1、基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)1第1頁/共110頁一、限制性核酸內(nèi)切酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restriction endonuclease）第2頁/共110頁2. 性質(zhì)內(nèi)切酶。原核生物。即在核酸分子鏈的內(nèi)部制造切口的酶。自我保護(hù)作用。3. 功能細(xì)菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）1. 來源第3頁/共110頁限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。（1）限制（Restriction）第4頁/共110頁細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。（2）修飾（M

2、odification） Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基第5頁/共110頁 DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，是目前新的研究熱點(diǎn)之一。 甲基化檢測方法分為三類：l 基因組整體水平的甲基化檢測l 基因特異位點(diǎn)甲基化的檢測l 新甲基化位點(diǎn)的尋找。第6頁/共110頁 在人類基因組中,DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,它與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。 抑癌基因和DNA修復(fù)基因的高甲基化、重復(fù)序列DNA的低甲基化、某些基因的印

3、記丟失與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。 第7頁/共110頁MeDIP Sequencing（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing ）采用甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)，通過5-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發(fā)生甲基化的DNA片段，然后進(jìn)行高通量測序。研究人員可以利用MeDIP Sequencing快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。第8頁/共110頁第9頁/共110頁DpnIGATCCTAGCH3CH3(Chen et al. 2013)Robust one-tube -PCR str

4、ategy accelerates precise sequence modification ofplasmids for functional genomics第10頁/共110頁目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。二、限制性內(nèi)切酶的類型I 型限制性內(nèi)切酶 II 限制性內(nèi)切酶 III限制性內(nèi)切酶 第11頁/共110頁首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的。如 EcoB和 EcoK。是大型的多亞基蛋白復(fù)合物，由三種不同的亞基組成。既具有內(nèi)切酶的活性，又具有甲基化酶的活性。1. I型限制性內(nèi)切酶 （1）識別位點(diǎn)序列EcoB： TGA(N)8TG

5、CT EcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修飾的特異序列。第12頁/共110頁需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。（3）作用機(jī)理在距離特異性識別位點(diǎn)約10001500 bp處隨機(jī)切開一條單鏈。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位點(diǎn)第13頁/共110頁首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來。（1）識別位點(diǎn)序列未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。與DNA的來源無關(guān)。2. II限制性內(nèi)切酶 分離的第一個酶是Hind 第14頁/共110頁（2）切割位點(diǎn)切開雙鏈DNA。形成粘性末端（sticky e

6、nd）或平齊末端（blunt end）。如：識別位點(diǎn)處。第15頁/共110頁（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有幾個核苷酸單鏈的末端。分兩種類型： 5端凸出（如EcoR I切點(diǎn)）GAATTC CTTAAG5-33-5CTTAA GG AATTC5-33-5第16頁/共110頁CTGCAG 3端凸出（如Pst I切點(diǎn)）GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC第17頁/共110頁 連接便利（4）粘性末端的意義i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。這

7、比連接兩個平齊末端容易的多。第18頁/共110頁第19頁/共110頁 補(bǔ)平成平齊末端 5末端標(biāo)記凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。第20頁/共110頁識別位點(diǎn)的序列相同的限制性內(nèi)切酶。（5）同裂酶（Isoschizomers) 同序同切酶識別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。如Hind 和Hsu I。第21頁/共110頁識別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。如Xma I 和 Sma I。 同序異切酶 同功多位酶第22頁/共110頁識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等（6）同尾酶(Isocaudamers） 第2

8、3頁/共110頁 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來的酶識別。Sau 3A第24頁/共110頁在離它的不對稱識別位點(diǎn)一側(cè)的特定距離處切割DNA雙鏈。（7）s型限制性內(nèi)切酶移動切割（shifted cleavage):53第25頁/共110頁3. III限制性內(nèi)切酶 既具有內(nèi)切酶的活性，又具有甲基化酶的活性，在特異的位點(diǎn)切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。第26頁/共110頁核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性II內(nèi)切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶和甲內(nèi)切酶和甲基化酶分開基化酶分開異源三聚體異源三聚體同源二聚體同源二聚體異源二

9、聚體異源二聚體Mg2+回文序列回文序列（IIs型除外）型除外）第27頁/共110頁切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)距識別位點(diǎn)至距識別位點(diǎn)至少少1kp處隨機(jī)處隨機(jī)切割切割識別序列識別序列內(nèi)或附近內(nèi)或附近特異性切特異性切割割24-26bp處處序列特異的切割序列特異的切割 不是不是是是是是基因工程中的用基因工程中的用途途無用無用十分有用十分有用用途不大用途不大第28頁/共110頁獲得序列未完全清楚的核酸的一種引物設(shè)計方案，特點(diǎn)是所設(shè)計的引物序列某位置的核苷酸可以分別是兩個或兩個以上不同的堿基，結(jié)果所合成的引物是該位置上不同序列的混合物。簡并引物(degenerate primer)R=A/G，Y=C/T，M=A/C

10、，K=G/T，S=C/G，W= A/T，H= A/C/T，B= C/G/T，V=A/C/G， D=A/G /T, N=A/C/G/T 第29頁/共110頁1973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：三、限制性內(nèi)切酶的命名1. 用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。第30頁/共110頁2. 用一個右下標(biāo)的大寫字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。3. 如果一種特

11、殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoR I，EcoR V。第31頁/共110頁DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。1. DNA的純度 四、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素純化DNA加大酶的用量延長保溫時間 擴(kuò)大反應(yīng)體積（ 20l）一般采取第32頁/共110頁大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：2. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修飾GATC中的A）；dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株。第33頁/共110頁不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65

12、 oC。3. 溫度 第34頁/共110頁是影響限制酶活性的重要因素。4. 緩沖液(Buffer) （1）緩沖液的化學(xué)組成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強(qiáng)度；Tris-HCl： 維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。第35頁/共110頁（2）星號（*）活性第36頁/共110頁u對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切，但應(yīng)注意：BamHI SmaI第37頁/共110頁u對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法：使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量， 同時酶解低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切一種酶

13、先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切 0.1倍體積的 5 M NaAc pH 5.4 2.5倍體積的冰冷乙醇 -20 30分鐘、高速冷凍離心15分鐘、干燥第38頁/共110頁l 部分酶切應(yīng)采取的措施： l 完全酶切 限制酶識別序列為n個堿基，則其切割頻率的理論值應(yīng)是減少酶量 縮短反應(yīng)時間第39頁/共110頁物理作圖: 限制性作圖法（ restriction mapping ）:是通過比較不同限制性酶產(chǎn)生的DNA片段的大小，將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對位置上，構(gòu)建物理圖譜的方法。 EcoRIEcoRIEcoRIPstI 0.3 kb 1.1 kb 0.8 kb 2. 0kb 第40頁/共

14、110頁1. 現(xiàn)要將一個目的基因克隆到表達(dá)載體上, 目的基因通過設(shè)計基因特異的引物PCR擴(kuò)增得到, 如何設(shè)計酶切位點(diǎn)?(載體的多克隆位點(diǎn)有BamHI, HindIII)2.一長為4.2kb的DNA片段，分別用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化，電泳結(jié)果如下圖所示，請根據(jù)結(jié)果繪出該片段限制性圖譜。作業(yè):2.0kb0.8kb2.0kb1.9kb0.3kb2.8kb1.4kb1.1kb0.3kb第41頁/共110頁第二節(jié) DNA 連接酶一、DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)從細(xì)菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。DNA復(fù)制一定有斷口。第42頁/共110頁（

15、1）大腸桿菌連接酶1. 兩種DNA連接酶只能連接粘性末端。二、DNA ligase的特點(diǎn)（2）T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接齊平末端。第43頁/共110頁（1）必須是兩條雙鏈DNA。（2）DNA3端有游離的-OH， 5端有一個磷酸基團(tuán)（P）。（3）需要能量動物或噬菌體中：ATP大腸桿菌中： NAD+2. 連接條件第44頁/共110頁連接酶反應(yīng)的最佳溫度是37C。三、連接反應(yīng)的溫度1. 最佳溫度但在37下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定。2. 實(shí)用溫度所以一般采用 416 C。第45頁/共110頁增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。1. 插入片段與載體的濃度比例 2. 反

16、應(yīng)溫度12.5。四、影響連接反應(yīng)的因素310倍。一般1416第46頁/共110頁五、平頭雙鏈DNA片段的連接連接方法：（1）直接利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。（2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端分子加上同聚 物的尾巴之后，再用DNA連接酶進(jìn)行連接。第47頁/共110頁提高平頭末端連接效率的方法包括：第48頁/共110頁第三節(jié) DNA聚合酶一、基因工程中常用的DNA聚合酶1. 大腸桿菌DNA聚合酶2. Klenow fragment3. T4 DNA聚合酶4. T7 DNA聚合酶5. 修飾過的T7 DNA聚合酶6. 逆轉(zhuǎn)錄酶第49頁/共110頁1. 共同特點(diǎn)把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端。

17、2. 主要區(qū)別T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。二、常用的DNA聚合酶的特點(diǎn)持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。第50頁/共110頁高高3. 常用DNA聚合酶的特性比較第51頁/共110頁三、DNA聚合酶在基因工程中的用途l DNA聚合酶I (PolI)l DNA聚合酶II (PolII)l DNA聚合酶 III (PolIII)參與DNA的修復(fù)參與DNA的復(fù)制1. 大腸桿菌DNA聚合酶 第52頁/共110頁大腸桿菌DNA聚合酶 I主要用來制備帶放射性標(biāo)記的DNA探針。（1）大腸桿菌DNA聚合酶I

18、的性質(zhì)一條單鏈多肽。用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的部分。就成為Klenow fragment。第53頁/共110頁 底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） Mg2+ 帶有3OH游離端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反應(yīng)條件-OH53dNTPs第54頁/共110頁能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。（3）用DNA聚合酶I 制備探針標(biāo)記已知序列的核酸片斷顯示位置與互補(bǔ)的待測序列雜交第55頁/共110頁切口轉(zhuǎn)移法(nick translation )：a.放射性同位素標(biāo)記：DNA聚合酶 I 同時具備53外切酶活性和53的聚合酶

19、活性（以及35外切酶活性）。第56頁/共110頁53外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5端除去一個核苷酸后，聚合酶活性就會在切口的上一段DNA的3一側(cè)補(bǔ)上一個新的核苷酸。切口切口55335353第57頁/共110頁純化的DNA片斷DNase I 制造單鏈切口DNA Pol I 進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記第58頁/共110頁具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。（1）Klenow fragment的性質(zhì)DNA Pol I Klenow fragment (76KD）枯草桿

20、菌蛋白酶第59頁/共110頁 3端補(bǔ)平55klenow補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端。在3隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。klenow（2）主要用途第60頁/共110頁3隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種 -32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-GAATT33-CTTAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h第61頁/共110頁mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第

21、二鏈klenow533553引物第62頁/共110頁（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)3. T4 DNA聚合酶從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。由噬菌體基因43編碼。有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解單鏈更快）。 來源 酶活性第63頁/共110頁當(dāng)沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隱蔽端。如果只有一種dNTP，則降解到該dNTP互補(bǔ)的核苷酸的位置。第64頁/共110頁55335533T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs55第65頁/共110頁（2） T4 DNA聚合酶的用途標(biāo)記末端（取代合成法）用35外切酶活性作用于所有末端形式的

22、3端（平端、3隱蔽端、5隱蔽端）制造出3隱蔽端。再利用它的53聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的dNTP。 補(bǔ)平隱蔽末端 DNA 3末端標(biāo)記第66頁/共110頁酶切中間產(chǎn)生兩個末端標(biāo)記加入某種32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶（35外切）DNA酶切片斷T4 DNA聚合酶（53聚合）55335533553355335533內(nèi)切酶切無dNTPs第67頁/共110頁4. T7 DNA聚合酶（1）來源從T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來的，由兩個亞基組成： T7基因5編碼的大亞基：有53聚合酶和35外切酶活性。 大腸桿菌編碼的小亞基：硫氧還蛋白。增加大亞基對模板的親和性。第68頁/共11

23、0頁（2）T7 DNA聚合酶的特點(diǎn) 持續(xù)合成能力強(qiáng)一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補(bǔ)鏈。 35外切酶活性高單鏈和雙鏈都能降解。 不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙第69頁/共110頁 進(jìn)行末端標(biāo)記 以大分子量DNA為模板的合成如M13 補(bǔ)平隱蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途取代合成法標(biāo)記3末端。與T4 DNA聚合酶相同。合成補(bǔ)平3隱蔽末端；水解修平3突出末端。第70頁/共110頁5. 修飾后的T7 DNA聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。（2）修飾后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA測序雙脫氧法。 標(biāo)

24、記DNA 3隱蔽末端 更有效地補(bǔ)平末端第71頁/共110頁6. 逆轉(zhuǎn)錄酶最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。（1）來源RNA腫瘤病毒。（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組成。第72頁/共110頁 鏈有反轉(zhuǎn)錄活性和 RNaseH活性。RNaseH：鏈經(jīng)過蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以53或35方向特異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA第73頁/共110頁（3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途 鏈RNA-DNA雜交雙鏈中53DNA外切酶活性。 合成c

25、DNA以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。AAAAATTTTT53mRNA 5cDNA第74頁/共110頁可用隨機(jī)引物（random primer）、基因特異性引物或oligo dT做引物。隨機(jī)引物： 隨機(jī)順序形成的寡聚DNA片斷。（理論上它能與各種序列的模板結(jié)合） RT-PCR用的模板克隆某個基因時，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。第75頁/共110頁 核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸殘基之間的 磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。 其中專門水解斷裂RNA分子的叫核糖核酸酶（RNase）,而特異水解斷裂DNA分子的則叫脫氧核糖核酸酶（D

26、Nase）。第三節(jié) 核酸酶第76頁/共110頁 一類是從核酸分子的末端開始，一個核苷酸一個核苷酸地消化降解多核苷酸鏈，叫核酸外切酶（exonuclease）; 另一類是從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔研纬尚∑?，叫核酸?nèi)切酶（endonuclease）。第77頁/共110頁第78頁/共110頁第79頁/共110頁第80頁/共110頁第81頁/共110頁第82頁/共110頁第83頁/共110頁第84頁/共110頁第85頁/共110頁第五節(jié) DNA修飾酶一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1. 來源小牛胸腺。2. 組成大小兩個亞基。3. 特性 53DNA聚合酶活性（terminal transferase

27、）第86頁/共110頁 不需要模板！ 需要3OH、二甲胂酸緩沖液。 底物可以是單鏈DNA、 是3OH突出的雙鏈DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 隨機(jī)添加的dNTPs。 如果只有一種dNTP，就添加上同聚物。DNA 53TTTdTTP ，末端轉(zhuǎn)移酶第87頁/共110頁4. 末端轉(zhuǎn)移酶的用途（1）同聚物加尾給外源DNA片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。外源DNA載體DNA5353CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶第88頁/共110頁（2）再生酶切位點(diǎn)便于回收克隆片斷。AAGCTTTTCGAA55Hind酶切ATTCGAAGCTT AKlen

28、ow補(bǔ)平第89頁/共110頁AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGA AGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源 DNA第90頁/共110頁AAGCTTTTTTCGA AGCTTTTTTCGAAAAAAAAHind位點(diǎn)Hind位點(diǎn)連接第91頁/共110頁二、T4多核苷酸激酶1. 來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。多種哺乳動物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶。2. 功能催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5-OH端。不論5-OH端突出與否。第92頁/共110頁53HO-OH53HO-OH3P-OH53HO-P5ATPT4多

29、核苷酸激酶如果ATP的磷酸帶有32P標(biāo)記，就會被轉(zhuǎn)移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。第93頁/共110頁3. 多核苷酸激酶的用途DNA 5-OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5端。53HO-OH53HO-OH332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP多核苷酸激酶3P-OH53HO-P5堿性磷酸酶（1）正向反應(yīng)（forward reaction）第94頁/共110頁（2）交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5端的磷酸交換。3P-OH53HO-P5332P-OH53HO-32P5(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。第95頁/共110頁1. 堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）細(xì)菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calf inte