1、深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 公司在首家通過國際公司在首家通過國際ISO14001環(huán)境論證的環(huán)境論證的深圳高新技術(shù)園區(qū)內(nèi)擁有近深圳高新技術(shù)園區(qū)內(nèi)擁有近2000m2的的GMP標標準準生產(chǎn)廠房，其中包括嚴格按生產(chǎn)廠房，其中包括嚴格按GMP要求建立的要求建立的450m2的潔凈車間及其他輔助車間，是目前國的潔凈車間及其他輔助車間，是目前國內(nèi)第一家通過體外診斷試劑內(nèi)第一家通過體外診斷試劑GMP認證的廠家。認證的廠家。GMP深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有

2、限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部新新藥藥試試生生產(chǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)正正式式生生產(chǎn)產(chǎn)批批件件乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴增（核酸擴增（PCR）熒光熒光定量定量檢測檢測 試劑盒試劑盒國藥準字國藥準字S20020033深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR-DNA體外復(fù)制體外復(fù)制深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR的特點的特點 高靈敏度 高特異性 簡便快捷深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光基團通常各自擁有

3、單一的光吸收峰。在光的刺激下，熒光基團吸收光的能量后通常以三種方式釋放出能量：1) 光能 許多熒光基團吸收光能后仍舊以光能形式釋放能量，并且發(fā)射光的峰值大于吸收峰。2) 熱能 某些熒光基團吸收光能后，能量轉(zhuǎn)換為熱量擴散到環(huán)境中，如 Dabcyl。3)轉(zhuǎn)移給臨近的分子 當 臨近 的 分子 滿 足發(fā) 生 能量轉(zhuǎn)移的要求時，能量從熒光基團傳遞到臨近的分子。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 熒光染料直接結(jié)合擴增產(chǎn)物熒光染料直接結(jié)合擴增產(chǎn)物SYBR green ISYBR green I特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號特異性結(jié)合雙鏈，釋放熒光信號 熒光標記引物熒光標記引物 特異性熒光探針特異性熒光探針

4、TaqmanTaqman雙熒光標記探針雙熒光標記探針molecular Beaconmolecular Beacon熒光標記探針熒光標記探針熒光標記雜交雙探針熒光標記雜交雙探針深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 特異性熒光特異性熒光雙標記探針雙標記探針 Taq酶酶 5353外外切酶活性切酶活性深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部1x108 拷貝拷貝/ml1x107 拷貝拷貝/ml1x106 拷貝拷貝/ml1x105 拷貝拷貝/ml1x10

5、4 拷貝拷貝/ml深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部定量原理和方法定量原理和方法 原理原理：每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。 外標法外標法：將幾個已知拷貝數(shù)的純化的目的基因標準品進行FQ-PCR擴增，繪制熒光定量標準曲線。 內(nèi)標法內(nèi)標法：將已知濃度的內(nèi)標基因加到各標本中，與標本一起經(jīng)歷核酸提取、加樣、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增及信號檢測的全過程，比較內(nèi)標最后的實測值與已知值，以檢驗標本中是否存在抑制PCR的因素，也可對樣品的拷貝數(shù)加以校正。 深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光熒光PCR

6、PCR定量的原理定量的原理- -外標法外標法深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部標準曲線標準曲線定量定量深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部l靈敏度高靈敏度高l特異性強特異性強l全封閉全封閉PCRPCR過程，無需后處理過程，無需后處理l采用采用dUTPUNGdUTPUNG酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機會酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機會l即時反映擴增過程，摒棄終點數(shù)據(jù)，更適用于定量即時反映擴增過程，摒棄終點數(shù)據(jù)，更適用于定量l定量范圍寬，可達到定量范圍寬，可達到1010個數(shù)量級，無須稀釋樣品個數(shù)量級，無須稀釋樣品l可

7、實現(xiàn)一管多檢可實現(xiàn)一管多檢l儀器自動分析，更快獲得結(jié)果儀器自動分析，更快獲得結(jié)果深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部競爭性熒光內(nèi)標競爭性熒光內(nèi)標(IC)定量定量PCR技術(shù)技術(shù)深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部Internal controlInternal control簡稱簡稱ICIC，通常是指與靶序列十分相，通常是指與靶序列十分相似的一段似的一段DNADNA序列，兩者在相同的條件下可被同一對引序列，兩者在相同的條件下可被同一對引物擴增，具有相同的擴增效率；區(qū)別在于兩者的探針物擴增，具有相同的擴增效率；區(qū)別在于兩者的探針結(jié)合區(qū)，可分別被不同序列的探針識別，通過探針的結(jié)合區(qū)，可分別被不同

8、序列的探針識別，通過探針的不同熒光標記實現(xiàn)區(qū)分。不同熒光標記實現(xiàn)區(qū)分。 監(jiān)控監(jiān)控PCRPCR反應(yīng)，避免樣本抑制物、反應(yīng)，避免樣本抑制物、DNADNA（RNARNA）提取過程）提取過程的丟失、誤操作等造成的假陰性結(jié)果；并對以上原因的丟失、誤操作等造成的假陰性結(jié)果；并對以上原因造成的定量誤差進行修正。造成的定量誤差進行修正。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光定量熒光定量PCR的臨床應(yīng)用的臨床應(yīng)用深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于臨床通常在免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng)，應(yīng)用于

9、臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后，而許多病原體的免疫學(xué)檢測存在較長的較長的“窗口期窗口期”，比如，比如HCVHCV的的“窗口期窗口期”平均長達平均長達7070天，不利于對疾病的早期診斷；天，不利于對疾病的早期診斷；PCRPCR方法直接檢測病原方法直接檢測病原體的體的DNA/RNADNA/RNA，能大大縮短，能大大縮短“窗口期窗口期”，其，其高靈敏度的高靈敏度的檢測檢測顯然也有利于疾病的早期診斷顯然也有利于疾病的早期診斷。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部HBV DNA與血清免疫學(xué)的關(guān)系HBV DNA HBV DNA 與與HBsAg/ HBsAbHBs

10、Ag/ HBsAb的關(guān)系的關(guān)系HBsAgHBsAg（+ +）HBV DNAHBV DNA（- -）：病毒基因的整合，此時只能表達HBsAg，而沒有DNA的復(fù)制；操作失誤；PCR試劑的靈敏度不夠。HBsAgHBsAg（- -）HBV DNAHBV DNA（+ +）：“窗口期”；HBsAg 的水平過低無法檢出，或者HBsAg確已消失但病毒仍處于低水平復(fù)制狀態(tài)；暴發(fā)性乙肝以合成HBcAg 為主，很少或不合成HBsAg；S區(qū)基因發(fā)生逃避免疫變異造成HBsAg陰性而HBV DNA陽性；血清亞型的漏檢；老年人HBsAg檢出率低于5%，HBsAbHBsAb（+ +）通常表示病毒已清除。但已有報道HBsAb出

11、現(xiàn)后血清內(nèi)仍有DNA復(fù)制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb與HBV DNA同時陽性，但通常HBV DNA檢出率逐步下降HBV DNA HBV DNA 與與HBeAg/ HBeAbHBeAg/ HBeAb的關(guān)系的關(guān)系HBeAg陽性與HBV DNA有顯著相關(guān)。HBeAg 陰轉(zhuǎn)往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。通常認為HBeAg轉(zhuǎn)陰繼而出現(xiàn)HBe抗體的轉(zhuǎn)化為乙型慢性肝炎好轉(zhuǎn)穩(wěn)定的標志。事實上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg陰轉(zhuǎn)并不意味著炎癥活動的停止。HBeAg陰性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表達為主，感染起始即為HBeAg陰性。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)

12、有限公司技術(shù)支持部深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部Lam et al - Hepatol 26: 226, 1997 對病毒感染的藥物治療中，免疫學(xué)指標的變化通常比對病毒感染的藥物治療中，免疫學(xué)指標的變化通常比較滯后出現(xiàn)，且受個體差異影響較大，從而對臨床判較滯后出現(xiàn)，且受個體差異影響較大，從而對臨床判斷難以及時提供直接證據(jù)；而熒光定量斷難以及時提供直接證據(jù)；而熒光定量PCRPCR檢測可直接檢測可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥物療效觀察提供直接依據(jù)，以供治療方案參考。同時物療效觀察提供直接依據(jù)，以供治療方案參考。同時對不同治

13、療時間的用藥劑量和用藥時間提供依據(jù)。對不同治療時間的用藥劑量和用藥時間提供依據(jù)。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 如如HBVHBV： 根據(jù)根據(jù)20002000年拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見年拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見，中國，中國慢性乙肝病人治療的主要目的就是降低血清慢性乙肝病人治療的主要目的就是降低血清HBV HBV DNADNA，誘導(dǎo)，誘導(dǎo)HBeAgHBeAg血清轉(zhuǎn)換等。血清轉(zhuǎn)換等。 HIV:HIV: 目前用于治療艾滋病的藥物中主要就是抗病毒類藥目前用于治療艾滋病的藥物中主要就是抗病毒類藥物，因此，物，因此，HIV RNAHIV RNA滴度的定量測定與抗滴度的定量測定與抗HIVHIV藥物藥物

14、治療及療效有著直接的關(guān)系。治療及療效有著直接的關(guān)系。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00治療前 治 療 后治療前 治 療 后病毒滴度( L g c opies/ml)乙型肝炎患者抗病毒藥物治療前后的乙型肝炎患者抗病毒藥物治療前后的HBVHBV滴度比較滴度比較深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部0-20-40-60-80-100治療周數(shù)拉米夫定安慰劑血清HBV DNA;中位%變化0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52n=192

15、n=404n=171n=359III期臨床研究的綜合數(shù)據(jù)深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 通過定量檢測病毒滴度可以間接評估受侵通過定量檢測病毒滴度可以間接評估受侵器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病變；長時間機體病毒高水平的患者尤其是慢變；長時間機體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預(yù)后不好。因此對病原體的定性病患者往往預(yù)后不好。因此對病原體的定量量PCR檢測對病情和預(yù)后評估均有參考意義。檢測對病情和預(yù)后評估均有參考意義。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 熒光熒光PCR可實現(xiàn)對點突變、缺失突變、插入突可實現(xiàn)對點突變、缺失突變、插入突變、多基

16、因突變等的檢測。對產(chǎn)前診斷具有其變、多基因突變等的檢測。對產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質(zhì)。高人口素質(zhì)。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 熒光PCRPCR可對病原體的母嬰傳播進行有效可對病原體的母嬰傳播進行有效的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺的監(jiān)控，為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等乳期感染等提供依據(jù)，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。提供參考。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部熒光熒光PCR的作用：的作用： 可對原癌基因的突變和易位等作出檢測?？蓪υ┗虻耐蛔兒鸵孜坏茸鞒鰴z測

17、。 可對原癌基因的可對原癌基因的mRNA進行定量分析。進行定量分析。 有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。 探索癌變發(fā)生機理的研究提供參考。探索癌變發(fā)生機理的研究提供參考。 區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應(yīng)。區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應(yīng)。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部結(jié)核病及性病等核酸檢測意義結(jié)核病及性病等核酸檢測意義 病原體的檢測在臨床上通常采用鏡檢、培養(yǎng)等方法。鏡檢法操作簡便，易造成假陽性結(jié)果，同時靈敏度較低。 培養(yǎng)方法要求高，耗時，不利于臨床上的及時診斷和用藥。 熒光PCR方法具高靈敏度，速度快。不能培養(yǎng)PCR是唯一確診手段（例如HPV）深

18、圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR污染及預(yù)防對策污染及預(yù)防對策 深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部污染原因 標本間交叉污染 PCR試劑的污染 PCR擴增產(chǎn)物污染 氣溶膠污染 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染 深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部污染的監(jiān)測 對照試驗 試劑空白對照陽性對照 陰性對照 重復(fù)性試驗 深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部PCR防污染措施實驗環(huán)境的控制實驗環(huán)境的控制PCR應(yīng)實行嚴格的分區(qū)操作：前準備區(qū)；樣本處理區(qū)，其中DNA和RNA的處理也應(yīng)該分開；擴增區(qū)。各區(qū)專區(qū)使用，并盡量使用一次性消耗品，高壓消毒，實驗器械和臺面均應(yīng)進行定期消毒等。2 2避免避免PCRPCR后

19、處理后處理熒光PCR不同于其他的PCR方法，無須對PCR擴增產(chǎn)物進行任何的檢測，實際就是對PCR污染的有力預(yù)防。3 3dUTPdUTP防污染系統(tǒng)防污染系統(tǒng)反應(yīng)體系中常規(guī)的dNTPS中的dTTP替換為dUTP，在擴增過程中dU取代dT的位置摻入到PCR產(chǎn)物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，發(fā)生U的糖苷鍵的水解，經(jīng)高溫處理后DNA鏈斷裂成碎片，從而無法成為下一輪的PCR的模板。深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部防止污染的方法 合理的分區(qū) 吸樣槍 預(yù)混和分裝PCR試劑 防止操作人員污染 設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司技術(shù)支持部 PCR前試劑前試劑準備區(qū)準備區(qū) PCR前樣前樣本