1、第十章第十章高效液相色譜分析法高效液相色譜分析法一、高效液相色譜儀一、高效液相色譜儀HPLCHPLC二、高效液相色譜法的特點二、高效液相色譜法的特點feature of HPLCfeature of HPLC三、流程及主要部件三、流程及主要部件general process and general process and main assembly of HPLCmain assembly of HPLC第一節(jié)第一節(jié)高效液相色譜的高效液相色譜的特點與儀器特點與儀器high performance liquid chromatographfeature and instrument of HPL

2、C第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜的特點與儀器高效液相色譜的特點與儀器 與經(jīng)典液相色譜法比較與經(jīng)典液相色譜法比較 與氣相色譜法比較與氣相色譜法比較 高效液相色譜的特點高效液相色譜的特點 高效液相色譜高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動相的是以溶劑液體為流動相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜吸附色譜(液固色譜液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色；離子交換色譜；尺寸排阻色譜譜(凝膠浸透色譜凝膠浸透色譜)。 早期液相色譜，包括早期液相色譜，包括Tswett的任務，都是在直的任務，都是在直徑徑15cm, 長長50500cm的玻璃柱中

3、進展的。為保證的玻璃柱中進展的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150200m范圍內(nèi)。即使這樣，流速依然很低范圍內(nèi)。即使這樣，流速依然很低(1mL/min)，分析時間依然很長！，分析時間依然很長！ 當加壓添加流速當加壓添加流速(真空或空氣泵真空或空氣泵)時，雖然分析時時，雖然分析時間減少，但柱塔板高度間減少，但柱塔板高度Hmin也相應添加了！或者說也相應添加了！或者說柱效下降了。為理處理分析時間及柱效問題，人們柱效下降了。為理處理分析時間及柱效問題，人們認識到：最為有效地添加柱效的獨一方法是減小填認識到：最為有效地添加柱效的獨一方法是減小填

4、充物的粒徑充物的粒徑310 m ！ 直到直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設備、年代，由于在高壓下操作的液壓設備、高效固定相以及高靈敏檢測器的出現(xiàn)及開展，才徹高效固定相以及高靈敏檢測器的出現(xiàn)及開展，才徹底處理了分析時間及柱效的問題。即所謂的高效液底處理了分析時間及柱效的問題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛運用。相色譜技術(shù)才真正得到廣泛運用。1. 高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大添加，采用高壓輸液設備，流速大添加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，

5、完成一次分析需時數(shù)小時。加料，完成一次分析需時數(shù)小時。高效：填充物顆粒極細且規(guī)那么，固定相涂漬均高效：填充物顆粒極細且規(guī)那么，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因此柱效很高。可以在數(shù)分鐘勻、傳質(zhì)阻力小，因此柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分別。內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分別。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV10-9g, 熒熒光檢測器光檢測器10-11g。色譜柱色譜柱: 柱長柱長/cm 10 25 10 200 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑/mm 2 10 10 50固定相粒度固定相粒度: 粒徑粒徑/ m 5 50 75 600 篩孔篩孔/目目 2500 300 200 30色譜柱入口壓力

6、色譜柱入口壓力/MPa 2 20 0.001 0.1色譜柱柱效色譜柱柱效/(實際塔板數(shù)實際塔板數(shù)/m) 2103 5 104 2 50進樣量進樣量/g 10-6 10-2 1 10分析時間分析時間/h 0.05 1.0 1 20高效液相色譜法高效液相色譜法經(jīng)典液相經(jīng)典液相(柱柱)色譜法色譜法工程工程高效液相色譜法與經(jīng)典液相高效液相色譜法與經(jīng)典液相(柱柱)色譜法的比較色譜法的比較2. HPLC與與GC的比較的比較分析對象及范圍：分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機物總數(shù)的物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高

7、沸點、高可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的占有機物總數(shù)的80%。流動相的選擇：流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的采用的流動相中為有限的幾種幾種“惰性氣體，只起運載作用，對組分惰性氣體，只起運載作用，對組分作用小；作用小；HPLC采用的流動相為液體或各種采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的時機多。它除了起液體的混合，可供選擇的時機多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分別的對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分別的奉獻很大，可經(jīng)過溶劑

8、來控制和改良分別。奉獻很大，可經(jīng)過溶劑來控制和改良分別。操作溫度：操作溫度：GC需高溫；需高溫；HPLC通常在室溫下通常在室溫下進展。進展。有機溶劑或一定有機溶劑或一定 pH 值的緩沖溶液值的緩沖溶液按分別過程物理化學原理分類的各種液相色譜法的比較按分別過程物理化學原理分類的各種液相色譜法的比較吸附色譜吸附色譜分配色譜分配色譜離子色譜離子色譜體積排阻色譜體積排阻色譜全多孔固全多孔固體吸附劑體吸附劑固定液固定液+載體載體高效微粒離高效微粒離子交換劑子交換劑不同孔徑的不同孔徑的多孔性凝膠多孔性凝膠固定相固定相流動相流動相分別原理分別原理平衡常數(shù)平衡常數(shù)不同極性不同極性有機溶劑有機溶劑不同極性有不同

9、極性有機溶劑和水機溶劑和水不同不同 pH 值值的緩沖溶液的緩沖溶液吸附系數(shù)吸附系數(shù)(KA)分配系數(shù)分配系數(shù) (KP)選擇性系選擇性系數(shù)數(shù) (KS)分布系數(shù)分布系數(shù) (KD)吸附吸附 解吸解吸溶解溶解 揮發(fā)揮發(fā)可逆性的可逆性的離子交換離子交換多孔凝膠的多孔凝膠的浸透或過濾浸透或過濾方法方法工程工程第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜法概述高效液相色譜法概述 高效液相色譜的分類高效液相色譜的分類 高效液相色譜的運用范圍和局限性高效液相色譜的運用范圍和局限性運用范圍運用范圍 高沸點不易揮發(fā)，受熱不穩(wěn)定高沸點不易揮發(fā)，受熱不穩(wěn)定易分解，分子量大，不同極性的有機物，易分解，分子量大，不同極性的有機物，生物活性物質(zhì)

10、及天然產(chǎn)物，化工產(chǎn)品及環(huán)生物活性物質(zhì)及天然產(chǎn)物，化工產(chǎn)品及環(huán)境污染物等等。境污染物等等。方法局限性：方法局限性： 運用多種溶劑，本錢高，且易產(chǎn)生污運用多種溶劑，本錢高，且易產(chǎn)生污染，梯度洗脫比氣相色譜的程序升溫復雜染，梯度洗脫比氣相色譜的程序升溫復雜 短少通用的檢測器短少通用的檢測器 分析具有多種沸程的石油產(chǎn)品，不能分析具有多種沸程的石油產(chǎn)品，不能替代氣相色譜法也不能替代中、低壓液相替代氣相色譜法也不能替代中、低壓液相色譜法，尤其對受壓易分解的生物活性樣色譜法，尤其對受壓易分解的生物活性樣品品一、液相色譜儀器一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatogr

11、aph液相色譜儀液相色譜儀2液相色譜儀液相色譜儀3液相色譜儀液相色譜儀4二、高效液相色譜法的特點二、高效液相色譜法的特點 feature of HPLC feature of HPLC 特點：高壓、高效、高速 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分別分析方法。三、流程及主要部件三、流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程2.主要部件主要部件(1) 高壓輸液泵高壓輸液泵主要部件之一，壓力：主要部件之一，壓力：150350105 Pa。為了獲得高柱效而運用粒度很小的固定相為了獲得高柱效而運用粒度很小的固定相 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇

12、丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)4. 4. 選擇流動相時應留意的幾個問題選擇流動相時應留意的幾個問題1盡量運用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲添加。2防止流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。3試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中堆積。4流動一樣時還應滿足檢測器的要求。當運用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。第十章第十章液相色譜分析法液相色譜分析法一、影響分別的要素一、影響分別的要素factors

13、influenced factors influenced separationseparation二、分別類型的選擇二、分別類型的選擇choice of separation choice of separation typestypes三、液相色譜的運用三、液相色譜的運用application of HPLCapplication of HPLC四、液相制備色譜四、液相制備色譜preparative liquid preparative liquid chromatographychromatography第四節(jié)第四節(jié)影響分別的要素與操影響分別的要素與操作條件的選擇作條件的選擇high p

14、erformance liquid chromatograph factors influenced separation and choice of operation condition一、影響分別的要素一、影響分別的要素 factors influenced separation factors influenced separation1. 1. 影響分別的要素與提高柱效的途徑影響分別的要素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中在高效液相色譜中, , 液體的分散系數(shù)液體的分散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，那么速率方程中的分僅為氣體的萬分之一，那么速率方程中的分子分散項子分散項B/UB/U較小，可

15、以忽略不計，即：較小，可以忽略不計，即： H = A + C u H = A + C u 故液相色譜故液相色譜H-uH-u曲線與氣相色譜的外形不曲線與氣相色譜的外形不同，如下圖。同，如下圖。 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不能夠經(jīng)過液相色譜中，不能夠經(jīng)過添加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫添加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改動淋洗液組成、極性是改動淋洗液組成、極性是改善分別的最直接的要素。改善分

16、別的最直接的要素。 2. 2.流速流速 流速大于流速大于0.5 cm/s時時, Hu曲線是一段斜率不大的直線。曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。降低流速，柱效提高不是很大。但在實踐操作中，流量仍是一但在實踐操作中，流量仍是一個調(diào)整分別度和出峰時間的重個調(diào)整分別度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。要可選擇參數(shù)。 3.固定相及分別柱固定相及分別柱 氣相色譜中的固定液原那么上都可以用于液相色譜，氣相色譜中的固定液原那么上都可以用于液相色譜，其選用原那么與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分其選用原那么與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分別柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的任務，普通很少自

17、行別柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的任務，普通很少自行制備。制備。二、分別類型選擇二、分別類型選擇 choice of separation types三、三、 HPLC的運用的運用 application of HPLC 1. 環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：正己烷流動相：正己烷 流流 速：速：1.5 mL/min 色譜柱：色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑內(nèi)徑) 檢測器：差示折光檢測器檢測器：差示折光檢測器 可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進展分析。2. 2. 稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴的分析 稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。稠

18、環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：流動相：20%甲醇甲醇-水水 100%甲醇甲醇 線性梯度淋洗，線性梯度淋洗，2%/min 流流 速：速：1mL/min 柱柱 溫：溫：50 C 柱柱 壓：壓：70 104 Pa 檢測器：紫外檢測器檢測器：紫外檢測器四、制備型液相色譜四、制備型液相色譜 preparative liquid chromatography 獲得高純物質(zhì)色譜純的有效方法。獲得高純物質(zhì)色譜純的有效方法。 半制備柱內(nèi)徑半制備柱內(nèi)徑8mm，長度，長度15 30cm，一次制備量，一次制備量.1mg；1.1.色譜柱的柱容量柱負荷色譜柱的柱容

19、量柱負荷 對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量；對分析柱：不影響柱效時的最大進樣量； 對制備柱：不影響搜集物純度時的最大進樣對制備柱：不影響搜集物純度時的最大進樣量；量； 超載：進樣量超越柱容量。柱效迅速下降，超載：進樣量超越柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子量因子k k降低降低10%10%為宜。為宜。2. 2. 液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法搜集組分時，通常有以下情況： 1可獲得良好分別，主峰 運用制備柱，超載提高效率； 2兩主成分之間的小組分； 超載，分別切分使待分別組分成為主成分富集后，再次分別制

20、備。 3. 3. 制備型液相色譜制備型液相色譜 制備型液相色譜：構(gòu)造與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后餾分搜集器。 制備柱：內(nèi)徑2050mm，柱長50cm。習題習題 9. 用長用長15cm 的的ODS 柱分別二個組分，知在柱分別二個組分，知在實驗條件下柱效實驗條件下柱效n = 2.84 104m-1。用苯磺酸鈉。用苯磺酸鈉溶液測得死時間溶液測得死時間tM=1.31min，二個組分的保管，二個組分的保管時間分別為時間分別為tR1= 4.10min 及及 tR2= 4.38min 。1求求k1，k2， ，R。2假設添加柱長至假設添加柱長至30cm，分別度可否到達分別度可否到達1.5？解：解：68. 2134. 234. 210. 1110. 141084. 211410. 131. 110. 431. 138. 434. 231. 131. 138. 413. 231. 131. 110. 4422R21MMMR12kknRttkktttttkRR(2)知知80. 368. 21530cm30cm15?1112212122121RllRllRRllRR習題習題 10. 在某一柱上分別一樣品，得以下數(shù)據(jù)。在某一柱上分別一樣品，得以下數(shù)據(jù)。組分組分A、B 及非滯留組分及非滯留組