1、實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)技術(shù) 韓東洺韓東洺 2015-07-08目錄目錄實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量 PCR介紹介紹熒光熒光PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Quantitative Real-time PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異DNA片段的一片段的一種方法。由高溫種方法。由高溫變性變性、低溫、低溫退火退火及適溫及適溫延伸延伸等幾等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡以迅速擴(kuò)增，具有特異性

2、強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。便、省時(shí)等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量 PCR 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量 PCR (Quantitative real-time PCR) 是是1996年由美國年由美國Applied Biosystems公司推出的一公司推出的一種新技術(shù)。是指在種新技術(shù)。是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)利用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 與傳統(tǒng)與傳統(tǒng)PCR一樣用同樣的基本成分：一樣用同樣的基本成分： 雙鏈雙鏈DNA，引物，引物，dN

3、TPs，PCR buffer，Taq酶等。酶等。 與傳統(tǒng)與傳統(tǒng)PCR一樣，反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進(jìn)行：一樣，反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進(jìn)行： 雙鏈雙鏈DNA模板變性模板變性 引物與模板堿基互補(bǔ)引物與模板堿基互補(bǔ)-退火退火 引物延伸引物延伸 新的擴(kuò)增片段新的擴(kuò)增片段基本原理基本原理 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)為產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)為J 型型，符合，符合2 N 方程方程(其中其中 N 為為 PCR 的

4、循環(huán)次數(shù)的循環(huán)次數(shù))，但實(shí)際上擴(kuò)增曲線為，但實(shí)際上擴(kuò)增曲線為 S 型型。 在在 PCR 反應(yīng)早期，不能將反應(yīng)早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入別，之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)指數(shù)期期、線性期線性期和最終的和最終的平臺期平臺期，因此可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上因此可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上檢測檢測 PCR 產(chǎn)物的量，并由此產(chǎn)物的量，并由此推斷起始模板含量。推斷起始模板含量。主要類型主要類型根據(jù)根據(jù)Quantitative real-time PCR的化學(xué)發(fā)光原理可以的化學(xué)發(fā)光原理可以分為分為2大類：大類：1、探針類探針類 包括包括TaqMan探針和分子信標(biāo)，利

5、用與靶序列特探針和分子信標(biāo)，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；2、非探針類非探針類 其中包括如其中包括如SYBR Green I或者特殊設(shè)計(jì)的引或者特殊設(shè)計(jì)的引物物 (如如 LUX Primers) 通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。Taqman 探針法探針法 Taqman 探針法是最早用于定量的方法。探針法是最早用于定量的方法。 特異性的熒光探針特異性的熒光探針：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)：該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)端標(biāo)記有熒光報(bào)

6、告基團(tuán)(Reporter, R)，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)。該探針在該探針在 PCR過程中不能被延伸。過程中不能被延伸。 每擴(kuò)增一條每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號的強(qiáng)度就產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號的強(qiáng)度就代表了模板代表了模板DNA的拷貝數(shù)。因此該技術(shù)可對模板進(jìn)行的拷貝數(shù)。因此該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確準(zhǔn)確定量定量。Taqman 探針法探針法SYBR Green 法法 SYBR Green I 是一種能結(jié)是一種能結(jié)合到合到 dsDNA 小溝部位

7、的小溝部位的具有綠色激發(fā)波長的染料，具有綠色激發(fā)波長的染料，與雙鏈與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。常理想。SYBR Green 法法是非特異性檢測擴(kuò)增序列是非特異性檢測擴(kuò)增序列的代表。的代表。SYBR Green 法法局限性：局限性：可與所有雙鏈可與所有雙鏈DNA序列結(jié)合，從而降低了特異性。序列結(jié)合，從而降低了特異性。 為避免假陽性信號，應(yīng)使用為避免假陽性信號，應(yīng)使用熔解曲線熔解曲線（melting curve） 或凝膠分析來檢查非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成?；蚰z分析來檢查非特異性產(chǎn)物的構(gòu)成。熔解曲線熔

8、解曲線 擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加溫度同時(shí)監(jiān)測每一步的熒光信號溫度同時(shí)監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線。隨著反應(yīng)中雙來產(chǎn)生熔解曲線。隨著反應(yīng)中雙鏈鏈DNA的變性，熒光染料又恢的變性，熒光染料又恢復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號降低，復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號降低，用熒光信號改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)用熒光信號改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解熔解溫度溫度上有一特征峰（上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈雙鏈解鏈50%的溫度），用這個(gè)的溫度），用這個(gè)特征峰可將特異產(chǎn)物與其他產(chǎn)物特征峰可將特異產(chǎn)物與其他產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因?yàn)樗鼈內(nèi)缫锒垠w區(qū)分

9、開，因?yàn)樗鼈冊诓煌瑴囟热劢?。在不同溫度熔解。熔解曲線熔解曲線如果熔解曲線做出來的只有單峰，而且出峰的位如果熔解曲線做出來的只有單峰，而且出峰的位置所對應(yīng)的退火溫度與所需退火溫度相同，那么置所對應(yīng)的退火溫度與所需退火溫度相同，那么該熒光數(shù)據(jù)有效。該熒光數(shù)據(jù)有效。只有一個(gè)的峰只有一個(gè)的峰= =沒沒有多余的產(chǎn)物有多余的產(chǎn)物熒光熒光溫度溫度可能是引物二聚體可能是引物二聚體SYBR Green法和法和Taqman探針法比較探針法比較Quantitative Real-time PCR與常規(guī)PCR的比較熒光熒光PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)預(yù)防預(yù)防RNA酶的污染：酶的污染： 全程佩

10、戴一次性手套、口罩，少說話。全程佩戴一次性手套、口罩，少說話。 使用使用DEPC（焦碳酸二乙酯）（焦碳酸二乙酯）處理并滅菌的器材。處理并滅菌的器材。Mix配制：配制： 試劑不要反復(fù)凍融，若經(jīng)常使用，最好放在試劑不要反復(fù)凍融，若經(jīng)常使用，最好放在4度。度。 每管或每孔都要換新槍頭！每管或每孔都要換新槍頭！ 所有成分加完后，離心去除氣泡。所有成分加完后，離心去除氣泡。Real-time PCR引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則Taqman探針設(shè)計(jì)原則探針設(shè)計(jì)原則G反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化誤差控制誤差控制配置預(yù)混體系配置預(yù)混體系設(shè)置設(shè)置 生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體）生物學(xué)重復(fù)（不同個(gè)體） 技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）技術(shù)性重

11、復(fù)（復(fù)孔）陰性對照陰性對照實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng) 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀儀普通PCR儀7500型熒光定量儀工作流程工作流程無論是哪個(gè)型號，所有的定量無論是哪個(gè)型號，所有的定量PCR儀器都有三個(gè)儀器都有三個(gè)共同的組成部分：共同的組成部分：在擴(kuò)增的過程中，熒光信號隨著在擴(kuò)增的過程中，熒光信號隨著PCR產(chǎn)物的增加產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)。而增強(qiáng)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，定量每個(gè)循環(huán)結(jié)束后，定量PCR儀器通過不同的濾光儀器通過不同的濾光片記錄熒光信號的增加。片記錄熒光信號的增加。最后，定量最后，定量PCR軟件計(jì)算出數(shù)據(jù)，用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的軟件計(jì)算出數(shù)據(jù)，用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。分析?；虮磉_(dá)數(shù)

12、據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 常見參數(shù)常見參數(shù) 基線基線(baseline)：一般來講，第一般來講，第3-15個(gè)循環(huán)的熒光值就是基線。個(gè)循環(huán)的熒光值就是基線。 熒光閾值熒光閾值(threshold)：PCR反應(yīng)的前反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：倍，即：threshold = 10 SD cycle 3-15 。 Ct 值值(Ct value)：C代表Cycle，t代表threshold，因此也稱閾值循環(huán)(threshold cycle)。Ct值

13、的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。所以Ct值是一個(gè)沒有單位的參數(shù)。影響影響Ct值的關(guān)鍵因素值的關(guān)鍵因素 模板濃度模板濃度：模板濃度是決定：模板濃度是決定Ct值的最主要因素。控制在一個(gè)值的最主要因素?？刂圃谝粋€(gè)合適范圍內(nèi)，使合適范圍內(nèi)，使Ct值在值在15-35之間。之間。 反應(yīng)液成分的影響反應(yīng)液成分的影響：任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響響比如溶液的比如溶液的pH值和鹽濃度。值和鹽濃度。 PCR反應(yīng)的效率反應(yīng)的效率：PCR反應(yīng)的效率也會影響反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在值。在PCR擴(kuò)擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與增效率低的

14、條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。之間都是可以接受的。評估實(shí)時(shí)定量評估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果反應(yīng)的效果數(shù)據(jù)分析方法數(shù)據(jù)分析方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2CT法法 要使要使CT計(jì)算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)計(jì)算方法有效，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等。看兩個(gè)反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的增效率必須相等。看兩個(gè)

15、反應(yīng)是否具有相同的擴(kuò)增效率的方法是看他們模板濃度梯度稀釋后擴(kuò)增產(chǎn)物方法是看他們模板濃度梯度稀釋后擴(kuò)增產(chǎn)物CT如何變?nèi)绾巫兓??；?。y = -3.3168x + 24.989R2 = 0.992Quantitative Real-time PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用 Quantitative Real-time PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)技術(shù)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床疾病診斷、疾病研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。科學(xué)研究、臨床疾病診斷、疾病研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用很多，發(fā)揮重要的作用，包括在病毒在臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)用很多，發(fā)揮重要的作用，包括在病毒檢測診斷方面的應(yīng)用、在遺傳性疾病診斷方面的應(yīng)用、檢

16、測診斷方面的應(yīng)用、在遺傳性疾病診斷方面的應(yīng)用、在腫瘤診斷方面的應(yīng)用等。在腫瘤診斷方面的應(yīng)用等。 在在分子生物學(xué)分子生物學(xué)方面的應(yīng)用主要是：方面的應(yīng)用主要是： 1、基因表達(dá)的研究、基因表達(dá)的研究 2、基因突變及多態(tài)性研究、基因突變及多態(tài)性研究 3、轉(zhuǎn)基因研究（、轉(zhuǎn)基因研究（DNA或或RNA的定量檢測）的定量檢測）1、基因表達(dá)的研究、基因表達(dá)的研究 在基因表達(dá)的研究中，常用的方法有在基因表達(dá)的研究中，常用的方法有 Northern 印跡，印跡，RT-PCR 定量法等，而定量法等，而 Quantitative Real-time PCR 比比 Northern 印跡、印跡、RT-PCR 定量法要方便

17、、快速、準(zhǔn)確的多。定量法要方便、快速、準(zhǔn)確的多。Quantitative Real-time PCR能檢測各種組織細(xì)胞中能檢測各種組織細(xì)胞中 基因的表達(dá)豐度，從而分析基因的表達(dá)調(diào)控、監(jiān)控基因的表達(dá)豐度，從而分析基因的表達(dá)調(diào)控、監(jiān)控 mRNA 表達(dá)模式、檢測組織中少量存在的基因、跟蹤細(xì)表達(dá)模式、檢測組織中少量存在的基因、跟蹤細(xì) 胞群體中克隆、定量分析基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平胞群體中克隆、定量分析基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平 等。等。 2、基因突變及多態(tài)性研究、基因突變及多態(tài)性研究 擴(kuò)增擴(kuò)增 DNA 的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主細(xì)胞的核苷酸序列不需要分子克隆、宿主細(xì)胞 內(nèi)的生長準(zhǔn)備，即可在媒介

18、中的生物分子純化過程中直接內(nèi)的生長準(zhǔn)備，即可在媒介中的生物分子純化過程中直接測得，因此測得，因此 Quantitative Real-time PCR 可用于檢測特可用于檢測特異突變基因。利用異突變基因。利用Quantitative Real-time PCR 和有關(guān)和有關(guān) 的間接測序方法，可對已知的間接測序方法，可對已知 DNA 序列進(jìn)行基因突變及多序列進(jìn)行基因突變及多 態(tài)性的分析。如對已知態(tài)性的分析。如對已知 DNA 序列進(jìn)行位置突變基因及序序列進(jìn)行位置突變基因及序 列多態(tài)性的定位，擴(kuò)增列多態(tài)性的定位，擴(kuò)增 DNA 限制性位點(diǎn)檢測遺傳變異限制性位點(diǎn)檢測遺傳變異 等。等。3、轉(zhuǎn)基因研究、轉(zhuǎn)基因研究 有研究者用有研究者用 Quantitative Real-time PCR 檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因拷貝數(shù)，定量分析的外源基因拷貝數(shù)與用水稻的外源基因拷貝數(shù)，定量分析的外源基因拷貝數(shù)與用 so