1、蠟樣芽胞桿菌蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)的檢驗的檢驗 （一）蠟樣芽胞桿菌生物學性狀（一）蠟樣芽胞桿菌生物學性狀 1 1、形態(tài)和染色特性、形態(tài)和染色特性 該菌為革蘭氏陽性的大桿菌，菌體兩端較平整，芽該菌為革蘭氏陽性的大桿菌，菌體兩端較平整，芽胞呈橢圓形，位于菌體中央稍偏一端胞呈橢圓形，位于菌體中央稍偏一端, ,多呈鏈狀排列多呈鏈狀排列, ,無莢膜，有周鞭毛無莢膜，有周鞭毛2 2、培養(yǎng)特性、培養(yǎng)特性 （1 1）需氧菌，生長溫度范圍在）需氧菌，生長溫度范圍在10-4510-45之間。最適之間。最適 生長溫度為生長溫度為28-3528-35。 （2 2）在普通培養(yǎng)基上生長良好。）在普

2、通培養(yǎng)基上生長良好。本菌在普通瓊脂平板上，生長本菌在普通瓊脂平板上，生長的菌落呈乳白色，不透明，直的菌落呈乳白色，不透明，直徑徑4-6mm,4-6mm,邊緣不整齊，表面粗邊緣不整齊，表面粗糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀。糙，呈毛玻璃狀或白蠟狀。（3 3）在血液瓊脂平板上形成）在血液瓊脂平板上形成淺灰色、不透明、似毛玻璃淺灰色、不透明、似毛玻璃狀的菌落。狀的菌落。菌落周圍初呈草菌落周圍初呈草綠色溶血綠色溶血, ,時間稍長即完全透時間稍長即完全透明明。（4 4）蠟狀芽胞桿菌在甘露醇）蠟狀芽胞桿菌在甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂卵黃多粘菌素瓊脂(MYP) (MYP) 上的菌落為上的菌落為粉紅色粉紅色( (表示不發(fā)表

3、示不發(fā)酵甘露醇酵甘露醇) )，周圍有粉紅色的，周圍有粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。暈（表示產生卵磷脂酶）。（5 5）在普通肉湯內生長迅速，肉湯混濁，常）在普通肉湯內生長迅速，肉湯混濁，常常有常有菌膜或壁環(huán)菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。，振搖易乳化。3 3、生化性狀：、生化性狀：（1 1）葡萄糖發(fā)酵試驗：接種于酚紅葡萄糖肉湯中，）葡萄糖發(fā)酵試驗：接種于酚紅葡萄糖肉湯中， 厭氧條件下厭氧條件下3535培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h。培養(yǎng)基應由紅色變。培養(yǎng)基應由紅色變 為黃色。為黃色。（2 2）硝酸鹽還原試驗：陽性（紅色）。）硝酸鹽還原試驗：陽性（紅色）。 （表明本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產酸）（表明本菌在厭氧條

4、件下分解葡萄糖產酸）（3 3） V-PV-P試驗：接種于改良試驗：接種于改良V-PV-P培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3535 培養(yǎng)培養(yǎng)48 h48 h。加。加V-PV-P試劑及肌酸數(shù)粒，靜止試劑及肌酸數(shù)粒，靜止 1h1h，應為陽性反應（，應為陽性反應（伊紅色伊紅色）。）。 （4 4）L-L-酪氨酸分解試驗：接種于酪氨酸分解試驗：接種于L-L-酪氨酸瓊脂培酪氨酸瓊脂培 養(yǎng)基上，養(yǎng)基上，3535培養(yǎng)培養(yǎng)48 h,48 h,陽性反應菌落周圍培陽性反應菌落周圍培 養(yǎng)基應出現(xiàn)澄清透明區(qū)（表示產生酪蛋白養(yǎng)基應出現(xiàn)澄清透明區(qū)（表示產生酪蛋白 酶）。陰性時應繼續(xù)培養(yǎng)酶）。陰性時應繼續(xù)培養(yǎng)72 h72 h再觀察。再觀察

5、。（5 5）溶菌酶試驗：用直徑）溶菌酶試驗：用直徑2mm2mm接種環(huán)取純菌懸液接種環(huán)取純菌懸液 一環(huán)一環(huán), ,接種于溶菌酶肉湯中，接種于溶菌酶肉湯中，3535培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h。 該菌在本培養(yǎng)基（含該菌在本培養(yǎng)基（含0.0010.001的溶菌酶）中能的溶菌酶）中能 生長。如出現(xiàn)陰性反應生長。如出現(xiàn)陰性反應, ,應繼續(xù)培養(yǎng)應繼續(xù)培養(yǎng)24 h24 h。 4 4、致病性、致病性 蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒，除必須具有大量的細菌蠟樣芽胞桿菌引起食物中毒，除必須具有大量的細菌外，腸毒素也是重要的致病因素。外，腸毒素也是重要的致病因素。 耐熱性腸毒素：耐熱性腸毒素：1003010030分鐘不能被破壞，為引

6、起分鐘不能被破壞，為引起嘔吐嘔吐 型型中毒的致病因素中毒的致病因素, ,常在米飯中形成。常在米飯中形成。 不耐熱腸毒素：是引起不耐熱腸毒素：是引起腹瀉型腹瀉型胃腸炎的病因，能在各種胃腸炎的病因，能在各種 食物中形成。食物中形成。5 5、抵抗力、抵抗力 蠟樣芽胞桿菌蠟樣芽胞桿菌100 20100 20分鐘即可被殺死；對酸分鐘即可被殺死；對酸堿不敏感，堿不敏感，pH6-11pH6-11對本菌基本上不受影響，對本菌基本上不受影響，pH5pH5以以下，生長可受到抑制。下，生長可受到抑制。 （二）流行病學特點（二）流行病學特點 1 1、季節(jié)性特點：、季節(jié)性特點： 以夏、秋季，尤其是以夏、秋季，尤其是6

7、61010月為多見。月為多見。2 2、食品種類、食品種類剩飯，特別是大米飯。剩飯，特別是大米飯。乳及乳制品、畜禽肉類制品、蔬菜、萊湯、馬鈴薯、乳及乳制品、畜禽肉類制品、蔬菜、萊湯、馬鈴薯、豆芽、甜點心、調味汁、色拉。豆芽、甜點心、調味汁、色拉。 國內：與淀粉質食品相關多。國內：與淀粉質食品相關多。3 3、臨床癥狀、臨床癥狀 嘔吐型中毒嘔吐型中毒：多見于過剩米飯和油炒飯，由耐熱性：多見于過剩米飯和油炒飯，由耐熱性腸毒素為致病因素；潛伏期短，一般為腸毒素為致病因素；潛伏期短，一般為2 23 3小時，最短小時，最短為為3030分鐘，最長分鐘，最長5 56 6小時；癥狀以嘔吐，腹痙攣為主，小時；癥狀以

8、嘔吐，腹痙攣為主，腹瀉則少見，一般經過腹瀉則少見，一般經過8 81010小時而治愈。小時而治愈。 腹瀉型中毒腹瀉型中毒：由各種食品中不耐熱腸毒素引起，潛：由各種食品中不耐熱腸毒素引起，潛伏期在伏期在6 6小時以上，一般為小時以上，一般為6 61414小時；癥狀以腹瀉，腹小時；癥狀以腹瀉，腹痙攣，而嘔吐卻不常見；病程痙攣，而嘔吐卻不常見；病程24243636小時。小時。1.蠟樣芽孢桿菌檢驗程序：蠟樣芽孢桿菌檢驗程序：檢樣25g(ml)+225ml生理鹽水中華人民共和國國家中華人民共和國國家標準食品衛(wèi)生微生物標準食品衛(wèi)生微生物學檢驗蠟樣芽孢桿菌學檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗檢驗GB/T 4789.28-G

9、B/T 4789.28-20032003做成10-1-10-5的稀釋液選擇性培養(yǎng)基（菌數(shù)測定）MYP選擇性培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）MYP37，18h-24h菌數(shù)計算營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基36 112h20h36 112h20h生長及菌落觀察染色鏡檢檢生化試驗菌株保存報 告（三）檢測方法（三）檢測方法10-110-5的的稀釋液的制備稀釋液的制備 每個稀釋度每個稀釋度0.1mL接種于接種于2個個MYP培養(yǎng)基培養(yǎng)基361 1220h 菌落計數(shù)菌落計數(shù)361 1220h 挑取菌落接種肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）挑取菌落接種肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)）證實試驗證實試驗 報報 告告 形態(tài)觀察形態(tài)觀察染色鏡檢染色

10、鏡檢培養(yǎng)特性培養(yǎng)特性 生化特性生化特性 生化分型生化分型 2 2菌數(shù)測定菌數(shù)測定 以無菌操作將檢樣以無菌操作將檢樣25g25g或或25 ml25 ml按菌落總數(shù)測定方式，用按菌落總數(shù)測定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成1010-1-11010-5-5的稀釋液。的稀釋液。取各稀釋液取各稀釋液0.1ml0.1ml，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用黏菌素瓊脂）平板上，用L L形棒涂布于整個表面，置形棒涂布于整個表面，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)121220h20h后，選取菌落數(shù)在后，選取菌落數(shù)在3030個左右者進行計個左右

11、者進行計數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）示不發(fā)酵甘露醇）, ,環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。產生卵磷脂酶）。 計數(shù)后，從中挑取計數(shù)后，從中挑取5 5個這樣的菌落作證實試驗。根個這樣的菌落作證實試驗。根據試驗證實為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該據試驗證實為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該培養(yǎng)皿內的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)培養(yǎng)皿內的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。 計數(shù)后，從中挑取計數(shù)

12、后，從中挑取5 5個此種菌落做證實試驗，根據證實個此種菌落做證實試驗，根據證實的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該平板上的菌落數(shù)，然的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該平板上的菌落數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)，即得每克（毫升）樣品中所含蠟樣芽胞后乘其稀釋倍數(shù)，即得每克（毫升）樣品中所含蠟樣芽胞桿菌數(shù)。桿菌數(shù)。 例如將例如將0.1mL 100.1mL 10-4-4樣品稀釋液涂布于樣品稀釋液涂布于MYPMYP平板上，其可疑平板上，其可疑菌落為菌落為2525個，取個，取5 5個鑒定，證實四個菌落為蠟樣芽孢桿菌，個鑒定，證實四個菌落為蠟樣芽孢桿菌，則則1g1g（mLmL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)為：）檢樣中所含蠟樣芽

13、孢桿菌數(shù)為： 選取具有選取具有15-15015-150個典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板個典型或可疑蠟樣芽孢桿菌菌落的平板, ,進行計數(shù)。計算同一稀釋度兩個平板的平均菌落數(shù)。進行計數(shù)。計算同一稀釋度兩個平板的平均菌落數(shù)。25254/54/510104 410102 210106 6 3 3分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 將檢樣或其稀釋液劃線于上述選擇性培養(yǎng)基平板上將檢樣或其稀釋液劃線于上述選擇性培養(yǎng)基平板上，置，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)121220h20h，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的，挑取可疑蠟樣芽孢桿菌的菌落接種于菌落接種于肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上做純培養(yǎng)，然做純培養(yǎng)，然后做證實試驗。后做證實試

14、驗。 4 4證實試驗證實試驗（1 1）形態(tài)觀察）形態(tài)觀察 本菌應為本菌應為G G桿菌，寬度在桿菌，寬度在1m1m或或1m1m以上，芽孢呈卵以上，芽孢呈卵圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。圓形，不突出菌體，多位于菌體中央或稍偏于一端。（2 2）培養(yǎng)特性）培養(yǎng)特性 本菌在肉湯中生長混濁，常有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化本菌在肉湯中生長混濁，常有菌膜或壁環(huán)，振搖易乳化。瓊脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃。瓊脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀且邊緣不齊。狀或融蠟狀且邊緣不齊。 （3 3）生化特性）生化特性 本菌有動力；產生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化本菌有動力；產生

15、卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化氫酶試驗陽性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；能氫酶試驗陽性；溶血；不發(fā)酵甘露醇和木糖；能液化明膠和還原硝酸鹽；在厭氧條件下能發(fā)酵葡液化明膠和還原硝酸鹽；在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。萄糖。(4)(4)生化分型生化分型 根據蠟樣芽孢桿菌對根據蠟樣芽孢桿菌對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、淀粉水解、還原、淀粉水解、V-PV-P反應、明膠液化的試反應、明膠液化的試驗，分成不同型別，驗，分成不同型別，見表見表1 1。表表1 1 蠟樣芽孢桿菌生化分型蠟樣芽孢桿菌生化分型型型別別生生 化化 試試 驗驗檸檬酸鹽利用檸檬酸鹽利用硝酸鹽還原硝酸鹽還原淀粉水解淀粉水解V-PV-P反

16、應反應明膠液化明膠液化1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212131314141515（4 4）與類似菌鑒別）與類似菌鑒別 本菌與其他類似菌的鑒別見表本菌與其他類似菌的鑒別見表2 2。 5.5.結果報告結果報告 報告報告1g1g（mLmL）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)量）檢樣中所含蠟樣芽孢桿菌數(shù)量 個個/g(mL)/g(mL)。 實驗三、食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗實驗三、食品中蠟樣芽孢桿菌的檢驗一、實驗目的一、實驗目的1學習蠟樣芽孢桿菌檢驗的原理和方法。學習蠟樣芽孢桿菌檢驗的原理和方法。2了解蠟樣芽孢桿菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特了解蠟樣芽孢桿菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特

17、性。性和生化特性。v蠟樣芽孢桿菌為需氧、能產生芽孢的革蘭蠟樣芽孢桿菌為需氧、能產生芽孢的革蘭氏陽性桿菌，在自然界分布較廣，食品在正氏陽性桿菌，在自然界分布較廣，食品在正常情況下就可能有此菌存在，因而易從各種常情況下就可能有此菌存在，因而易從各種食品中檢出。蠟樣芽孢桿菌能發(fā)酵麥芽糖、食品中檢出。蠟樣芽孢桿菌能發(fā)酵麥芽糖、蔗糖和水楊苷，不發(fā)酵乳糖、甘露醇、木糖蔗糖和水楊苷，不發(fā)酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和側金盞花醇、阿拉伯糖、山梨醇和側金盞花醇,卵磷脂酶卵磷脂酶和酪蛋白酶，過氧化氫酶試驗陽性，溶血，和酪蛋白酶，過氧化氫酶試驗陽性，溶血，能在能在24h 內液化明膠和還原硝酸鹽，在厭氧內液

18、化明膠和還原硝酸鹽，在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。條件下能發(fā)酵葡萄糖。二、實驗原理二、實驗原理三、實驗方法與步驟三、實驗方法與步驟1蠟樣芽孢桿菌檢驗程序蠟樣芽孢桿菌檢驗程序 2菌數(shù)測定菌數(shù)測定以無菌操作將檢樣以無菌操作將檢樣25g或或25 ml按菌落總數(shù)測定方式，用滅菌生理鹽水按菌落總數(shù)測定方式，用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液做成或磷酸鹽緩沖液做成10-110-5的稀釋液。取各稀釋液的稀釋液。取各稀釋液0.1ml，接種在，接種在選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用選擇培養(yǎng)基（甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂）平板上，用L形棒涂布于整個形棒涂布于整個表面，置表面，置37培養(yǎng)培養(yǎng)1220h后，選取菌落數(shù)

19、在后，選取菌落數(shù)在30個左右者進行計數(shù)。個左右者進行計數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上生成的菌落為紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）,環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。計數(shù)后，從中挑環(huán)繞有白色至淡粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。計數(shù)后，從中挑取取5個這樣的菌落作證實試驗。根據試驗證實為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)個這樣的菌落作證實試驗。根據試驗證實為蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)，計算出該培養(yǎng)皿內的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克，計算出該培養(yǎng)皿內的蠟樣芽孢桿菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。或每毫升樣品所含的蠟樣芽孢桿菌數(shù)。將檢樣或其稀釋液劃線于上述