“不凝集”（將反應(yīng)板傾斜，有紅細(xì)胞流淌現(xiàn)象），記錄為“”。ND抗原的血凝效價(jià)的概念：凡能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋度稱(chēng)為該ND抗原的血凝效價(jià)。判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的方法判定、記錄反應(yīng)結(jié)果時(shí)，可繪制一個(gè)表格，將試驗(yàn)情況與結(jié)果判斷作填寫(xiě)。如下是一個(gè)ND抗原原血凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果判定與記錄的例子，可作模仿。

18、孔號(hào)123456789101112效價(jià)抗原稀析1：24816326412825651210242048PBS對(duì)照1：64反應(yīng)圖像結(jié)果記錄+-84個(gè)血凝單位（4HAU）抗原的配制方法依據(jù)ND抗原原液的HA效價(jià)，用PBS生理鹽水將該抗原原液稀析為4HAU抗原（用于下述HI試驗(yàn)）。每mL抗原原液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為：該抗原原液效價(jià)的倒數(shù)除以4減1。如上例，抗原原液效價(jià)為1：64，則，每mL抗原原液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為64/4-1=15。（二）紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（微量法）檢測(cè)免疫禽只的HI抗體。1分裝PBS生理鹽水：在96孔反應(yīng)板上，取其12孔，第1-11孔每孔加入PBS生理鹽水25u

19、L;2.向第1孔加入被檢血清；3.稀釋被檢血清: 用25uL移液器將第1孔中的被檢血清與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第2孔；用移液器將第2孔中的抗原與PBS生理鹽水吹打2-3次混合均勻并吸取25uL至第3孔，如此，直至第10孔，從10孔吸取25uL溶液棄去，換滴頭；4.加入4HAU抗原：向第1至第11孔加入4HAU ND抗原溶液，每孔25uL;5加入紅細(xì)胞懸液：向第1至第12孔加入1雞紅細(xì)胞懸浮液，每孔25uL，室溫中靜置2030分鐘，觀(guān)察結(jié)果并記錄。6. 判定結(jié)果（觀(guān)察、判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的相關(guān)概念與方法）“凝集”的概念：觀(guān)察反應(yīng)孔，當(dāng)一層紅細(xì)胞凝集顆粒均勻覆蓋于整個(gè)孔

20、底，判定為“凝集”（將反應(yīng)板傾斜，無(wú)紅細(xì)胞流淌現(xiàn)象），記錄為“+”，讀作凝集。“完全抑制”的概念：觀(guān)察反應(yīng)孔，當(dāng)紅細(xì)胞完全不凝集而自然沉降于試管底部中央，形成一個(gè)邊緣光滑的紅圓點(diǎn)，邊緣沒(méi)有分布紅細(xì)胞凝集顆粒，判定為完全抑制，記錄為“”，讀作完全抑制；被檢血清HI效價(jià)的概念：凡能使0.25mL 濃度4個(gè)凝集單位的ND抗原凝集紅細(xì)胞的能力完全抑制的血清最高稀釋度稱(chēng)為該被檢血清的HI效價(jià)。判定、記錄反應(yīng)結(jié)果的方法判定、記錄反應(yīng)結(jié)果時(shí)，可繪制一個(gè)表格，將試驗(yàn)情況與結(jié)果判斷作填寫(xiě)。如下是2個(gè)被檢血清HA效價(jià)測(cè)定結(jié)果判定與記錄的例子，可作模仿。孔號(hào)123456789101112效價(jià)血清稀析 度1：2481

21、632641282565121024抗原對(duì)照PBS對(duì)照1：256血清1反應(yīng)圖像結(jié)果記錄-+-血清2反應(yīng)圖像1：64結(jié)果記錄-+-（三）根據(jù)ND等血凝性病毒病免監(jiān)結(jié)果指導(dǎo)雞群相應(yīng)病毒病免疫接種的步驟1計(jì)算禽群ND抗體合格率禽群ND抗體合格率的計(jì)算公式：ND抗體合格率=（被檢血清樣品數(shù)-抗體效價(jià)低于臨界滴度*的樣品數(shù)）/被檢血清樣品數(shù)100%。*注：ND抗體效價(jià)臨界滴度：雞群可抵抗NDV感染的ND抗體的最低滴度。這是一個(gè)由生產(chǎn)實(shí)際總結(jié)得出的數(shù)值，可因?qū)嶋H情況的變化而變化。目前，此值通常定為1：32。2.確定禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn) 禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn)也是一個(gè)由生產(chǎn)實(shí)際總結(jié)得出的數(shù)值，而且雞的日齡不同

22、其標(biāo)準(zhǔn)有不同。目前各種日齡雞群能夠抵抗ND感染的的抗體合格率參考標(biāo)準(zhǔn)為：1月齡以下的小雞，抗體合格率要求在85以上，且其余15的被檢雞只的抗體水平不低于1:5；中成雞群的抗體合格率應(yīng)在95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應(yīng)不低于1:5。3將被檢雞群抗體合格率對(duì)照禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn)，確定被檢雞群目前的免疫狀況，指導(dǎo)其進(jìn)一步的免疫接種。 如下為根據(jù)ND等血凝性病毒病免監(jiān)結(jié)果指導(dǎo)雞群相應(yīng)病毒病免疫接種的一個(gè)例子：某后備種雞群，18周齡，共3000只種雞，隨機(jī)采血20份，經(jīng)ND HI試驗(yàn)檢測(cè)，各樣品抗體水平情況如下表。請(qǐng)根據(jù)該免監(jiān)結(jié)果，對(duì)該指導(dǎo)雞群的ND免疫接種作指導(dǎo)?？贵w效價(jià)<1:81:1

23、61:321:641:1281:2561:320>1:640監(jiān)測(cè)只數(shù)13316600解：1計(jì)算雞群ND抗體合格率（臨界滴度取1：32）：雞群ND抗體合格率（被檢血清樣品數(shù)-抗體效價(jià)低于臨界滴度*的樣品數(shù)）/被檢血清樣品數(shù)100%（20-4）/20×100%80%2. 確定禽群抗體合格率的標(biāo)準(zhǔn)：本雞群為中成雞群，中成雞群的抗體合格率標(biāo)準(zhǔn)為95以上，且其余5的被檢雞只的抗體水平應(yīng)不低于1:5。3. 將被檢雞群抗體合格率對(duì)照禽群抗體合格率標(biāo)準(zhǔn)，確定被檢雞群目前的免疫狀況： 該被檢雞群的ND抗體合格率為80%，而中成雞群的抗體合格率標(biāo)準(zhǔn)是95%，故可見(jiàn)該雞群目前ND免疫狀況未及格，建議

24、盡快給于ND疫苗的加強(qiáng)免疫接種。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1.扼要反映本實(shí)驗(yàn)步驟。2.報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)包括各被檢血清樣品各孔的反應(yīng)結(jié)果和各被檢血清的HI效價(jià)，及應(yīng)用本試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)被檢雞群的ND臨床免疫接種。3.試指出應(yīng)用本技術(shù)對(duì)不同的血凝性病毒病作免疫監(jiān)測(cè)時(shí)，在材料、方法上有何異同。七、實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)(參閱實(shí)驗(yàn)步驟)八、思考題家禽具血凝性病毒病的免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)有哪些關(guān)鍵點(diǎn)?請(qǐng)作扼要陳述。實(shí)驗(yàn)三 雞白痢與小鵝瘟的血清學(xué)診斷本實(shí)驗(yàn)包括雞白痢平板凝集試驗(yàn)及小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)二部分。實(shí)驗(yàn)三之一雞白痢平板凝集試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握平板凝集試驗(yàn)的基本原理與操作方法。 2了解平板凝集試驗(yàn)在診斷、監(jiān)測(cè)、控制與凈化雞群雞白痢

25、中的應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1雞白痢平板凝集試驗(yàn)操作。2雞白痢平板凝集試驗(yàn)在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的應(yīng)用。三、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及材料 1雞白痢抗原：是用雞白痢沙門(mén)氏桿菌培養(yǎng)物加入0.3的甲醛溶液滅活后，制成每毫升含菌100億的懸浮液，并加入抗凝劑和色素制成。由獸醫(yī)生物制品廠(chǎng)提供。 2雞白痢標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：由獸醫(yī)生物制品廠(chǎng)提供。 3被檢血清或全血：采自被檢雞群。4潔凈玻璃板、微量移液器或滴管、采血針頭、不銹鋼絲環(huán)、混合棒及被檢雞若干只。四、實(shí)驗(yàn)原理在有電解質(zhì)存在的條件下，細(xì)菌等顆粒性抗原和特異性抗體相互結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒（塊），稱(chēng)為凝集反應(yīng)。根據(jù)顆粒的大小與出現(xiàn)時(shí)間的快慢判定試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果。參與反應(yīng)的抗原與

26、抗體分別稱(chēng)為凝集原和凝集素。平板凝集試驗(yàn)具有由于簡(jiǎn)易、快速、敏感、特異的特點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)，廣泛用于人畜多種傳染病的快速診斷，在家禽最常用的是雞白痢雞與敗血支原體感染的檢驗(yàn)。五、實(shí)驗(yàn)步驟1操作程序取一潔凈玻片，用蠟筆劃成若干方格，并編號(hào)，將抗原充分振蕩混勻，用移液器或滴管吸取雞白痢抗原，垂直滴一滴(約005mL)于平板各格上，在第一格抗原上滴上雞白痢標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清一滴，在第二格抗原上滴上陰性血清一滴。其余各格為樣品檢測(cè)格（每只雞一格），用針頭刺破被檢雞的翅靜脈或雞冠，用不銹鋼絲環(huán)沾取血液一環(huán)或用移液器吸取血液005mL滴加在抗原滴上，用滅菌牙簽迅速將被檢雞全血與抗原混勻并散開(kāi)至直徑約為2厘米的薄層后

27、，輕輕晃動(dòng)玻板，觀(guān)測(cè)至5分鐘，判定結(jié)果并記錄。2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)100%凝集和陰性對(duì)照液體均勻混濁無(wú)凝集現(xiàn)象的前提下，抗原與血液或血清混和后，于1分鐘內(nèi)出現(xiàn)很多大塊的凝集顆粒且底液清亮者為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，記錄為“#”；13分鐘內(nèi)出現(xiàn)很多大小不等的凝集顆粒且底液略有混濁者為中強(qiáng)度陽(yáng)性反應(yīng)，記錄為“+”；34分鐘后，出現(xiàn)少量細(xì)微顆粒，-底液較混濁者為弱陽(yáng)性反應(yīng)，記錄為“+”；未見(jiàn)凝集現(xiàn)象發(fā)生或在4分鐘以后出現(xiàn)不明顯的凝集現(xiàn)象者為陰性反應(yīng)，記錄為“一”。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求 1應(yīng)將試驗(yàn)的結(jié)果寫(xiě)清楚，分析陽(yáng)性結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)。 2將本試驗(yàn)在生產(chǎn)中應(yīng)用及應(yīng)注意的主要問(wèn)題列出綱要。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1雞白

28、痢平板凝集試驗(yàn)的應(yīng)用： 雞白痢是流行普遍、危害嚴(yán)重的家禽傳染病，其傳播的重要途徑之一是經(jīng)卵垂直傳播。因此，搞好種雞群中對(duì)該病的控制甚至凈化工作是防制工作中的重要手段。雞白痢平板凝集試驗(yàn)以簡(jiǎn)便、快捷、特異、敏感等特點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外普遍用于該病的臨床檢驗(yàn)，監(jiān)視該病的控制與凈化效果，指導(dǎo)控制與凈化措施的修訂與實(shí)施。為更好地發(fā)揮本試驗(yàn)在疾病控制中的作用，在實(shí)施檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意如下事項(xiàng)。 2對(duì)一般性商品生產(chǎn)種雞群作雞白痢檢疫時(shí)應(yīng)注意以下問(wèn)題： (1)檢測(cè)樣品抽檢比例一般為12。 (2)檢測(cè)出的陽(yáng)性雞只可淘汰也可不淘汰。 (3)檢測(cè)的時(shí)間間隔對(duì)后備雞群，首次檢驗(yàn)應(yīng)在40-70日齡，第二次檢測(cè)在全面開(kāi)產(chǎn)后每年檢測(cè)23

29、次。 (4)檢測(cè)工作一定要配合有效的防疫工作。 (5)檢測(cè)后對(duì)結(jié)果作統(tǒng)計(jì)，計(jì)算感染的陽(yáng)性率并與上次檢驗(yàn)結(jié)果比較，以便評(píng)估上次檢測(cè)后相應(yīng)防疫措施的效果，以便修訂防疫計(jì)劃，直至雞群感染率下降至最低水平。 3對(duì)以建立凈化雞白痢為目的的SPF雞群作檢疫時(shí)應(yīng)注意以下問(wèn)題： (1)檢測(cè)樣品的比例應(yīng)為100。 (2)檢測(cè)出的陽(yáng)性雞只應(yīng)予淘汰。 (3)檢測(cè)時(shí)間間隔應(yīng)為每月1次，或根據(jù)具體凈化計(jì)劃確定間隔時(shí)間。 (4)對(duì)陰性雞群實(shí)施特別嚴(yán)格的隔離、衛(wèi)生消毒措施和藥物防制措施。 (5)雞群完全凈化的基本標(biāo)準(zhǔn)是以最后連續(xù)三次檢測(cè)全為陰性，且雞群在該段時(shí)間未用過(guò)對(duì)相應(yīng)疾病敏感的藥物。 4、注意事項(xiàng) (1)雞白痢抗原應(yīng)

30、保存于8-10ºC、避光、干燥處，使用過(guò)程中應(yīng)不斷搖勻。 (2)雞向痢抗原適用于檢查產(chǎn)蛋母雞及一年以上的公雞，對(duì)幼齡雞的敏感性較差。 (3)平板凝集反應(yīng)應(yīng)在20以上的室溫下進(jìn)行。 (4)使用藍(lán)紫色雞白痢抗原作試驗(yàn)，最好襯以白色背景以便于觀(guān)察。 (5)本試驗(yàn)還可以以被檢雞卵黃液作被檢材料，判斷標(biāo)準(zhǔn)同上。八、思考題 1雞自痢平板凝集試驗(yàn)應(yīng)注意哪些內(nèi)容，判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)如何? 2在生產(chǎn)中為有效控制雞白痢，應(yīng)結(jié)合雞白痢平板凝集試驗(yàn)采取哪些措施?實(shí)驗(yàn)三之二小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私猸傊瑪U(kuò)散（AGP）試驗(yàn)的原理，并掌握小鵝瘟（GP）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的的操作方法和臨床應(yīng)用的方法。 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1

31、GP瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。 三、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及材料1標(biāo)準(zhǔn)GP抗原：將已知GPV種毒按110稀釋?zhuān)臃N于12-14日齡的無(wú)相應(yīng)抗體的鵝胚尿囊腔內(nèi)，02mL只，繼續(xù)孵化，每天照蛋，收集接種后72-120小時(shí)之間死亡胚，氣室向上靜置4冰箱412小時(shí)，收獲尿囊液及具有典型病變的胚體，取l份胚體，2份尿囊液搗碎制成勻漿，加等量三氯甲烷(氯仿)震搖30分鐘，以3500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，吸取上清液裝入透析袋，包埋于干燥硅膠中越夜，至袋內(nèi)溶液完全干燥，向袋內(nèi)加入原液容量1/20的去離子水，使內(nèi)容物溶解，即為沉淀抗原。2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：小鵝瘟高免血清。3被檢抗原：無(wú)菌采取具有典型病變的患病雛鵝肝組織，搗碎加2倍量離

32、子水，制備成組織懸液，參照制各標(biāo)準(zhǔn)GP抗原方法用氯仿處理硅膠包埋濃縮加入原懸浮120的去離子水為被檢抗原。4被檢血清：受檢雛鵝血液自然析出的血清。5瓊脂板凝膠制備與打孔：凝膠配方：瓊脂糖 0.71.2克，氯化鈉 8克，苯酚0.1mL，蒸餾水 100mL。凝集制備：將各種試劑依次加入后，用5.6碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 6.8-7.6，水浴加熱使瓊脂糖充分溶解。將溶化的瓊脂凝膠傾注于清沽的玻板上或平皿，制成厚度約為3毫米的瓊脂凝膠板。注意不要產(chǎn)生氣泡。打孔方法同馬立克氏病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。打孔：在制備好的瓊脂凝膠扳上打孔，(其打孔圖形按需要而定，一般采用七孔梅花圖形，操作時(shí)，先用一張與凝膠板大小相仿的白紙

33、片，按要求畫(huà)好打孔圖形，然后，將圖形放在凝膠板底下，用打孔器依樣打孔。四、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)是血清學(xué)沉淀試驗(yàn)的一種，以瓊脂凝膠作為抗原抗體免疫擴(kuò)散和形成沉淀反應(yīng)的載體。瓊脂凝膠的含水量在90以上，能允許分子量在200000以下的大分子物質(zhì)自由通過(guò)和擴(kuò)散，絕大多數(shù)的可溶性抗原與免疫球蛋白的分子量都在200000以下，所以能在凝膠內(nèi)自由擴(kuò)散。若特異的抗原、抗體在凝膠中各以其固有的擴(kuò)散系數(shù)擴(kuò)散，當(dāng)兩者在比例最合適的區(qū)域內(nèi)相遇，反應(yīng)生成的沉淀物的顆粒較大，停留在凝膠中不再擴(kuò)散，即發(fā)生沉淀反應(yīng)形成不透明的白色沉淀線(xiàn)。小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，可用標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測(cè)血清抗體，亦可用標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)GP抗原，前

34、者陽(yáng)性檢出率為100，后者檢出率達(dá)50以上。五、實(shí)驗(yàn)步驟1操作程序方法一：用GB標(biāo)準(zhǔn)抗原檢測(cè)受檢血清GB抗體用移液管吸取標(biāo)準(zhǔn)GB抗原加入中心孔內(nèi)，外周任何兩個(gè)相對(duì)孔加入GB標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，其余各外周孔加入各被檢鵝的血清，容量以平孔面為度，注意不要溢出孔外，不要有氣泡，并記錄點(diǎn)樣順序。所有樣本加入完畢，放入濕盒35-37恒溫中過(guò)夜，次日（24h）觀(guān)察并記錄結(jié)果。方法二：用GB標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)GB抗原 用移液器吸取GB標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清加入中心孔內(nèi)，外周任何相對(duì)的兩孔加入標(biāo)準(zhǔn)GB抗原，其余外周孔分別加入受檢鵝組織處理液，加入量以平孔面為度。注意不要溢出孔外，不要有氣泡，并記錄點(diǎn)樣順序。 所有樣品加完后，放

35、入溫盒置35-37恒溫箱中過(guò)夜，次日觀(guān)察并記錄結(jié)果。3結(jié)果判定若受檢血清有GB特異抗體或受檢組織含有GB病毒抗原，則在抗原與抗體孔之間產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的清晰的白色沉淀線(xiàn)，此為陽(yáng)性反應(yīng)。相反，如抗原、抗體之間不出現(xiàn)沉淀線(xiàn)則為陰性。沉淀線(xiàn)一般出現(xiàn)在抗原抗體孔之中間，但有時(shí)由于抗原濃度與抗體濃度不一，沉淀線(xiàn)往往偏近抗原孔或抗體孔，有時(shí)可能出現(xiàn)一條以上的沉淀線(xiàn)，這些情況均屬陽(yáng)性反應(yīng)。如果被檢孔沒(méi)有出現(xiàn)白色沉淀線(xiàn)，但鄰接的陽(yáng)性對(duì)照孔的沉淀線(xiàn)末端向該被檢孔內(nèi)側(cè)偏彎，可認(rèn)為該被檢孔樣品為陽(yáng)性：若鄰近的陽(yáng)性對(duì)照孔的沉淀線(xiàn)末端向該被檢孔直伸或一向其外側(cè)偏彎，或該被檢孔雖然有沉淀線(xiàn)，但該沉淀線(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照孔沉淀線(xiàn)交叉(

36、屬非特異性沉淀線(xiàn))，則此被檢樣品為陰性。 理論上，大多數(shù)傳染病都可應(yīng)用AGP試驗(yàn)作檢驗(yàn)，目前常應(yīng)用AGP試驗(yàn)檢測(cè)的家禽傳染病還有雞馬立克氏病、傳染性法氏囊病、家禽腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)、滑液囊霉形體病、禽流感、禽霍亂等，基本原理和方法同上，具體操作可按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求 1說(shuō)明瓊擴(kuò)試驗(yàn)的基本原理、方法。 2準(zhǔn)確報(bào)告本次試驗(yàn)的結(jié)果，分析存在的問(wèn)題。 3說(shuō)明本試驗(yàn)還可以應(yīng)用于哪些家禽傳染病的檢驗(yàn)。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1配制瓊脂凝膠時(shí)，瓊脂濃度的很重要，要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定，瓊脂濃度較大時(shí)，制成的瓊脂膠較硬，較易打孔，但過(guò)硬的凝膠板容易在反應(yīng)過(guò)程中千裂，而且由于密度大，還會(huì)影響樣本的擴(kuò)散速度；而

37、濃度太小時(shí)，瓊脂凝膠板則很軟，難于打孔，而且打孔后，孔內(nèi)容易滲出水來(lái)，影響加樣量；氣溫高時(shí)，濃度應(yīng)大些，氣溫低時(shí)，濃度應(yīng)小些。通常濃度為0.651.2o 2為了避免打孔時(shí)孔周邊瓊脂脫離漏底，可在制各瓊脂板前，將玻璃板浸入充分溶化的瓊脂凝膠液中，取出放在恒溫箱中烘干。再行倒板，這樣由于玻璃板面較粗糙，與瓊脂結(jié)合較牢，打孔時(shí)孔周瓊脂不易脫離。 3點(diǎn)樣時(shí)，其加樣量應(yīng)統(tǒng)一以加至各孔滿(mǎn)為標(biāo)準(zhǔn)，不要時(shí)多時(shí)少。如果抗原抗體的比例不當(dāng)，最易影響反應(yīng)結(jié)果。 4反應(yīng)溫度必須始終相對(duì)恒定，否則可能會(huì)造成假陽(yáng)性。 5觀(guān)察結(jié)果最好在日光燈下進(jìn)行，必要時(shí)可借助放大鏡。八、思考題 1家禽傳染病的AGP試驗(yàn)基本操作方法與注意

38、事項(xiàng)如何?結(jié)果判定方法如何? 2本方法?？捎糜谀男┘仪莶〉臋z測(cè)?實(shí)驗(yàn)四鴨疫里默氏桿菌病的實(shí)驗(yàn)診斷一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解鴨疫里默氏桿菌病的實(shí)驗(yàn)診斷程序與方法。 2熟悉鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)性狀、生化特征和致病性。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1. 鴨疫里默氏桿菌病的臨床癥狀與病理變化觀(guān)察。2鴨疫里默氏桿菌病的病原分離和培養(yǎng)。3鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)特性與細(xì)菌形態(tài)觀(guān)察。4鴨疫里默氏桿菌的生化特性觀(guān)察。三、實(shí)驗(yàn)儀器、設(shè)備及材料 1解剖剪、鑷子、解剖盤(pán)、接種棒、酒精燈、酒精棉球、一次性手套、滅菌棉簽、1ml注射器、放大鏡、香柏油、擦鏡紙、顯微鏡、生化培養(yǎng)箱等。 2試驗(yàn)動(dòng)物、鮮血瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、滅能小牛血清、微量

39、生化發(fā)酵管等、革蘭氏染色液等。四、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)鴨疫里默氏桿菌的特征病理變化、培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)和生化特征，可以同其他細(xì)菌性病原導(dǎo)致的家禽傳染病鑒別；但分離菌株是否具有致病力須采用敏感動(dòng)物進(jìn)行人工致病試驗(yàn)。五、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 鴨疫里默氏桿菌病的臨床癥狀與病理變化觀(guān)察認(rèn)真觀(guān)察實(shí)驗(yàn)鴨只的臨床癥狀后進(jìn)行詳細(xì)系統(tǒng)的解剖，觀(guān)察病鴨的病理變化。發(fā)生鴨疫里默氏桿菌病病鴨表現(xiàn)出該病的特征癥狀與病變，病鴨主要特征表現(xiàn)為精神沉郁、濕眼圈，鼻竇部腫脹，跗關(guān)節(jié)腫脹，中樞神經(jīng)紊亂，共濟(jì)失調(diào)；剖檢可見(jiàn)纖維素性滲出性心包炎、肝周炎和氣囊炎，部分病鴨可見(jiàn)鼻竇腔有黃白色干酪樣滲出物。2鴨疫里默氏桿菌病的病原分離和培養(yǎng)。在急性敗血

40、癥期，細(xì)菌在病鴨各器官組織，如心血、腦、氣囊、肝臟、肺、骨髓和病變滲出物中均可分離到，而前三種器官最適合細(xì)菌分離。無(wú)菌操作剪開(kāi)病鴨腹腔和頭部顱骨，分別從心血、肝臟和腦進(jìn)行細(xì)菌分離，劃線(xiàn)接種鮮血瓊脂平板（或巧克力瓊脂、胰酶大豆瓊脂），置燭缸或厭氧培養(yǎng)箱37培養(yǎng)24-36小時(shí)，觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。3鴨疫里默氏桿菌培養(yǎng)性狀與細(xì)菌形態(tài)觀(guān)察。培養(yǎng)特性 鴨疫里默氏桿菌在鮮血瓊脂、巧克力瓊脂和胰酶大豆瓊脂上生長(zhǎng)良好，在血液瓊脂上經(jīng)37培養(yǎng)24小時(shí)，可形成1-2.5mm、圓形、凸起、邊緣光滑、閃光或奶油狀菌落，不溶血。在血液肉湯中經(jīng)37培養(yǎng)24小時(shí)，可見(jiàn)上下一致渾濁，管底無(wú)或僅有少量灰白色沉淀物。在麥康凱瓊脂上

41、不生長(zhǎng)。細(xì)菌形態(tài)將鴨疫里默氏桿菌分離菌株的1824小時(shí)純固體培養(yǎng)物按常規(guī)進(jìn)行革蘭氏與瑞氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下（油鏡）觀(guān)察菌體形態(tài)。鴨疫里默氏桿菌為革蘭氏陰性、不運(yùn)動(dòng)、不形成芽孢的桿菌，大小為（1-5）µm×（0.3-0.5）µm，單個(gè)或成雙存在，液體培養(yǎng)可見(jiàn)絲狀長(zhǎng)達(dá)11-24µm。瑞士染色呈兩極著色。 4鴨疫里默氏桿菌的生化特性觀(guān)察。將接種環(huán)拉直并燒滅菌后（稍冷卻）挑取血液瓊脂平板分離菌的24小時(shí)培養(yǎng)的單菌落接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，發(fā)酵管開(kāi)口端用膠布封口，盲端向上3045度角放置燭缸37培養(yǎng)24-36小時(shí)，觀(guān)察發(fā)酵管內(nèi)液體的顏色變化。鴨疫里默氏桿菌不發(fā)

42、酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、甘露醇。吲哚和硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原及枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)均為陰性。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1扼要反映鴨疫里默氏桿菌病病鴨的的病原分離、細(xì)菌形態(tài)觀(guān)察、培養(yǎng)特性和生化特性檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟。 2準(zhǔn)確報(bào)告本次試驗(yàn)的結(jié)果，分析存在的問(wèn)題。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 1注意鴨疫里默氏桿菌的染色方法及顯微鏡下的形態(tài)特點(diǎn)。 2注意禽鴨疫里默氏桿菌的培養(yǎng)特性與生化特性。八、思考題 1鴨疫里默氏桿菌病的實(shí)驗(yàn)診斷的基本方法如何?2鴨疫里默氏桿菌病的培養(yǎng)特性與生化特性如何?第二部分教學(xué)實(shí)習(xí)指導(dǎo)雞新城疫的實(shí)驗(yàn)診斷1 實(shí)習(xí)目的要求通過(guò)本課程實(shí)習(xí)，掌握雞新城疫常規(guī)實(shí)驗(yàn)診斷原理、方法，并可據(jù)此開(kāi)展對(duì)其他

43、家禽病毒性傳染病的實(shí)驗(yàn)診斷。2 實(shí)驗(yàn)原理NDV感染雞通常可表現(xiàn)呼吸困難、嗉囔積液、頭冠紫黑等特征癥狀，出現(xiàn)腺胃、肌胃出血，盲腸扁桃體腫大、出血，泄殖腔出血等特征病理變化。ND病毒可大量存在于肝、脾、腦的器官和呼吸道、消化道分泌物中并可在雞胚上增殖，使雞胚感染致死。感染胚液（病毒）可以凝集雞等動(dòng)物的紅細(xì)胞，該凝集能力可以被特異抗體抑制。根據(jù)本病毒以上特征，采用雞胚從疑似ND病雞病料中分離增殖病毒，經(jīng)HA、HI試驗(yàn)和人工發(fā)病試驗(yàn)等，可以鑒定本病毒，而對(duì)雞新城疫作出確診。3 實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)病雞的剖檢與病料采取處理-病毒的分離培養(yǎng)-病毒的鑒定-實(shí)驗(yàn)結(jié)果-實(shí)驗(yàn)結(jié)論。4 實(shí)驗(yàn)主要用材4.1 ND血清，適量，HI

44、效價(jià)為1：32，購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所，凍結(jié)保存?zhèn)溆谩?.2疑似ND病雞： 2只（死活各1），病雞30日齡左右。10d齡曾以IV系弱毒疫苗飲水免疫，約28日齡開(kāi)始發(fā)病，病雞表現(xiàn)厭食、呼吸困難、嗉囔腫大、頭冠紫黑等癥狀，死亡率達(dá)30%。發(fā)病后曾采用抗生素治療效果不理想。4.3病禽尸體剖檢、病料采集與處理的用材：剖檢盆、消毒劑、剪刀、毛巾、鑷子、酒精棉、酒精燈；滅菌的研缽、棉簽、西林瓶（若干）、PBS生理鹽水（配方見(jiàn)4.6）、510ml注射器超濾器、離心管（若干）與離心機(jī)等。4.4病毒分離增殖培養(yǎng)用材：10日齡健康雞胚(來(lái)源于ND低免母雞群)10只；恒溫培養(yǎng)箱；1毫升注射器、打孔器、西林瓶等滅菌備用

45、；酒精棉球、碘酊棉球、石蠟、暗室；普通冰箱等。4.5 病毒鑒定用材（HA、HI試驗(yàn)用材）：包括被檢病毒、滅菌PBS生理鹽水、1%紅細(xì)胞懸浮液（配方見(jiàn)4.7）、25L 移液器，96孔V型反應(yīng)板等。4.6PBS的配制：按PBS配方準(zhǔn)確稱(chēng)取試劑（NaCl 4g；Kcl 0.1g；Na2HPO4 1.45g；KH2PO4 0.1g）溶于400mL蒸餾水中過(guò)濾測(cè)試PH值高壓滅菌備用。4.7紅細(xì)胞懸液配制(包括公雞的采血) ：用5ml注射器吸取1 ml抗凝劑采取公禽血液4ml搖勻注入離心管加入PBS鹽水洗滌3000rpm，15分鐘，重復(fù)用PBS洗滌2次量取沉淀的紅細(xì)胞加入99倍PBS稀釋成1懸浮液48保存

46、備用。5 實(shí)驗(yàn)方法5.1病雞剖檢與病料采取處理 病雞的剖檢.1病禽的體表檢查（包括天然孔、皮膚各關(guān)節(jié)及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的檢查）；.2體表的消毒：用消毒水將親體羽毛浸濕，以防止病原擴(kuò)散及避免羽毛飛揚(yáng)；.3皮下打開(kāi)與檢查：用剪刀將股內(nèi)側(cè)連接腹側(cè)的皮膚剪開(kāi)，將兩腿向外和下方翻壓，直至股關(guān)節(jié)脫臼，使禽體被臥位平放于瓷盆上。橫向剪開(kāi)腹部皮膚，使切口與上述股側(cè)皮膚切口相連，握住有游離皮膚，向前一直剝落到鎖骨部，觀(guān)察皮下肌肉有沒(méi)有出血、失水等現(xiàn)象；.4體腔打開(kāi)與檢查：用點(diǎn)燃的酒精棉在以被打開(kāi)的肌肉上充分消毒，橫向剪開(kāi)腹肌、腹膜，并沿胸骨的兩側(cè)，向前將各肋骨、鎖骨剪斷，抓住龍骨的后端，用力向前向上翻拉，暴露整個(gè)體腔的

47、器官并作器官表面檢查；.5內(nèi)臟摘出與檢查：將內(nèi)臟器官小心摘除移至體腔外，依次觀(guān)察檢查體腔及其附著器官和摘除移出器官。.6 頭頸部與法氏囊的檢查。 病料采取處理.1病雞（活）口腔拭子采取與處理：用滅菌棉簽從病雞口腔氣管內(nèi)拭取粘液折取拭子頭部置于滅菌西林瓶?jī)?nèi)加入3-5ml PBS生理鹽水（含適量慶大霉素）震蕩置4-8待作無(wú)菌檢驗(yàn)（樣品簡(jiǎn)稱(chēng)拭子懸液）。.2病雞(死)組織病料的采取與處理：于上述剖檢過(guò)程病雞打開(kāi)體腔后，經(jīng)無(wú)菌手續(xù)采取肝、脾、腦至研砵 充分研磨加15-20倍PBS生理鹽水（含適量慶大霉素）震蕩離心取上清液置4-8待作無(wú)菌檢驗(yàn)（樣品簡(jiǎn)稱(chēng)組織懸液）。.3病料上清液的無(wú)菌檢驗(yàn)及超濾：用1ml注

48、射器分別吸取拭子懸液及組織懸液0.2ml于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，作無(wú)菌檢驗(yàn)（注意做好標(biāo)記與記錄）次日早上觀(guān)察無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果并記錄，剔除菌檢不合格樣品，合格樣品待作接種雞胚。5.2病毒分離培養(yǎng)5.2.1禽胚的準(zhǔn)備(消毒與定位等)：準(zhǔn)備約37溫水適量加入適量福爾馬林溶液配備消毒溫水洗滌雞胚在暗室中檢查雞胚健康情況，剔除不健康胚用蠟筆畫(huà)出氣室與接種部位繼續(xù)孵化。5.2.2病毒的接種：照胚，剔除不健康胚胚蛋氣室與接種部位消毒病料的接種（0.2ml/只雞胚，其中拭子懸液接種適量，組織懸液接種適量）封口繼續(xù)孵化以后每天照胚2次（每次及時(shí)檢出死胚置48保存待檢），直至接種后72小時(shí)。5.3 病毒的鑒定感染雞胚的剖檢

49、與胚液收集：雞胚消毒剪開(kāi)氣室殼、膜剔除細(xì)菌污染胚刺破羊水膜檢查雞胚胚體病變每只胚分別收集胚液置疫苗瓶中記錄胚液的具體來(lái)源（該胚接種液種類(lèi)，死/活，污染與否），備作HA檢測(cè)。胚液的HA檢測(cè)：選擇疑似病毒感染胚胚液作HA檢測(cè)，其基本步驟如下述“1）7）”及表1：1）分裝PBS生理鹽水；（1-12孔，25ul）；2）第一孔加25ul被檢病毒（胚液）；3）稀釋被檢病毒：1-11孔作倍比稀釋?zhuān)?）加入PBS生理鹽水：（1-12孔，25ul）；5）加入紅細(xì)胞懸液；（1-12孔，25ul）；6）靜置15-20min7) 判定結(jié)果（讀出各胚胚液HA效價(jià)并記錄）表1 紅細(xì)胞凝集（HA）試驗(yàn)（微量法） （單位：l

50、）孔號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 122 4 8 16 32 64128 256 512 1024 2048 PBS對(duì)照25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25棄2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2525 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25被檢病毒稀釋倍數(shù)PBS鹽水被檢病毒PBS鹽水1%紅細(xì)胞懸液作用溫度與時(shí)間振蕩器上振蕩混均約1min，放入37恒溫箱中1530 min，反應(yīng)結(jié)果舉例注“”：凝集。凝集反應(yīng)者，凝集的紅

51、細(xì)胞呈薄膜狀，均勻的復(fù)滿(mǎn)孔底，有的似有紅細(xì)胞沉積于中央?！啊保翰荒?。紅細(xì)胞全部沉于孔底中央，周?chē)鸁o(wú)散在的紅細(xì)胞凝集顆粒。該舉例中被檢病毒HA效價(jià)判為1：32.5.3.3 4HAU被檢病毒液的配制：按HA效價(jià)檢測(cè)結(jié)果，挑選其中較高效價(jià)（1：8或以上）的感染胚液，每毫升加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為：該胚液HA效價(jià)的倒數(shù)除以4減1。例如：胚液的效價(jià)為?。?28，則每毫升胚液加入PBS生理鹽水的毫升數(shù)為：128/4-1=31。將配制好的4HAU被檢病毒液置于4°C冰箱保存作HI試驗(yàn)。5.3.4胚液的HI試驗(yàn)：主要程序見(jiàn)如下“1）6）”及表:1)分裝PBS生理鹽水；1-11孔25 ul,12孔50 ul；2)稀釋血清；向第1孔加入陽(yáng)性血清25 ul,依次稀釋至第10孔；3)加入4HAU抗原；1-11孔25 ul；4)加入紅細(xì)胞懸液；1-12孔25 ul；5)靜置10min；6)判定結(jié)果（讀出各胚胚液HI效價(jià)并記錄）。表2 雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)操作術(shù)式（微