1、單克隆抗體藥物的臨床前研發(fā)背景知識 大分子藥物生物制藥始于1982年用重組DNA技術(shù)進(jìn)行生物合成的人胰島素(rHI)舉例舉例激素 (胰島素，胰高血糖素，生長激素)造血生長因子(Erythropoietin, colony stimulating factors)干擾素 (Interferons-, -, -)白介素 (Interleukin-2)疫苗 (Hepatitis B surface antigen)腫瘤壞死因子 治療用酶單克隆抗體來源于細(xì)菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等各種表達(dá)體系研發(fā)流程靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與選擇單克隆抗體的制備藥效篩選藥動(dòng)評價(jià)臨床試驗(yàn)靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和選擇集中在細(xì)胞死亡通路、

2、血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞死亡通路、血管生成、細(xì)胞周期調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面例如： CD20 :表達(dá)于B細(xì)胞和成熟B細(xì)胞，調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖、分化；在95%以上的B細(xì)胞性淋巴瘤中表達(dá) 抗抗CD20單抗單抗可用于治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤 單抗藥物工作機(jī)理： 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用( complement dependent cytotoxicity, CDC) 中和細(xì)胞因子 單抗藥物作用機(jī)理經(jīng)典靶點(diǎn)靶點(diǎn)靶點(diǎn)表達(dá)細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞抗體藥抗體藥商品名商品名廠家廠家CD20D

3、audi,raji,RPMI-8226利妥昔單抗（Rituximab）美羅華（Rituxan） 羅氏Her2MDA-MB-231,MCF-7,SK-OV-3曲妥珠單抗（Trasduzumab）赫賽?。℉erceptin）羅氏EGFRA431,A549西妥昔單抗（Cetuximab）愛必妥（Erbitux）默克雪蘭諾TNFCHO-DG44-tnf阿達(dá)木單抗（Adalimumab）修美樂（Humira）雅培VEGFHUVEC貝伐珠單抗（Bevacizumab）阿瓦斯?。ˋvastin）羅氏 單克隆抗體的制備 抗體的人源化 嵌合抗體：應(yīng)用DNA 重組技術(shù)將小鼠抗體基因上的可變區(qū)與人抗體基因的恒定區(qū)重

4、組, 再將重組后的基因?qū)牍撬枇黾?xì)胞中表達(dá) CDR 移植抗體（改型抗體）：進(jìn)一步用人的編碼構(gòu)架區(qū)( FR) 替代鼠FR, 形成更為完全的人源化抗體, 即除了3 個(gè)CDR 是鼠源的外, 其余全部是人源結(jié)構(gòu) 完全人源化抗體：1、噬菌體抗體庫技術(shù)；2、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)藥效篩選特異性與親和力鑒定：特異性與親和力鑒定：ELISA, WB, FACS, IHC, IP 等等功能鑒定：功能鑒定： ADCC, CDC, 中和細(xì)胞因子中和細(xì)胞因子by抗體生產(chǎn)部門by藥效部門 ADCCLDH releaseADCC Assay on SK-BR-3 Cells with NK92-CD16AAb Concentra

5、tion, g/ml% Target Cell Lysis10-410-2100102-10010203040506070Herceptin(control)#Herceptin (control)log(agonist) vs. response - Variable slope (four parameters)Best-fit valuesBottom0.6537Top31.88LogEC50-2.545HillSlope1.118EC50,g/ml0.002854藥效篩選CDC-CTGRituxanlog(agonist) vs. response - Variable slope (

6、four parameters)Best-fit valuesBottom6.625Top100.1LogEC50-0.5091HillSlope3.069EC50, g/ml0.3096藥效篩選cell proliferation and antibody neutralizationVEGFBest-fit valuesBottom117.7Top526.2LogEC500.6934HillSlope1.875EC50,ng/ml4.936Span408.6AvastinBottom25.7Top101.1LogEC50-1.386HillSlope-1.8EC50,ng/ml0.0410

7、7Span75.4藥效篩選評估ADA是否會影響藥效藥動(dòng)評價(jià)Pharmacokinetics, PKAnti-drug antibodies, ADANeutralizing Anti-drug antibody, NAbcell-basednon-cell-based主要評估血清中藥物水平，不被腎臟清除，半衰期長；單抗的主要代謝結(jié)果是降解為肽段和氨基酸，無需進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究評估免疫原性，是否產(chǎn)生ADA包被抗原 優(yōu)化包被液種類 優(yōu)化抗原濃度4孵育過夜 N.A.封閉 優(yōu)化封閉液種類及濃度孵育一抗 優(yōu)化一抗梯度稀釋的跨度、倍數(shù) 優(yōu)化孵育時(shí)間、溫度孵育二抗 優(yōu)化二抗工作濃度 優(yōu)化孵育時(shí)間、溫度顯色及終止 加TMB后避光孵育顯色，10-30 min后適時(shí)終止 間接法ELISA建立流程優(yōu)化案例優(yōu)化案例使用標(biāo)準(zhǔn)品建立實(shí)驗(yàn)時(shí)，假設(shè)二抗工作濃度已經(jīng)確定，不同抗原濃度與一抗?jié)舛日粚?shí)驗(yàn)MSD旗下明星藥物，旨在利用人體