1、復(fù)制起始模型建立復(fù)制起始的概念病毒原核生物：大腸桿菌真核生物復(fù)制起始在細(xì)胞周期的調(diào)控DNA復(fù)制的引發(fā) 復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開(kāi)始的，這一富含AT的部位叫做復(fù)制起始點(diǎn)(originof replication)常用ori或O表示。DNA復(fù)制起始原核生物染色體、病毒和核外DNA通常只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。真核生物染色體有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，彼此相隔約3-10萬(wàn)bp。DNA復(fù)制起始至少需以下三個(gè)步驟:起始蛋白識(shí)別一個(gè)或一個(gè)以上的順式作用元件 DNA雙鏈局部解旋 選擇適宜位點(diǎn)進(jìn)行引物合成及開(kāi)始聚合反應(yīng)一、病毒SV40 的復(fù)制起始1、T抗原與起始核心序列特異結(jié)合2、Pola-primase復(fù)合物的亞單位 在

2、RP-A存在及ATP水解條件下,T抗原具有解旋酶活性使DNA出現(xiàn)更大范圍解鏈.起始效率與DNA構(gòu)象變化成正相關(guān)。 Pola-primase復(fù)合物含四個(gè)亞位:p180、p86、p58、p48二、原核生物的復(fù)制起始 大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)為oriC，由245個(gè)堿基對(duì)組成，這些序列在多數(shù)細(xì)菌中高度保守，關(guān)鍵序列是3個(gè)13bp和4個(gè)bpd的重復(fù)序列參與復(fù)制起始的9個(gè)蛋白和酶蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)亞基數(shù)目亞基數(shù)目功能功能Dna A1識(shí)別起點(diǎn)序列，在起點(diǎn)特異性位置解開(kāi)雙鏈Dna B6解開(kāi)DNA雙鏈Dna C6幫助Dna B結(jié)合于起點(diǎn)HU2類組蛋白，DNA結(jié)合蛋白，促進(jìn)起始引物合成酶（Dna G）1合成RNA引物單鏈結(jié)合

3、蛋白（SSB）4結(jié)合DNA單鏈RNA聚合酶5促進(jìn)DnaA活性DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓?fù)涿福?釋放DNA解鏈過(guò)程中產(chǎn)生的曲張力Dam甲基化酶1使起點(diǎn)GATC序列的腺嘌呤甲基化復(fù)制起始的過(guò)程 因?yàn)镈NA聚合酶只能延長(zhǎng)而不能開(kāi)始新鏈合成，所以DnaB蛋白活化引物合成酶，先合成一小段以RNA為起始的引物（10-15bp），并最終被切除并由DNA取代。 復(fù)制時(shí)，在原點(diǎn)通過(guò)解旋、解鏈和SSB蛋白結(jié)合等過(guò)程，這個(gè)復(fù)制點(diǎn)因形狀象叉子，稱復(fù)制叉。三、真核細(xì)胞的DNA復(fù)制起始復(fù)制器的選擇：G1期A區(qū)主要由11bp的ARS共有序列(ACS)5(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)3組成,為復(fù)制起始所必需.B

4、區(qū)由2一3個(gè)部分重復(fù)的亞區(qū)(B1,B2等)組成，位于A區(qū)3端,不具遺傳保守性.復(fù)制起始位點(diǎn)的激活：S期起始識(shí)別復(fù)合物(ORC)以ATP依賴的方式特異識(shí)別ACS區(qū)和B1區(qū)并與之結(jié)合.復(fù)制器的選擇（G1）ORC識(shí)別并結(jié)合復(fù)制器募集解旋酶裝載器（Cdc6和Cdt1）ORC和裝載器募集解旋酶（Mcm 2-7復(fù)合體）最終形成前復(fù)制復(fù)合體（pre-RC)復(fù)制起始位點(diǎn)的激活（S）Cdk和Dbf4磷酸化pre-RC，促使DNA解旋DNA聚合酶和輔助因子與復(fù)制起始位點(diǎn)的結(jié)合，并合成RNA引物裝載滑動(dòng)夾，聚合酶切換，開(kāi)始合成前導(dǎo)鏈 后隨鏈模板足夠長(zhǎng)時(shí)啟動(dòng)后隨鏈的合成釀酒酵母的起始識(shí)別復(fù)合物(ORC)是一種復(fù)雜的蛋

5、白質(zhì)由六種不同的亞基-orc1，orc2，orc3，orc4，orc5，orc6構(gòu)成。ORC1和ORC5亞基含有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與ATP結(jié)合，但只有ORC1水解ATPOrc125這五個(gè)亞基與DNA接觸并負(fù)責(zé)結(jié)合A區(qū)，Orc6一直不與DNA接觸ScORC與起始位點(diǎn)結(jié)合貫穿整個(gè)細(xì)胞周期起始識(shí)別復(fù)合物在釀酒酵母中最早確定裂殖酵母的復(fù)制起始是完全不同于釀酒酵母 裂殖酵母的復(fù)制起始有一個(gè)大小為5001500 bp的序列，是釀酒酵母的510倍。 裂殖酵母起始區(qū)缺乏一個(gè)明顯的共識(shí)序列，但它們包含兩個(gè)或更多的重要序列，些非常重要的富含A-T的序列經(jīng)常是不對(duì)稱的，A在一條鏈，T在另一條鏈，這是ars3001

6、， ars3002，和ars2004起始區(qū)基因缺失造成的。 裂殖酵母的起始區(qū)也有ARS活動(dòng)，使含一個(gè)起始區(qū)的質(zhì)?？稍谄渲斜３址€(wěn)定并復(fù)制。 裂殖酵母中有5001000強(qiáng)弱不一的復(fù)制起始點(diǎn)，分布在三條染色體上。 裂殖酵母ORC（sporc）有一個(gè)額外的域位于其N-末端的orc4亞基中部，這一區(qū)域包含9個(gè)AT鉤，用于結(jié)合非對(duì)稱的AT序列。 每一個(gè)裂殖酵母有兩個(gè)或兩個(gè)以上的ORC結(jié)合位點(diǎn)，sporc不與它的同源起始區(qū)隨機(jī)結(jié)合。 9個(gè)sporc4的AT鉤將sporc完全綁定到那些非常重要的AT豐富而不對(duì)稱的DNA序列。sporc和DNA之間的相互作用不需要ATP除了基本的ORC結(jié)合位點(diǎn)，裂殖酵母的起始區(qū)

7、包含另一種重要位點(diǎn)，是SAP1蛋白結(jié)合位點(diǎn)。SAP1最初被確定為是一個(gè)蛋白被綁定到一個(gè)序列的交配型開(kāi)關(guān)，在復(fù)制叉穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要的作用。SAP1結(jié)合在裂殖酵母ars3001一個(gè)重要區(qū)域，綁定到一個(gè)序列（A / T）4N（C /g）（A / T）1011（C / G）（A / T）4N。像ORC一樣，在起始區(qū)可能有多個(gè)親和力不同的SAP1結(jié)合位點(diǎn)。復(fù)制起始在細(xì)胞周期的調(diào)控DNA復(fù)制起始在細(xì)胞周期中存在兩個(gè)調(diào)控點(diǎn)M/G1過(guò)渡時(shí)建立復(fù)制前染色質(zhì)狀態(tài)G1/S過(guò)渡時(shí)參與復(fù)制起始的蛋白質(zhì)因子接受周期依賴的調(diào)節(jié),直接引發(fā)DNA合成.(復(fù)制起始復(fù)合體組裝)復(fù)制前染色質(zhì)狀態(tài)相關(guān)因子：微小染色體維持基因家族MC

8、M和CDC6、周期蛋白及其依賴的激酶。酵母體系中,M-S期核內(nèi)的MCM5/CDC46作用于復(fù)制起始點(diǎn),與ORC、ARS相互作用.CDC6的表達(dá)在M/G,期達(dá)到高峰,它在細(xì)胞周期的早期與ORC相互作用,提高起始點(diǎn)活性.哺乳類細(xì)胞中,在整個(gè)間期MCM基因產(chǎn)物都存在于核內(nèi),但它的G1期磷酸化水平與G2期明顯不同.MCM突變株ARS活性降低,復(fù)制難以起始. 在芽殖酵母中，ORC作為加載墊將Cdc6聚集在G1期的早期。 然后，ORC和CDC6一起激活CDT1MCM形成前復(fù)制復(fù)合體。 MCM加載出現(xiàn)重復(fù)，意味著每個(gè)起始點(diǎn)都裝上了幾個(gè)MCM分子，作為復(fù)制叉出現(xiàn)損傷或障礙時(shí)的備份，以順利完成復(fù)制。 MCM加載

9、到DNA不再需要ORC和CDC6輔助的輔助。 在裂殖酵母，前復(fù)制復(fù)合體也需要ORC，Cdc18、CDT1、MCM和一個(gè)必不可少的額外蛋白SAP1。 ORC和SAP1共同作用才能激活CDT1 SAP1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的復(fù)制起始蛋白直接參與前復(fù)制復(fù)合物組裝，參與pre-RCs對(duì)Cdc18的加載。Cdt1和Cdc18加載到起始區(qū)后，這兩種蛋白質(zhì)共同負(fù)載MCM，與起始區(qū)結(jié)合完成前復(fù)制復(fù)合物的組裝。CDKs可防止重復(fù)復(fù)制：協(xié)調(diào)復(fù)制和細(xì)胞周期.1、防止復(fù)制蛋白在G2期與復(fù)制起始點(diǎn)結(jié)合；2、CDK活性增高使細(xì)胞進(jìn)人S期： S期的高濃度CDK將抑制蛋白因子在起始點(diǎn)的繼續(xù)組裝.這樣,當(dāng)在M/G1期組裝于起始點(diǎn)的起始

10、復(fù)合物經(jīng)復(fù)制被破壞后,細(xì)胞在S、G2期不能重新組裝起始復(fù)合物.因而從M期到Gl期限制點(diǎn)這段時(shí)期內(nèi),由于原有周期蛋白降解,新的周期蛋白還未合成,CDKS活性較低有利于復(fù)制前狀態(tài)的建立和維持.周期蛋白及其依賴的激酶CDK的調(diào)解作用DNA復(fù)制起始的引發(fā) 酵母體系在生長(zhǎng)因子等刺激下,G1期周期蛋白1、2和3活躍表達(dá)和積累，使細(xì)胞得以通過(guò)起始點(diǎn)（START）.起始點(diǎn)與S期間有兩點(diǎn)聯(lián)系:1、B型周期蛋白5和6依賴起始點(diǎn)的表達(dá).它們可與周期蛋白依賴的激酶CDC28,CDK抑制因子P40形成復(fù)合物.2、該復(fù)合物被依賴起始點(diǎn)的P40降解激活.CDC28可使RP-A、CDC7等磷酸化.CDC7活化后在晚G1期磷酸化，調(diào)節(jié)ORC、MCM或其他蛋白質(zhì),激活DNA復(fù)制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不止一種CDC(CDK)和周期蛋白參與這一過(guò)程 G0期哺乳類細(xì)胞受生長(zhǎng)因子刺激后,周期蛋白D出現(xiàn)早于周期蛋白E.周期蛋白D和它的mRNA不穩(wěn)定.去除生長(zhǎng)因子后,水平迅速下降.周期蛋白D可與CDK2、CDK4、CDK5結(jié)合,在細(xì)胞周期內(nèi)發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用:a.刺激Gl期進(jìn)行.b.確保DNA不提前復(fù)制. 周期蛋白E的水平在G1/s過(guò)渡期最高.周期蛋白E可以結(jié)合并磷酸