1、第四講第四講 電泳主要內(nèi)容主要內(nèi)容l基本概念l凝膠電泳l篩分l等點聚焦l2DEl印漬分析EqF荷電粒子在電場中受力荷電粒子在溶液中勻速運動受到溶液阻力vfF動力和阻力相等，因此有如下關(guān)系fEqv電場靜電力介質(zhì)阻力運動方向 不同荷電粒子在溶液介質(zhì)中的運動阻力不同。例如對于球形荷電粒子電阻力系數(shù)為：rf6rEqv6核酸和蛋白等生物大分子分子量差別大，但是淌度區(qū)別不大！電泳淌度的定義單位場強下電泳速度Erq6球形荷電粒子的電泳淌度可表示為Fii/淌度和電導(dǎo)的關(guān)系iiiak電阻率與電導(dǎo)率1k電泳 給定介質(zhì)和電場條件下帶電粒子發(fā)生運動的現(xiàn)象；帶電粒子的電泳運動能力用電泳淌度（矢量）表征 電泳淌度的符號規(guī)

2、定：運動運動方向與電場強度相同為正；電泳運動方向與電場強度相反為負(fù)。SignalTimeKNaLii / cm2/s VLi + 4.0110-4Na +5.1910-4K +7.6110-4電泳技術(shù)的發(fā)展l1908, Russian scientist Pence, Electrophoresis (1903, Russian, Tswett, Chromatography)l1937, Sweden scientist Tiselius, first practical use of electrophoresis, 5 species were separated from HAS; a

3、nd won Nobel Prize in 1948, moving boundry electrophoresis （移動界面電泳）l1959, Raymond and Weintraub, slab gel electrophoresis （平板凝膠電泳）（平板凝膠電泳）l1981, Jorgenson and Lukas, capillary electrophoresisl1990，Manz, Lab on a chip, chip electrophoresis電泳技術(shù)的演化界面移動電泳 free solution in large tube 平板電泳gel support medi

4、a on plate 毛細(xì)管電泳free solution in capillary 毛細(xì)管凝膠電泳 gel in capillary 自由流電泳 continuous sampling while electrophoresis凝膠電泳在抗對流和離子導(dǎo)電的具有一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠介質(zhì)中進行的電泳分離技術(shù)，主要用于帶電生物大分子的分離。凝膠介質(zhì)的作用 對大分子的尺度篩分作用介質(zhì)的抗對流作用凝膠電泳篩分介質(zhì)l瓊脂糖凝膠l制膠簡單，分離度不高；加熱溶解，室溫下成膠l聚丙烯酰胺l需要從單體合成制備；分離度較高Ogston ModelRepatation（爬行） Model聚丙烯酰胺Polyacryla

5、mide,PAT單體和交聯(lián)劑的百分濃度C交聯(lián)劑的量a 丙烯酰胺量（g）b甲叉雙丙烯酰胺的量（g）m緩沖溶液的體積（ml）%100%100babCmbaT引發(fā)劑、增速劑和聚合引發(fā)劑、增速劑和聚合l引發(fā)劑：過硫酸胺、過硫酸鉀或核黃素l增速劑：N,N,N,N-四甲基乙二胺l聚合：自由基反應(yīng)（氧化、還原過程）。通常聚合過程在40-60 min內(nèi)完成。在20-35 C時聚合，凝膠會比較透明而有彈性。典型應(yīng)用l瓊脂糖凝膠電泳分離DNA l聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)l等電聚焦電泳分離l二維電泳蛋白分離（2DE PAGE）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸l核酸帶負(fù)電核線性分子，在電場的作用下向正極移動。由于凝膠的篩分

6、作用按分子的大小分開，小的分子運動速度較快。分子量相同但構(gòu)型不同的DNA分子也可以分離。l影響分離的主要因素有：分子量大小，凝膠濃度，電場強度，緩沖溶液等。l60制膠（中有熒光染料，EB）；點樣孔在負(fù)極端l電壓100 V以內(nèi)，時間通常半小時以上l借助有色染料掌握停止進行電泳的時間；l用熒光顯色和成像的方法記錄分離結(jié)果瓊脂糖凝膠濃度分離范圍（kb）0.35600.61200.90.8101.00.5-71.20.461.50.232.00.12膠的濃度與適宜的核酸堿基對范圍1 2 3 4 5 6點樣孔參考染料帶目標(biāo)組分電泳負(fù)極電泳正極泳道參考組分遷移距離組分遷移距離相對遷移率 PCR芯片DNA擴

7、增、檢測 PCR混合液加入芯片反應(yīng)池吸取PCR擴增液4保存設(shè)置程序進行PCR擴增加入石蠟油 預(yù)變性：95 300s95 30s55 45s 72 60s延伸：72 300s30個循環(huán)MCK-CK+PCR-Chip10l 反應(yīng)體系200 bp的 lambda DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）l除了分離介質(zhì)不同，原理與瓊脂糖凝膠電泳相同l根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。l連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電組分在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)進行分離。l不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電組分在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)

8、，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。SDS-PAGE蛋白篩分的原理lSDS （十二烷基磺酸鈉）斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)；強還原劑使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，從而使蛋白變性。l變性蛋白質(zhì)與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，分子絡(luò)合物在凝膠中的遷移速度取決于分子大小。l分子量在15-200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=k-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。l將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行

9、電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。SDS電泳的主要影響因素：溶液中SDS單體的濃度，當(dāng)其濃度大于1 mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4；如果單休濃度降到0.5 mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為1: 0.4這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別.樣品緩沖液的離子強度較低，通常是10100 mmol/L二硫鍵是否完全被還原有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。1. 已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS-PAGE測定分子量。

10、如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌動蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制劑 MW=20,100 雞蛋清溶菌酶 MW=14,400 開封后溶于200l蒸餾水，置-20保存，使用前室溫融化，沸水浴中加熱3-5分鐘后上樣。蛋白質(zhì)樣品在 100C 時用 SDS 和 DTT 處理 3-5 min 后解聚成亞基并形成膠束（短軸約為18）凝膠濃度與分子量測定的關(guān)系凝膠濃度與分子量測定的關(guān)系凝膠濃度T%(C=2.6%)分子量

11、范圍(kDa)凝膠濃度T%(C=5%)分子量范圍(kDa)525-200560-1701010-701020-10015501510-502040205-40連續(xù)電泳和不連續(xù)電泳 連續(xù)電泳：相同孔徑的凝膠和相同緩沖體系的樣品緩沖液、凝膠緩沖液和電極緩沖液及pH值恒定。 不連續(xù)電泳：不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳。樣品在分離膠和濃縮膠的界面上先濃縮成一窄帶。由于不同孔徑凝膠的分子篩作用，使不連續(xù)電泳的分辨率大大高于連續(xù)電泳。等電聚焦分離Isoelectrofocusing,IEF）l等電聚焦技術(shù)是60年代發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)分離分析手段l根據(jù)蛋白質(zhì)或其它兩性分子等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)

12、變化的pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離。l不同蛋白質(zhì)具有不同等電點，根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的區(qū)域，成為一個窄而穩(wěn)定的帶，從而起到濃縮和分離作用。等電聚焦的分辨率 等電聚焦分離的程度取決于pH梯度和電場強度。用測定兩個鄰近帶的pI差即(pI)來表示分辨率。 D為蛋白質(zhì)的擴散系數(shù)，E為場強，dpH/dx為pH梯度，d/dpH為蛋白質(zhì)的遷移率的斜率。只有通過提高場強和使用窄pH范圍來提高分辨率。pHddEdxpHdDpI/3固相pH梯度等電聚焦Immoblized pH gradients（IPG） IEFl固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種新型等電聚焦技術(shù)。利用一系列

13、具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價聚合，從而形成固定的、不隨環(huán)境電場等條件變化的pH梯度。l此法與傳統(tǒng)兩性電解質(zhì)等電聚焦相比，具有分辨率更高、上樣量更大等優(yōu)點。分辨率可達(dá)0.001pH, 是目前分辨率最高的電泳方法。l可用于蛋白質(zhì)和多肽的分析、制備。固相pH梯度丙烯酰胺凝膠基質(zhì)中的緩沖基團pH 梯度范圍的選擇l使用寬pH范圍的膠條（pH 3-10）可以在同一塊凝膠上看到樣品中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)。l可選用非線性梯度的膠條，這種膠條將兩端的pH梯度壓得很窄，卻可以使中間區(qū)域的蛋白質(zhì)得到較好的分離。l將有重疊區(qū)域的窄pH梯度的膠條聯(lián)合使用，也同樣可以得到整個pH 3-1

14、0范圍的結(jié)果，且可以檢測出樣品中更多的（相對于非線性膠）蛋白質(zhì)斑點。用于IEF分離的固定pH梯度膠條Cathode+_Strip holderRehydration bufferIPG stripParafin oilCoveranode其它IEF電泳分離方式IEF還可以這樣作！等電聚焦過程示意圖2DE 雙向電泳-可分離數(shù)千個蛋白l第一維：IEF，依據(jù)等電點進行分離l第二維：SDS-PAGE，依據(jù)分子量進行分離IEFBig smallSDS-PAGEpH 3 102DE 的基本步驟l樣品制備lIEFlSDS buffer 平衡lSDS-PAGEl凝膠染色l掃描成像IEF分離后IPG膠條在SDS

15、溶液中平衡l溶解蛋白并還原二硫鍵 (urea,SDS,Tris-HCl,glycerol; and DTT)l游離的-SH 基團的烷基化保護 (urea,SDS,Tris-HCl,glycerol; and iodoacetamide)原生蛋白，native protein變性蛋白，denatured protein聚丙烯酰胺膠 IPG 膠條IPG膠條和丙烯酰胺凝膠之間不能有氣泡！可借助瓊脂糖進行結(jié)合。SDS-PAGE中的電場方向？2DE 原理2DE 分離染色掃描圖中國人健康肝臟2DE蛋白質(zhì)表達(dá)譜4.598k100kMWpH54815481個蛋白質(zhì)點個蛋白質(zhì)點凝膠中蛋白質(zhì)的檢測l如果要檢測低豐

16、度的蛋白質(zhì)（例如，細(xì)胞內(nèi)低拷貝數(shù)蛋白質(zhì)，或是蛋白純化過程中的雜質(zhì)檢測），就需要加大蛋白質(zhì)的上樣量（0.1-1mg/ml），同時采用高靈敏度的染色，比如銀染或是熒光染色。l如果是要制備足夠的樣品作為抗原或用來測序，也需要加大蛋白質(zhì)上樣量，同時要選用的染色方法不會將蛋白質(zhì)固定在凝膠中。l若需進行蛋白質(zhì)含量的比較，需選用檢測線性范圍大的染料。 理想的染色方法應(yīng)具備如下特點：靈敏度高線性范圍寬方便費用少與成像設(shè)備匹配考馬斯亮蘭染色 銀染 熒光染色目前還沒有通用的染色方法!選用蛋白染料時應(yīng)考慮：染料必須與蛋白質(zhì)亞基大分子結(jié)合形成不溶性有色復(fù)合物，但如該蛋白質(zhì)點需進行后續(xù)鑒定則應(yīng)考慮該復(fù)合物不結(jié)合到凝膠中

17、和凝膠支持膜上。 吸附在凝膠上的染料必須容易溶解在對大分子無影響的溶劑中，以利于凝膠背景的脫色 選用高吸光系數(shù)的染料以提高檢測靈敏度 選用能與大分子反應(yīng)專一性結(jié)合的染料,以提高檢測的專一性考馬斯亮蘭染色lCoomassie Brilliant Blue (CBB)R-250是聚丙烯酰胺凝膠中檢測蛋白質(zhì)最常用的染料,系羊毛染料，可以用來對凝膠中的蛋白質(zhì)進行染色。其中“R” 代表紅藍(lán)色。“G”代表藍(lán)綠色、lCBB R-250檢測的靈敏度約為40 ng。染色的絕對靈敏度和線性范圍與蛋白種類相關(guān)。這種染色溶液會將絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)固定在凝膠上。膠體考染步驟固定：12（w/v）三氯醋酸（TCA） 2h染色

18、：200 ml染色液 （染色液：在490ml含2（w/v）的H3PO4中加50g(NH4)2SO4直至完全溶解，再加0.5g CBB G-250（已溶于10mlH2O中），攪拌混合。）混合50 ml甲醇16-24h 漂洗： 1）0.1 mol/L Tris-H3PO4緩沖液（pH6.5）漂洗兩分鐘； 2）25（v/v）甲醇漂洗不超過1 min穩(wěn)定：在20的(NH4)2SO4中穩(wěn)定蛋白質(zhì)染料復(fù)合物 現(xiàn)有染色方法中，該法所能染色的蛋白質(zhì)最多銀染色方法1、5%乙醇、5%乙酸固定過夜或40%乙醇、10%乙酸固定1個小時2、用水漂洗40分鐘，其間至少換水3次。3、*5%戊二醛固定1個小時。4、用水漂洗2

19、-3小時，其間至少換水4次。5、在持續(xù)溫和振搖下，用銀氨溶液染色30分鐘。6、水洗3次，每次3-5分鐘7、用顯影液顯色。銀染的斑點一般在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)，否則更換顯影液。如果背景已開始變?yōu)榈S色，則應(yīng)該終止反應(yīng)。8、加入5%乙酸終止反應(yīng)。9. 在水中漂洗凝膠至少1小時，換水三次?？梢詫⒛z保存于水中。pH 3-10, 18 cm strip, 12 % gel, 100 g protein, Ag stain控制樣-來自楊芃元，復(fù)旦大學(xué)病理樣熒光染色熒光染色 與蛋白結(jié)合的熒光物質(zhì)或與蛋白質(zhì)結(jié)合后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)均可用于蛋白質(zhì)熒光檢測。 熒光探針方法有兩種形式：電泳前預(yù)標(biāo)記和電泳完成后再標(biāo)記。 利用

20、熒光標(biāo)記可取得亞ng級的檢出能力（價格?。┎钍灸z電泳Differential Gel Electrophoresis (DIGE) Protein extract 1Label with fluor 1Protein extract 2Label with fluor 2Separate by 2DEMix labeled extractsImage gelExcitation Wavelength 1Excitation wavelength 2Image analysis:Data quantification Image analysis: Overlay images Analysi

21、s of difference2DE蛋白分離中的問題pH 梯度的形成方法低拷貝數(shù)蛋白的檢測限上樣量疏水性蛋白1. 超高和低分子量蛋白l印跡法（blotting）是指將電泳分離的樣品帶轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的選擇性探測反應(yīng)來檢測樣品中某目標(biāo)組分的一種方法。l1975年，Southern建立了將凝膠電泳分離后的DNA譜帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。l而后人們用類似的方法對其它生物分子進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法印漬分析（blo