1、現(xiàn)代生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)代生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)（生技（生技11級(jí)）級(jí)）周玉萍周玉萍號(hào)：短號(hào)：662138n本課程實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（本課程實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（54學(xué)時(shí)）學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)1、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的制備與質(zhì)量鑒定的制備與質(zhì)量鑒定 （包含瓊脂糖凝膠電泳）（包含瓊脂糖凝膠電泳）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)2、質(zhì)粒、質(zhì)粒DNA的片段化與分離的片段化與分離 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)3、大分子、大分子DNA的制備和質(zhì)量鑒定的制備和質(zhì)量鑒定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)4、PCR反應(yīng)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)5、PCR產(chǎn)品純化及克隆產(chǎn)品純化及克隆實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)6、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化、感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)7、利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子、利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化

2、子 （綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，18學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)）n實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)要求q兩人一組，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)兩人一組，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)q每次實(shí)驗(yàn)完成均要求寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題每次實(shí)驗(yàn)完成均要求寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題q不得曠課，特殊情況可補(bǔ)實(shí)驗(yàn)不得曠課，特殊情況可補(bǔ)實(shí)驗(yàn)q每次實(shí)驗(yàn)安排每次實(shí)驗(yàn)安排2人配制瓊脂糖凝膠人配制瓊脂糖凝膠n本課程考核本課程考核q前前6個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)50分（實(shí)驗(yàn)報(bào)告和思考題）分（實(shí)驗(yàn)報(bào)告和思考題） （本部分成績也是（本部分成績也是基因工程基因工程的平時(shí)成績）的平時(shí)成績）q綜合實(shí)驗(yàn)（包括設(shè)計(jì)報(bào)告）共計(jì)綜合實(shí)驗(yàn)（包括設(shè)計(jì)報(bào)告）共計(jì)50分分實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的制備與質(zhì)量鑒定的制備與質(zhì)量鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

3、的一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的載體質(zhì)粒粒DNA的提取方法。的提取方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 在堿性溶液中，雙鏈在堿性溶液中，雙鏈DNA氫鍵斷裂，氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結(jié)雙螺旋結(jié)構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒構(gòu)遭破壞而發(fā)生變性，但由于質(zhì)粒DNA分子量相對(duì)較小，分子量相對(duì)較小，且且呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)呈環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，即使，即使在高堿性在高堿性pH條件下，兩條互條件下，兩條互補(bǔ)鏈也不會(huì)完全分離，當(dāng)加入中和緩沖液時(shí)，變性質(zhì)粒補(bǔ)鏈也不會(huì)完全分離，當(dāng)加入中和緩沖液時(shí)，變性質(zhì)粒DNA 又恢復(fù)到原來的構(gòu)型又恢復(fù)到原來的構(gòu)型；而線性的大分子量細(xì)菌

4、染色；而線性的大分子量細(xì)菌染色體體DNA則不能復(fù)性，與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、則不能復(fù)性，與細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、SDS等形成等形成不溶性復(fù)合物，通過離心沉淀，細(xì)胞碎片、染色體不溶性復(fù)合物，通過離心沉淀，細(xì)胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒及大部分蛋白質(zhì)等可被除去，而質(zhì)粒DNA及小分子量的及小分子量的RNA則留在上清液中，再用酚則留在上清液中，再用酚/氯仿處理，可去除殘留蛋氯仿處理，可去除殘留蛋白質(zhì)，混雜的白質(zhì)，混雜的RNA可用可用RNA酶酶(RNAase)消除。消除。三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 含含pEGFP質(zhì)粒質(zhì)粒的大腸桿菌的大腸桿菌DH5

5、主要試劑：主要試劑： 溶液溶液I：50 mM葡萄糖，葡萄糖，10 mM EDTA， 25 mM Tris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶），用前加溶菌酶4 mg/L 溶液溶液II： 0.2 mol/L NaOH溶液（內(nèi)含溶液（內(nèi)含1% SDS）,現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用 溶液溶液III（pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸鉀，醋酸鉀，11.5 mL 冰醋酸，冰醋酸， 28.5 mL H2O； 飽和酚飽和酚/氯仿氯仿/異戊醇（異戊醇（25:24:1）、酚）、酚/氯仿（氯仿（1:1，V/V） TE緩沖液（緩沖液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， 含含RNA酶

6、（酶（RNaseA）: 20 g/ml 醋酸鈉（醋酸鈉（pH5.2）、）、70%乙醇、無水乙醇乙醇、無水乙醇四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1) 吸取吸取1.4 ml菌液至菌液至1.5 ml離心管中。離心管中。2) 離心離心(8 000r/min，1min)，棄上清液（根據(jù)菌液濃度判，棄上清液（根據(jù)菌液濃度判斷是否需要重復(fù)斷是否需要重復(fù)12次）。次）。3) 加入加入150 L 溶液溶液，用旋渦振蕩器，用旋渦振蕩器充分懸浮菌體充分懸浮菌體。4) 加入加入200 L溶液溶液，加蓋后溫和顛倒，加蓋后溫和顛倒56次，直至呈透次，直至呈透明狀。明狀。此步驟在此步驟在5分鐘內(nèi)完成。分鐘內(nèi)完成。5) 加入加入150

7、 L預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液，加蓋后反復(fù)顛倒混勻，直，加蓋后反復(fù)顛倒混勻，直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰浴至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰浴5min。6) 離心離心(14 000r/min，5min)，移取上清液于另一干凈離心，移取上清液于另一干凈離心管。管。7)7)向上清液中向上清液中加等體積加等體積的苯酚的苯酚/氯仿氯仿/異戊醇（異戊醇（25:24:1），），振蕩混勻抽提，離心振蕩混勻抽提，離心(14 000 r/min，5min)，溶液將出，溶液將出現(xiàn)分層。現(xiàn)分層。8) 移取上層水相溶液（約移取上層水相溶液（約450500L）于另一干凈離心管，）于另一干凈離心管，加等體積氯仿，振蕩混勻抽提，離心加等體積氯仿

8、，振蕩混勻抽提，離心(14 000 r/min，5min)，溶液將出現(xiàn)分層。，溶液將出現(xiàn)分層。9)移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入1/10體積的體積的醋酸鈉（醋酸鈉（pH5.2）和）和2倍體積無水乙醇混勻，冰浴倍體積無水乙醇混勻，冰浴30min。10) 離心離心(14 000r/min，10min，4)，倒掉上清液。，倒掉上清液。11) 加加0.5 ml 預(yù)冷的預(yù)冷的70% 酒精振蕩，洗酒精振蕩，洗DNA沉淀一次，離沉淀一次，離心心5 min，倒掉上清液。，倒掉上清液。12)真空抽干或室溫自然干燥真空抽干或室溫自然干燥.13)加加2030L TE緩沖

9、液使緩沖液使DNA完全溶解，室溫放置完全溶解，室溫放置10min，降解，降解RNA雜質(zhì)，少量用于瓊脂糖凝膠質(zhì)量檢雜質(zhì)，少量用于瓊脂糖凝膠質(zhì)量檢測，剩余質(zhì)粒測，剩余質(zhì)粒-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?4) 1%瓊脂糖凝膠配制：稱取瓊脂糖凝膠配制：稱取1g瓊脂糖粉末，加入瓊脂糖粉末，加入100ml 0.5倍倍TBE溶液，加熱熔化，稍降溫后，加入溶液，加熱熔化，稍降溫后，加入5L溴化溴化乙錠（乙錠（EB），混勻，制備凝膠板，冷卻后備用。），混勻，制備凝膠板，冷卻后備用。15) 每位同學(xué)各取每位同學(xué)各取5L質(zhì)粒質(zhì)粒DNA加入加入1L 6loading buffer，混勻，進(jìn)行，混勻，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣。16)

10、電泳條件：電泳條件：120v，40 min；電泳完成后，膠塊通過凝；電泳完成后，膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄膠成像系統(tǒng)檢測，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察并分析電泳圖片觀察并分析電泳圖片六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的片斷化及分離的片斷化及分離 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法鑒定學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法鑒定DNA質(zhì)量質(zhì)量 2、采用、采用型限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒型限制性核酸內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA，并通，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析

11、酶切效果。過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切效果。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 DNA吸收光譜峰在吸收光譜峰在260 nm處，測定此波長下處，測定此波長下DNA溶液的溶液的OD值，當(dāng)值，當(dāng)OD260=1時(shí)，雙鏈時(shí)，雙鏈DNA含量約為含量約為50 g/mL，據(jù)此可，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測定溶液中用紫外分光光度計(jì)測定溶液中DNA含量。由于蛋白質(zhì)吸收峰含量。由于蛋白質(zhì)吸收峰在在280 nm處，在測定處，在測定DNA含量時(shí)，通過計(jì)算含量時(shí)，通過計(jì)算OD260/OD280值，值，可了解所測可了解所測DNA的純度，如該值為的純度，如該值為1.82.0時(shí)，時(shí)，DNA純度高。純度高。 已知已知型限制性核酸內(nèi)切酶能專一識(shí)別

12、堿基序列，并在該型限制性核酸內(nèi)切酶能專一識(shí)別堿基序列，并在該處切斷雙鏈處切斷雙鏈DNA，形成一定長度和序列的，形成一定長度和序列的DNA片段。酶切片段。酶切反應(yīng)需反應(yīng)需Mg2+等金屬離子以及一定濃度的鹽離子，不同內(nèi)切酶等金屬離子以及一定濃度的鹽離子，不同內(nèi)切酶對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量對(duì)鹽離子有不同的要求，如鹽離子濃度使用不當(dāng)或甘油含量過高（過高（5%），會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性。），會(huì)使酶的識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生改變，產(chǎn)生星活性。絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度絕大多數(shù)酶的反應(yīng)溫度37。三、實(shí)驗(yàn)材料：三、實(shí)驗(yàn)材料： 實(shí)驗(yàn)一提取的質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)一提取的質(zhì)粒DNA四、試劑四、試劑 限制

13、性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶Xba I；緩沖液；緩沖液10M Buffer；0.1%BSA; 0.5TBE Buffer；1%瓊脂糖瓊脂糖五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、DNA的測定的測定 空白測定空白測定(Blank)：吸?。何?00 l TE緩沖液至比色杯，進(jìn)行空緩沖液至比色杯，進(jìn)行空白測定。白測定。 DNA測定測定(Sample)：取質(zhì)粒：取質(zhì)粒DNA 1 l至一干凈的離心管，至一干凈的離心管，加入加入199 l TE緩沖液稀釋混勻，所有溶液加入到干凈的比緩沖液稀釋混勻，所有溶液加入到干凈的比色杯中，測定色杯中，測定260 nm及及280 nm的光吸收值；計(jì)錄的光吸收值；計(jì)錄DNA濃度濃

14、度及及OD260/OD280比值。比值。2 2、酶切反應(yīng)、酶切反應(yīng) 酶切反應(yīng)液的配制酶切反應(yīng)液的配制: : Xba I I 1l 10M buffer 2l 0.1%BSA 2l DNA 5l (根據(jù)質(zhì)粒濃度來確定用量根據(jù)質(zhì)粒濃度來確定用量) ddH2O 10l 酶切反應(yīng)條件：酶切反應(yīng)條件：3737水浴水浴2 23 3小時(shí)小時(shí)。3 3、電泳檢測、電泳檢測 反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入2.5l 102.5l 10loading loading bufferbuffer，混勻，用以停止酶切反應(yīng)，所有，混勻，用以停止酶切反應(yīng)，所有22.5l22.5l樣品均樣品均點(diǎn)在同一個(gè)點(diǎn)樣

15、孔中。電泳條件：點(diǎn)在同一個(gè)點(diǎn)樣孔中。電泳條件：120V, 20120V, 20分鐘左右。分鐘左右。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察并分析電泳圖片。觀察并分析電泳圖片。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 大分子大分子DNA的制備和質(zhì)量鑒定的制備和質(zhì)量鑒定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?采用采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨）法從植物組織法從植物組織中提取基因組中提取基因組DNA，并進(jìn)行，并進(jìn)行DNA純度分析和瓊脂糖純度分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠電泳檢測。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 核酸是生物有機(jī)體

16、的重要成分，在細(xì)胞中核酸常與蛋白質(zhì)核酸是生物有機(jī)體的重要成分，在細(xì)胞中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白形式存在。在制備核酸時(shí)，通過研磨結(jié)合在一起，以核蛋白形式存在。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。 在濃在濃NaCl溶液溶液(12mol/L)中，中，DNA核蛋白的溶解度很大，核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很?。欢谙『说鞍椎娜芙舛群苄。欢谙aCl溶液溶液(0.14mol/L)中，中，DNA核蛋白的溶解度很小，核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的可利用不同

17、濃度的NaCl溶液將溶液將DNA核蛋白和核蛋白和RNA核蛋白從樣核蛋白從樣品中分別抽提出來。品中分別抽提出來。CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低濃是一種陽離子去污劑，具有從低濃度鹽溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高濃度鹽溶液度鹽溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高濃度鹽溶液中中CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。 分離得到核蛋白后，可用氯仿等將蛋白等雜質(zhì)除去分離得到核蛋白后，可用氯仿等將蛋白等雜質(zhì)除去。有效制備大分子有效制備大分子DNA的兩個(gè)原則：的兩個(gè)原則：1）防止和抑制內(nèi)源）防止和抑制內(nèi)源DNase對(duì)對(duì)DNA的降解。的

18、降解。2）盡量減少對(duì)溶液中）盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪切破壞；所有操作的機(jī)械剪切破壞；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。均須溫和，避免劇烈震蕩。 三、實(shí)驗(yàn)材料：三、實(shí)驗(yàn)材料：植物葉片約植物葉片約0.2克克四、實(shí)驗(yàn)試劑四、實(shí)驗(yàn)試劑 1M Tris-HCl (pH8.0)(提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞) CTAB分離緩沖液：分離緩沖液：2% CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.2%巰基巰基乙醇乙醇 (EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl 提供高鹽環(huán)

19、境，使DNA充分溶解，存在于液相中；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易從基因組DNA中除去) 洗滌緩沖液：洗滌緩沖液：76%乙醇，乙醇，10mmol/L乙酸銨乙酸銨 氯仿氯仿-異戊醇異戊醇(24:1 )、異丙醇、異丙醇、TE緩沖液緩沖液 液氮液氮五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟qCTAB分離緩沖液置于分離緩沖液置于60水浴中預(yù)熱；水浴中預(yù)熱；q2人一組，摘取人一組，摘取0.5g葉片，置于研缽中，倒入液氮，盡葉片，置于研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎；快將葉片研碎；q取約取約0.2g葉片粉末加入到葉片粉末加入到2.0mL離心管中，加入離心管中，加入1ml預(yù)預(yù)熱的熱的CTAB分

20、離緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻；分離緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使之混勻；q樣品置于樣品置于65保溫保溫30min；q加等體積加等體積(1mL)的氯仿的氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻；異戊醇，輕輕顛倒混勻； 1. 室溫下室溫下14000 rpm離心離心10min；q 上層水相吸入另一干凈上層水相吸入另一干凈1.5mL離心管中，加入離心管中，加入2/3體積體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置的異丙醇，輕輕混勻，靜置5min，使核酸沉淀下來；，使核酸沉淀下來；q 室溫下室溫下10000 rpm離心離心10min；q 棄去上清液，加入棄去上清液，加入500L洗滌緩沖液，懸浮混勻；洗滌緩沖液，懸浮混勻；q 4條件下，條件下，14

21、000 rpm離心離心10min；q 在室溫下使在室溫下使DNA沉淀干燥至周圍透明，中間有少許白沉淀干燥至周圍透明，中間有少許白色為止；色為止；q 將將DNA沉淀溶于沉淀溶于20L TE中，中，-20保存?zhèn)溆?；保存?zhèn)溆茫?q 取取5uL DNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢查所提取溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢查所提取DNA的完整性；的完整性；q 利用核酸蛋白檢測儀進(jìn)行利用核酸蛋白檢測儀進(jìn)行DNA濃度和純度檢測。濃度和純度檢測。q （方法同實(shí)驗(yàn)二）（方法同實(shí)驗(yàn)二）六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基因組基因組DNA的濃度和純度；觀察并分析電泳圖片的濃度和純度；觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)

22、內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 PCR反應(yīng)反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?了解了解PCR的基本原理，掌握的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)。的基本操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理PCR技術(shù)是通過模擬技術(shù)是通過模擬體內(nèi)體內(nèi)DNA復(fù)制復(fù)制的方式，在體外選擇的方式，在體外選擇性地性地?cái)U(kuò)增出來的技術(shù)。擴(kuò)增出來的技術(shù)。 PCR的過程：的過程：q高溫變性高溫變性：將反應(yīng)體系置于高溫下變性，使模板雙鏈：將反應(yīng)體系置于高溫下變性，使模板雙鏈DNA解鏈為兩條單鏈。解鏈為兩條單鏈。q低溫退火低溫退火：引物與模板鏈結(jié)合，形成部分雙鏈：引物與模板鏈結(jié)合，形成部

23、分雙鏈DNA。q中溫延伸中溫延伸：Taq DNA聚合酶使引物從聚合酶使引物從5端向端向3端延伸，端延伸，4種種dNTP摻入合成新的摻入合成新的DNA互補(bǔ)鏈。互補(bǔ)鏈。 反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和聚合反應(yīng)循環(huán)，可使兩端反復(fù)進(jìn)行這種變性、退火和聚合反應(yīng)循環(huán)，可使兩端引物限定范圍內(nèi)的引物限定范圍內(nèi)的DNA序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。序列以指數(shù)形式擴(kuò)增。三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒：質(zhì)粒： pEGFP 四、試劑四、試劑1. 10 PCR buffer 、rTaq 酶酶2. dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各各2.5mMq引物引物(2.5M) GFP-F: 5: 5 -T

24、AGTCGACT-TAGTCGACTATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-5GTGAGCAAGGGCGAGGAG-5 (Tm=65.5) GFP-R: 5: 5 -GCGTCTAGA-GCGTCTAGATTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3CTTGTACAGCTCGTCCATG-3 (Tm=61.5)4. 2.0% 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR反應(yīng)混合液的配制反應(yīng)混合液的配制 (50l) 10 PCR buffer 5l dNTP mixture 4l 前向引物前向引物 (P1) 8l 反向引物反向引物 (P2) 8l DNA 模板模板

25、0.5l rTaq酶酶 0.5l 滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水 24l 所有試劑所有試劑后，輕輕混勻，稍離心后即可，后，輕輕混勻，稍離心后即可，為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā)，可添加為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā)，可添加30l礦物油覆蓋。礦物油覆蓋。 2、PCR儀的參數(shù)設(shè)置儀的參數(shù)設(shè)置 94 4 min 94 30sec 40 cycles 61 30sec 72 50sec 72 5 min3、瓊脂糖凝膠電泳檢測、瓊脂糖凝膠電泳檢測 反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)結(jié)束后，取5l PCR產(chǎn)品，加入產(chǎn)品，加入1l 6loading buffer，混勻后點(diǎn)樣，電泳混勻后點(diǎn)樣，電泳20min。 其余其余45l PCR產(chǎn)品保存在產(chǎn)品保存

26、在-20冰箱中，下次實(shí)驗(yàn)使用。冰箱中，下次實(shí)驗(yàn)使用。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀察并分析電泳圖片觀察并分析電泳圖片七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 PCR產(chǎn)品純化及克隆產(chǎn)品純化及克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握基因工程產(chǎn)物純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的操作技術(shù)中最常用的T-A克隆方法克隆方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、產(chǎn)物一般都含有過量的引物、Taq酶及酶及dNTP等等成分，直接影響后續(xù)的成分，直接影響后續(xù)的DNA連接酶的連接

27、反應(yīng)連接酶的連接反應(yīng);實(shí)驗(yàn)中可實(shí)驗(yàn)中可采用苯酚采用苯酚/氯仿氯仿/異戊醇、氯仿依次使反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)異戊醇、氯仿依次使反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)變性的方法純化雜質(zhì)變性的方法純化DNA產(chǎn)品，然后在酸性條件下用無產(chǎn)品，然后在酸性條件下用無水乙醇沉淀水乙醇沉淀DNA。 利用普通的利用普通的Taq DNA聚合酶所擴(kuò)增的聚合酶所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的3-端具有一個(gè)端具有一個(gè)A突出末端，突出末端，T載體的載體的5-端具有一個(gè)端具有一個(gè)T突出末突出末端，二者正好互補(bǔ)，然后用端，二者正好互補(bǔ)，然后用T4 DNA連接酶在體外將目的連接酶在體外將目的片段與線性化載體連接的方法稱為片段與線性化載體連接的方法稱為T-

28、A克隆?？寺　?三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)四的實(shí)驗(yàn)四的 PCR產(chǎn)品產(chǎn)品 pMD19-T Vector四、試劑四、試劑TE 緩沖液緩沖液苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇異戊醇(25/24/1)、氯仿、氯仿醋酸鈉（醋酸鈉（pH5.2）、無水乙醇、）、無水乙醇、70%乙醇乙醇T4 DNA連接酶混合物連接酶混合物(Solution I)五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR產(chǎn)品純化產(chǎn)品純化l 將將PCR產(chǎn)品（約產(chǎn)品（約45l）小心轉(zhuǎn)入）小心轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加離心管中，加入入55l TE緩沖液至總體積緩沖液至總體積100l，混勻；，混勻；l 加入加入100l苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇，渦旋混合異戊醇，

29、渦旋混合1 min，14000 rpm離心離心5 min；l 將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入100l氯仿，渦旋氯仿，渦旋混合混合1 min，14000 rpm離心離心5 min； 再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10l醋酸鈉醋酸鈉（pH=5.2）和）和250l無水乙醇，顛倒混勻，將離心管無水乙醇，顛倒混勻，將離心管插入冰中放置插入冰中放置 30 min；n 在在4，14000 rpm離心離心10 min，棄去上清液，觀察，棄去上清液，觀察DNA沉淀；沉淀；l 加入加入500l預(yù)冷預(yù)冷 70乙醇，洗滌乙醇，洗滌DNA沉淀沉淀, 4 140

30、00 rpm離心離心5min，棄去上清液；空氣干燥，棄去上清液；空氣干燥DNA沉淀，沉淀，加加5l無菌水溶解無菌水溶解 DNA。l 2、連接反應(yīng)、連接反應(yīng)l 經(jīng)純化的經(jīng)純化的PCR產(chǎn)品產(chǎn)品4.5l轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到PCR管中，加入管中，加入0.5l pMD19-T載體，再加入載體，再加入5l T4 DNA連接酶混合物連接酶混合物（ Solution I ），輕輕混勻，稍加離心即可；），輕輕混勻，稍加離心即可；l 連接反應(yīng)混合物放置在連接反應(yīng)混合物放置在PCR儀中，儀中，16連接過夜；連接過夜；l 連接產(chǎn)物用于下次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。連接產(chǎn)物用于下次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須等到下次實(shí)

31、驗(yàn)完成后才能確定是否本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須等到下次實(shí)驗(yàn)完成后才能確定是否連接成功。連接成功。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。按實(shí)驗(yàn)內(nèi)容完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告及教材上的思考題。 （下周不用交報(bào)告，實(shí)驗(yàn)六完成后再交下周不用交報(bào)告，實(shí)驗(yàn)六完成后再交）實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膎了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的了解細(xì)胞轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。意義。n學(xué)習(xí)用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。學(xué)習(xí)用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。1.學(xué)習(xí)外源學(xué)習(xí)外源DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細(xì)胞的方法。轉(zhuǎn)化大腸桿菌受

32、體細(xì)胞的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是將外源是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株(R-，M-)，這些變異株可以，這些變異株可以容忍外源容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。 受體細(xì)胞經(jīng)過一些化學(xué)試劑如受體細(xì)胞經(jīng)過一些化學(xué)試劑如CaCl2、 RbCl等處理后，等處理后，細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的改變，成為能允許外源細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生暫時(shí)性的改變，成為能允許外源D

33、NA分子進(jìn)入的分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。現(xiàn)新的遺傳性狀。 三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 E. coli DH5菌株：菌株：R-，M-，Amp- 實(shí)驗(yàn)五的連接產(chǎn)物：實(shí)驗(yàn)五的連接產(chǎn)物：pMD19 /GFP四、試劑四、試劑 1、含氨芐青霉素、含氨芐青霉素(Amp, 100mg/L)的的LB固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 2、X-gal儲(chǔ)存液（儲(chǔ)存液（20mg/ml） 3、IPTG儲(chǔ)存液（儲(chǔ)存液（200mg/ml） 4、0.10 mol/L CaCl2溶液溶液

34、五、實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)步驟1、受體菌的培養(yǎng)、受體菌的培養(yǎng) 從從LB平板上挑取新鮮活化的平板上挑取新鮮活化的E. coli DH5單菌落，接單菌落，接種于種于3-5mL LB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，37下振蕩培養(yǎng)下振蕩培養(yǎng)12h左右，左右，直至對(duì)數(shù)生長后期。直至對(duì)數(shù)生長后期。 將該菌懸液以將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于的比例接種于100mL LB液液體培養(yǎng)基中，體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)2-3h至至OD600 =0.5左右。左右。 (實(shí)驗(yàn)老師已幫大家完成實(shí)驗(yàn)老師已幫大家完成)2、感受態(tài)細(xì)胞的制備、感受態(tài)細(xì)胞的制備 (CaCl2法法)l吸取吸取1.5mL培養(yǎng)液到一滅菌的離心管

35、中，將離心管培養(yǎng)液到一滅菌的離心管中，將離心管插入冰中放置插入冰中放置10min，然后于，然后于4下下10 000 rpm離心離心10min。l棄去上清，用棄去上清，用1mL預(yù)冷的預(yù)冷的0.10mol/L CaCl2 溶液輕輕溶液輕輕懸浮細(xì)胞，將離心管插入冰中放置懸浮細(xì)胞，將離心管插入冰中放置30min，4下下10 000rpm離心離心10min。 棄去上清，加入棄去上清，加入100 l預(yù)冷的預(yù)冷的0.10mol/L CaCl2溶液，溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰中放置幾分鐘，即成輕輕懸浮細(xì)胞，冰中放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。3、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 l向制備的感受態(tài)細(xì)胞中加入向制

36、備的感受態(tài)細(xì)胞中加入10l連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，插入冰中，放置插入冰中，放置30min。l含有混合物的離心管置入含有混合物的離心管置入42水浴中熱擊水浴中熱擊90秒，熱擊秒，熱擊后迅速插入冰中，冷卻后迅速插入冰中，冷卻3-5min。 向離心管中加入向離心管中加入900 L LB液體培養(yǎng)基，混勻后液體培養(yǎng)基，混勻后37振振蕩培養(yǎng)蕩培養(yǎng)12h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。4、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的涂布、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的涂布l篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基(含含X-gal和和IPTG)的準(zhǔn)備：在事先制備好的準(zhǔn)備：在事先制備好的含的含100 mg/L Amp的的LB平板表面（平板表面（中央位置中央位置）加）加40l X-gal儲(chǔ)存液和儲(chǔ)存液和4 l IPTG儲(chǔ)存液，用無菌玻棒儲(chǔ)存液，用無菌玻棒將溶液涂布均勻，置于超凈工作臺(tái)上，使培養(yǎng)基表將溶液涂布均勻，置于超凈工作臺(tái)上，使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。面的液體完全被吸收。l取取500 l復(fù)壯后的轉(zhuǎn)化菌液涂布于篩選培養(yǎng)基表面，復(fù)壯后的轉(zhuǎn)化菌液涂布于篩選培養(yǎng)基表面，待菌液待菌液完全被培養(yǎng)基吸收完全被培養(yǎng)基吸收后，用封口膜封住培養(yǎng)皿后，用封口膜封住培養(yǎng)皿邊緣，倒置培養(yǎng)