1、第二節(jié)第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)一、一、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)（一）一）動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn) 無細(xì)胞壁無細(xì)胞壁 倍增時(shí)間長，生長緩慢倍增時(shí)間長，生長緩慢 培養(yǎng)中需氧量少，對(duì)攪拌敏感培養(yǎng)中需氧量少，對(duì)攪拌敏感 多以聚集體存在多以聚集體存在 原代細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞培養(yǎng)5050代即開始退化代即開始退化 細(xì)胞連接復(fù)雜細(xì)胞連接復(fù)雜（二）二） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定義動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)定義 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無細(xì)胞或者組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞菌、適溫和豐富的營

2、養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。門技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)體外培養(yǎng)分類體外培養(yǎng)分類: :1)1)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)( (初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)) ) 指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過程的過程. . 實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞一般增殖實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞一般增殖1010代左右代左右. . 原代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞. .2)2)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)( (繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)) ) 由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無限次傳代培由初代培養(yǎng)產(chǎn)生的能進(jìn)行無限次傳

3、代培養(yǎng)的細(xì)胞群稱養(yǎng)的細(xì)胞群稱細(xì)胞系細(xì)胞系. . 體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)的起源細(xì)胞在形體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)的起源細(xì)胞在形態(tài)和功能方面都態(tài)和功能方面都存在一定的差異存在一定的差異, ,甚至經(jīng)過長甚至經(jīng)過長期穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)后還會(huì)期穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)后還會(huì)產(chǎn)生一些變異產(chǎn)生一些變異. .二、二、體外培養(yǎng)細(xì)胞基本技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞基本技術(shù)v體外培養(yǎng)特點(diǎn)體外培養(yǎng)特點(diǎn)v體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)工具v體外培養(yǎng)條件體外培養(yǎng)條件v體外細(xì)胞生長增殖過程體外細(xì)胞生長增殖過程v培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法v大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（一）一）體外培養(yǎng)特點(diǎn)體外培養(yǎng)特點(diǎn)1.1.營養(yǎng)條件苛刻營養(yǎng)條件苛刻 除一般的營養(yǎng)物質(zhì)外除一般的營養(yǎng)物質(zhì)外, ,還

4、要血清還要血清. .2.2.適應(yīng)性差適應(yīng)性差, , 對(duì)環(huán)境敏感對(duì)環(huán)境敏感 包括對(duì)包括對(duì)PHPH、溶解氧、二氧化碳等。、溶解氧、二氧化碳等。3.3.培養(yǎng)時(shí)間長，易污染培養(yǎng)時(shí)間長，易污染 主要是生長緩慢主要是生長緩慢; ;顯著的污染是培養(yǎng)基的顯著的污染是培養(yǎng)基的PHPH迅速改變迅速改變. .（二）二）體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)工具1.1.空心纖維空心纖維: : 是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合物是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合物所織成的可透性濾膜所織成的可透性濾膜, ,外徑外徑1/3-1/4mm1/3-1/4mm。（二）二）體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)工具2.2.微球微球: : 直徑小、密度大的固體顆粒，常

5、通過攪拌直徑小、密度大的固體顆粒，常通過攪拌使無懸浮狀態(tài)的細(xì)胞附于顆粒表面單層生長使無懸浮狀態(tài)的細(xì)胞附于顆粒表面單層生長。（三）三）體外培養(yǎng)條件體外培養(yǎng)條件v溫度溫度：3737度度vpHpH：7.2-7.47.2-7.4v氣體：氣體：氧，二氧化碳，氮?dú)庋?，二氧化碳，氮?dú)鈜營養(yǎng)條件：營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基培養(yǎng)基 需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可以由血清提供可以由血清提供。關(guān)于培養(yǎng)基關(guān)于培養(yǎng)基1 1）天然培養(yǎng)基）天然培養(yǎng)基 多為動(dòng)物體液或組織提取液多為動(dòng)物體液或組織提取液, ,主要有

6、血清、主要有血清、雞胚汁、組織提取液。雞胚汁、組織提取液。 常配制成常配制成0.5%0.5%溶液溶液, ,偏酸性偏酸性2 2）合成培養(yǎng)基）合成培養(yǎng)基 據(jù)細(xì)胞種類和生長條件不同而異據(jù)細(xì)胞種類和生長條件不同而異 合成培養(yǎng)基中常要添加一部分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基中常要添加一部分天然培養(yǎng)基. .多加入小牛血清多加入小牛血清. .3)3)無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基 加入適宜的促細(xì)胞生長因子加入適宜的促細(xì)胞生長因子, ,保證細(xì)胞的保證細(xì)胞的良好生長良好生長. . 此外此外, ,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)還必需一些溶液動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)還必需一些溶液. .如如v平衡鹽水平衡鹽水: :維持滲透壓維持滲透壓; ;調(diào)控酸調(diào)控酸/ /堿平

7、衡堿平衡vPHPH調(diào)整液調(diào)整液:3.7%/5.6%/7.4%NaCO:3.7%/5.6%/7.4%NaCO3 3、HEPESHEPESv0.02%EDTA0.02%EDTA溶液：對(duì)細(xì)胞進(jìn)行非酶性解離溶液：對(duì)細(xì)胞進(jìn)行非酶性解離v抗生素抗生素: :防止微生物污染防止微生物污染v 如青如青- -鏈霉素、卡那霉素等鏈霉素、卡那霉素等（四）四）體外細(xì)胞生長增殖過程體外細(xì)胞生長增殖過程原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期 細(xì)胞活躍，分裂但不旺盛細(xì)胞活躍，分裂但不旺盛傳代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期 細(xì)胞增殖旺盛，可細(xì)胞增殖旺盛，可10-5010-50次增殖次增殖衰退期衰退期 細(xì)胞基本不增殖，并開始衰退凋亡細(xì)胞基本不增殖，并開始衰退凋

8、亡（五）五）培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法1 1）懸滴培養(yǎng)法）懸滴培養(yǎng)法: :19071907年哈里森創(chuàng)立。年哈里森創(chuàng)立。2 2）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法: :1933-19341933-1934蓋爾和劉易斯建立蓋爾和劉易斯建立3)3) 灌注小室培養(yǎng)法灌注小室培養(yǎng)法: :19121912年伯羅設(shè)計(jì)年伯羅設(shè)計(jì)4)4) 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法5)5) 培養(yǎng)板培養(yǎng)法培養(yǎng)板培養(yǎng)法三、三、現(xiàn)代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 依培養(yǎng)過程而言：依培養(yǎng)過程而言： 原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng) 依培養(yǎng)方法而言：依培養(yǎng)方法而言： 貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、 多孔載體培養(yǎng)、

9、微囊化培養(yǎng)、多孔載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、 中空纖維法中空纖維法、原代培養(yǎng)技術(shù)、原代培養(yǎng)技術(shù)組織塊原代培養(yǎng)組織塊原代培養(yǎng)組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）（1 1）組織塊原代培養(yǎng)技術(shù)）組織塊原代培養(yǎng)技術(shù)剪切剪切：剪碎、：剪碎、HanksHanks液清洗液清洗( (青鏈霉素殺菌青鏈霉素殺菌) )、 1mm1mm3 3碎塊、靜置沉降碎塊、靜置沉降擺布擺布：于培養(yǎng)瓶底部單層擺布組織小塊：于培養(yǎng)瓶底部單層擺布組織小塊 （間隔（間隔0.5cm0.5cm）風(fēng)干風(fēng)干：倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（塞瓶）于：倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（塞瓶）于36.536.5C C溫箱溫箱 培養(yǎng)培養(yǎng)2 2小時(shí)小時(shí)( (不超過不超過4 4小時(shí)小時(shí)

10、) )培養(yǎng)培養(yǎng): :加入少許培養(yǎng)液覆蓋組織后靜置培養(yǎng)加入少許培養(yǎng)液覆蓋組織后靜置培養(yǎng)關(guān)于關(guān)于Hanks液液(2)(2)組織消化培養(yǎng)技術(shù)組織消化培養(yǎng)技術(shù) 準(zhǔn)備準(zhǔn)備：用品消毒、洗手、：用品消毒、洗手、75%75%擦拭手至肘部擦拭手至肘部 剪切剪切：剪碎、：剪碎、HanksHanks液清洗液清洗( (青鏈霉素殺菌青鏈霉素殺菌30-6030-60 min min) )、2-3mm2-3mm3 3碎塊碎塊 消化消化：加入：加入30-5030-50倍組織體積的倍組織體積的0.25%0.25%的胰蛋白的胰蛋白 酶溶液，于酶溶液，于3737C C水浴或溫箱消化并每水浴或溫箱消化并每 10min10min左右搖

11、動(dòng)一次（最好磁力攪拌）。左右搖動(dòng)一次（最好磁力攪拌）。 消化時(shí)間依組織塊大小而異消化時(shí)間依組織塊大小而異(2)(2)組織消化培養(yǎng)技術(shù)組織消化培養(yǎng)技術(shù) 離心、計(jì)數(shù)離心、計(jì)數(shù)：500-1000rpm500-1000rpm、5min5min；倒置顯微鏡；倒置顯微鏡 下計(jì)數(shù)（單層覆蓋瓶底）下計(jì)數(shù)（單層覆蓋瓶底）。 培養(yǎng)培養(yǎng)：向：向合成合成培養(yǎng)基上接種消化后的單層培養(yǎng)基上接種消化后的單層細(xì)細(xì) 胞，于胞，于3737C C、CO2CO2培養(yǎng)箱（瓶塞用透氣培養(yǎng)箱（瓶塞用透氣 無菌棉塞）中培養(yǎng)。無菌棉塞）中培養(yǎng)。 監(jiān)控監(jiān)控：1-21-2天后鏡檢（細(xì)胞形態(tài)）；培養(yǎng)液天后鏡檢（細(xì)胞形態(tài)）；培養(yǎng)液p pH H值值 （

12、正常呈桃紅色，（正常呈桃紅色，p pH7.2-7.4H7.2-7.4；若發(fā)黃；若發(fā)黃 說明偏酸，更換培養(yǎng)液）說明偏酸，更換培養(yǎng)液）磁力攪拌器CO2培養(yǎng)箱、傳代培養(yǎng)技術(shù)、傳代培養(yǎng)技術(shù) 有有80-90%80-90%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代培養(yǎng)的最佳時(shí)期。培養(yǎng)的最佳時(shí)期。傳代培養(yǎng)技術(shù)過程傳代培養(yǎng)技術(shù)過程1. 1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。2. 2. 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混合液少許?；旌弦荷僭S。3. 3. 消化消化2 2- -5 5分鐘。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞分鐘。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞 間隙增大后，立即終止消化。間隙增大后，立即

13、終止消化。4. 4. 清洗：向瓶內(nèi)注入清洗：向瓶內(nèi)注入HanksHanks液數(shù)毫升把殘余液數(shù)毫升把殘余 消化液沖掉。消化液沖掉。 傳代培養(yǎng)技術(shù)過程傳代培養(yǎng)技術(shù)過程 注意加注意加HanksHanks液沖洗細(xì)胞時(shí)，動(dòng)作要輕，液沖洗細(xì)胞時(shí)，動(dòng)作要輕，以免把已松動(dòng)的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白以免把已松動(dòng)的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨(dú)消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用酶液單獨(dú)消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用HanksHanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5. 5. 制備細(xì)胞懸液：用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反制備細(xì)胞懸液：用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反 復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離。復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使

14、之從瓶壁脫離。6. 6. 計(jì)數(shù)后，分瓶置溫箱中培養(yǎng)。計(jì)數(shù)后，分瓶置溫箱中培養(yǎng)。 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)技術(shù)（1 1）用用作細(xì)胞附著的作細(xì)胞附著的材料：材料： 表面要求帶凈正電荷和高度的表面要求帶凈正電荷和高度的表面活性。表面活性。如：如： 玻璃玻璃主要用明礬主要用明礬- -硅硼酸玻璃；硅硼酸玻璃； 塑料塑料常用聚苯乙烯；常用聚苯乙烯； 金屬金屬不銹鋼和鈦是最理想的；不銹鋼和鈦是最理想的； 微載體微載體天然葡聚糖聚合物。天然葡聚糖聚合物。（2 2）轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系）轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系、微載體系統(tǒng)微載體系統(tǒng)，等。等。轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)的搖床或轉(zhuǎn)瓶機(jī) 、貼壁培養(yǎng)技術(shù)、貼壁培養(yǎng)技術(shù)（3 3）過程）過程（4 4）生長特性）生長特性 游離期：細(xì)胞呈懸浮態(tài)游離期：細(xì)胞呈懸浮態(tài) 吸附期：多數(shù)細(xì)胞吸附期：多數(shù)細(xì)胞2424小時(shí)內(nèi)能貼壁小時(shí)內(nèi)能貼壁 繁殖期：細(xì)胞分裂繁殖