1、劉小紅劉小紅350783409: 350783409生命科學(xué)學(xué)科院生命科學(xué)學(xué)科院 生物技術(shù)教研室生物技術(shù)教研室 實(shí)驗(yàn)一、顯微鏡的構(gòu)造原理及運(yùn)用方法實(shí)驗(yàn)一、顯微鏡的構(gòu)造原理及運(yùn)用方法 實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞凝集景象的察看實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞凝集景象的察看 實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞膜的浸透性實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞膜的浸透性 實(shí)驗(yàn)四、葉綠體的分別及熒光景象的察看實(shí)驗(yàn)四、葉綠體的分別及熒光景象的察看 實(shí)驗(yàn)五、線粒體的分別及察看實(shí)驗(yàn)五、線粒體的分別及察看 實(shí)驗(yàn)六、實(shí)驗(yàn)六、DNA的的Fulgen染色法染色法 實(shí)驗(yàn)七、植物細(xì)胞骨架的察看實(shí)驗(yàn)七、植物細(xì)胞骨架的察看 實(shí)驗(yàn)八、實(shí)驗(yàn)八、RNA的的Brachet反響反響 實(shí)驗(yàn)九、

2、植物的組織培育實(shí)驗(yàn)九、植物的組織培育一根本構(gòu)造一根本構(gòu)造二放大原理及光路圖二放大原理及光路圖三性能和質(zhì)量三性能和質(zhì)量四運(yùn)用方法四運(yùn)用方法五運(yùn)用本卷須知五運(yùn)用本卷須知1、機(jī)械部分1鏡座2鏡柱3鏡臂4鏡筒5轉(zhuǎn)換器6載物臺(tái)7調(diào)理器2、照明部分1反光鏡2聚光器3光圈 3、光學(xué)部分1目鏡5，10， 152物鏡 低：10或 15；高：40或 45；油 ：100普通顯微鏡的構(gòu)造表示圖左：單目；右：雙目1、 目鏡； 2、鏡筒；3、物鏡轉(zhuǎn)換器；4、物鏡；5、通光孔；6、聚光器；7、光圈；8、反光鏡；9、粗調(diào)理器；10；細(xì)調(diào)理器；11、鏡臂；12、移片器；13、載物臺(tái)；14、傾斜關(guān)節(jié)；15、鏡柱；16、鏡座；17

3、、 標(biāo)本挪動(dòng)器螺旋；18、燈室 細(xì)胞中期圖片細(xì)胞中期圖片左：低倍鏡；右：高倍鏡左：低倍鏡；右：高倍鏡1、分辨率、分辨率resolution) 指能分辨出的相鄰兩個(gè)點(diǎn)間最小間隔的才干。指能分辨出的相鄰兩個(gè)點(diǎn)間最小間隔的才干。r = 0.61 / (n sin) r：分辨力；：分辨力； ：照明光源的波長；：照明光源的波長； n：介質(zhì)的折射率；：介質(zhì)的折射率； ：樣品對物鏡孔徑角的半角；：樣品對物鏡孔徑角的半角； 0.61：恒定的參數(shù)。：恒定的參數(shù)。注：注：n sin的量稱為物鏡的數(shù)值孔徑，縮寫為的量稱為物鏡的數(shù)值孔徑，縮寫為NA；r越小，那么分辨率越高。要增大數(shù)值孔徑，孔徑角越小，那么分辨率越高。

4、要增大數(shù)值孔徑，孔徑角無法增大，只能增大介質(zhì)的折高壓率，這樣就誕生無法增大，只能增大介質(zhì)的折高壓率，這樣就誕生了水浸物鏡和油浸物鏡，目前最大了水浸物鏡和油浸物鏡，目前最大NA值可達(dá)值可達(dá)1.4。透鏡的焦距透鏡的焦距透鏡的角孔徑透鏡的角孔徑2、放大率、放大率magnification)指最終成像的大小與原物體大小的比值。指最終成像的大小與原物體大小的比值?？偡糯舐士偡糯舐?= 物鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù) 目鏡放大倍數(shù)目鏡放大倍數(shù)空氣介質(zhì)：可達(dá)空氣介質(zhì)：可達(dá)1000倍倍油介質(zhì)通常是香柏油：可達(dá)油介質(zhì)通常是香柏油：可達(dá)1400倍倍分辨本領(lǐng)分辨本領(lǐng)光源光源透鏡透鏡是否需真空是否需真空光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡

5、300 nm可見光可見光玻璃透鏡玻璃透鏡否否200 nm (油）油）可見光可見光玻璃透鏡玻璃透鏡否否100 nm紫外光紫外光石英透鏡石英透鏡否否電子顯微鏡電子顯微鏡0.1 nm電子束電子束電磁透鏡電磁透鏡是是電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的根本區(qū)別電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的根本區(qū)別1、用前的預(yù)備任務(wù)、用前的預(yù)備任務(wù)1取顯微鏡；取顯微鏡；2完好性檢查完好性檢查2、低倍鏡的運(yùn)用、低倍鏡的運(yùn)用1預(yù)備；預(yù)備；2對光；對光；3放標(biāo)本片放標(biāo)本片4調(diào)理焦距調(diào)理焦距3、高倍鏡的運(yùn)用、高倍鏡的運(yùn)用4、油鏡的運(yùn)用方法、油鏡的運(yùn)用方法5、運(yùn)用練習(xí)、運(yùn)用練習(xí)1 1、持鏡時(shí)必需是右手握臂、左手托座的姿態(tài)，不可單手提取，以免零件零

6、落或碰撞到、持鏡時(shí)必需是右手握臂、左手托座的姿態(tài)，不可單手提取，以免零件零落或碰撞到其它地方。其它地方。 2 2、輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的邊緣，應(yīng)放在距邊緣、輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的邊緣，應(yīng)放在距邊緣10cm10cm處，以免碰翻落處，以免碰翻落地。地。3 3、察看有液體的暫時(shí)標(biāo)本時(shí)要加蓋片，以免液體污染鏡頭和顯微鏡。、察看有液體的暫時(shí)標(biāo)本時(shí)要加蓋片，以免液體污染鏡頭和顯微鏡。4 4、粗、細(xì)調(diào)理鈕要配合運(yùn)用，不能過度調(diào)理，調(diào)時(shí)側(cè)面凝視鏡筒下降，以免壓壞標(biāo)本、粗、細(xì)調(diào)理鈕要配合運(yùn)用，不能過度調(diào)理，調(diào)時(shí)側(cè)面凝視鏡筒下降，以免壓壞標(biāo)本和鏡頭。和鏡頭。5 5、堅(jiān)持顯微鏡的清潔，光

7、學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，、堅(jiān)持顯微鏡的清潔，光學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，切忌口吹手抹或用布擦，機(jī)械部分用布擦拭。機(jī)械部分用布擦拭。6 6、水滴、酒精或其它藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺(tái)，假設(shè)沾污應(yīng)立刻用擦鏡紙擦凈。、水滴、酒精或其它藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺(tái)，假設(shè)沾污應(yīng)立刻用擦鏡紙擦凈。7 7、放置玻片標(biāo)本時(shí)要對準(zhǔn)通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。、放置玻片標(biāo)本時(shí)要對準(zhǔn)通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。8 8、要養(yǎng)成兩眼同時(shí)睜開察看的習(xí)慣，以左眼察看視野，右眼用以繪圖。、要養(yǎng)成兩眼同時(shí)睜開察看的習(xí)慣，以左眼察看視野，右眼用以繪圖。9 9、

8、不要隨意取下目鏡，以防止塵土落入物鏡，也不要恣意裝配各種零件，以防損壞。、不要隨意取下目鏡，以防止塵土落入物鏡，也不要恣意裝配各種零件，以防損壞。1010、運(yùn)用終了后，必需復(fù)原才干放回鏡箱內(nèi)，其步驟是：取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)器使、運(yùn)用終了后，必需復(fù)原才干放回鏡箱內(nèi)，其步驟是：取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)器使鏡頭分開通光孔，下降鏡臺(tái)，平放反光鏡，下降集光器鏡頭分開通光孔，下降鏡臺(tái)，平放反光鏡，下降集光器( (但不要接觸反光鏡但不要接觸反光鏡) )、封鎖、封鎖光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實(shí)驗(yàn)臺(tái)柜內(nèi)。最后填寫運(yùn)用登記表。光圈，推片器回位，蓋上綢布和外罩，放回實(shí)驗(yàn)臺(tái)柜內(nèi)。最后填寫運(yùn)用登記表。( (注：

9、反光鏡通常應(yīng)垂直放，但有時(shí)因集光器沒提至應(yīng)有高度，鏡臺(tái)下降時(shí)會(huì)碰壞注：反光鏡通常應(yīng)垂直放，但有時(shí)因集光器沒提至應(yīng)有高度，鏡臺(tái)下降時(shí)會(huì)碰壞光圈，所以這里改為平放光圈，所以這里改為平放) ) 根據(jù)光學(xué)上的丁道爾Tyndoll景象，微塵細(xì)粒在強(qiáng)光直射經(jīng)過的情況下，不能為人眼所見，這是由于光線過強(qiáng)及繞射景象等要素，因此看不到微塵的籠統(tǒng)。假設(shè)把光線斜射它們，那么由于光的反射或衍射的結(jié)果，微塵細(xì)粒似乎增大了體積，而為人眼可見。 據(jù)此原理，使光不直接經(jīng)過樣品而是斜射到樣品上，即可在暗視野下察看細(xì)微粒子。2、構(gòu)造及光路、構(gòu)造及光路 光源的中央光束被阻撓，不能由下而上地經(jīng)過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。從而光線改動(dòng)途徑，傾斜地

10、照在標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射、衍射或散射，散射和衍射光線進(jìn)入物鏡內(nèi)，因此整個(gè)視野是黑暗的。在暗視野中，察看到的是被檢物體的衍射光和散射光的圖像，并非物體的本身，所以只能看見物體的存在、運(yùn)動(dòng)及外部形狀，不能分辨其內(nèi)部構(gòu)造。3、運(yùn)用及運(yùn)用本卷須知、運(yùn)用及運(yùn)用本卷須知 能察看到能察看到0.20.004 m的亞微顆粒，的亞微顆粒，適宜察看活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液適宜察看活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。 暗場鏡檢要求載玻片和蓋玻片必需無疵暗場鏡檢要求載玻片和蓋玻片必需無疵痕而無塵土，物鏡前透鏡也必需清潔無塵。痕而無塵土，物鏡前透鏡也必需清潔無塵。 載玻片與

11、蓋玻片的厚度應(yīng)符合規(guī)范，載載玻片與蓋玻片的厚度應(yīng)符合規(guī)范，載玻片太厚，那么聚光聚的焦點(diǎn)落在載玻片玻片太厚，那么聚光聚的焦點(diǎn)落在載玻片內(nèi)，而達(dá)不到被檢物體的平面上，蓋玻片內(nèi)，而達(dá)不到被檢物體的平面上，蓋玻片太厚，在運(yùn)用油鏡頭的情況下，由于物鏡太厚，在運(yùn)用油鏡頭的情況下，由于物鏡的任務(wù)間隔很短，甚至無法調(diào)焦，而看不的任務(wù)間隔很短，甚至無法調(diào)焦，而看不到或看不清被檢物體。到或看不清被檢物體。 由于細(xì)胞不同部位的折射率不同，當(dāng)光經(jīng)過細(xì)由于細(xì)胞不同部位的折射率不同，當(dāng)光經(jīng)過細(xì)胞的不同部位時(shí)有不同程度的滯后，這樣就產(chǎn)生了胞的不同部位時(shí)有不同程度的滯后，這樣就產(chǎn)生了相位差。相位差。 另外一束光經(jīng)過物體同一部

12、位后構(gòu)成兩束光，另外一束光經(jīng)過物體同一部位后構(gòu)成兩束光，一束直行構(gòu)成直射光，另一束斜行或繞行構(gòu)成衍射一束直行構(gòu)成直射光，另一束斜行或繞行構(gòu)成衍射光，衍射光的相位相對落后。當(dāng)二者相遇時(shí)又發(fā)生光，衍射光的相位相對落后。當(dāng)二者相遇時(shí)又發(fā)生干涉，合光振幅取決于兩者的相位。干涉，合光振幅取決于兩者的相位。 相差顯微鏡就是利用光的衍射和干涉特性使相相差顯微鏡就是利用光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比，使肉眼得位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比，使肉眼得以察看到無色透明物體中的細(xì)節(jié)。以察看到無色透明物體中的細(xì)節(jié)。光學(xué)原理光路圖光路圖 能將直射光視野中的背景光與經(jīng)物能將直射光視野中的背景

13、光與經(jīng)物體衍射的光分開；能將大約一半的波長從相位體衍射的光分開；能將大約一半的波長從相位中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強(qiáng)中除去，使之不能發(fā)生相互作用，從而引起強(qiáng)度的變化。加上利用了光的衍射和干涉特性使度的變化。加上利用了光的衍射和干涉特性使相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比，所相位差變成振幅差，表現(xiàn)為明與暗的對比，所以能察看無色、透明、活細(xì)胞中的構(gòu)造。以能察看無色、透明、活細(xì)胞中的構(gòu)造。1 1、原理、原理 人眼不可見的一定波長的紫外線人眼不可見的一定波長的紫外線作光源照射被檢物體，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒作光源照射被檢物體，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏

14、色的熒光后，再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大來進(jìn)展鏡檢。再經(jīng)顯微鏡成像系統(tǒng)放大來進(jìn)展鏡檢。 熒光顯微術(shù)是生物，醫(yī)學(xué)中的重?zé)晒怙@微術(shù)是生物，醫(yī)學(xué)中的重要研討手段，如對生物組織、生理、病要研討手段，如對生物組織、生理、病理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學(xué)等諸方理、微生物、醫(yī)藥、食品、化學(xué)等諸方面的鑒定等。面的鑒定等。2、根本構(gòu)造、根本構(gòu)造 由普通光學(xué)顯微鏡加上一些由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件如熒光光源、激發(fā)濾片、附件如熒光光源、激發(fā)濾片、阻斷濾片等的根底上組成的。阻斷濾片等的根底上組成的。 每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。更長

15、的可見熒光。 熒光具有專注熒光具有專注性，普通比激發(fā)光弱，為能察看性，普通比激發(fā)光弱，為能察看到專注的熒光，在物鏡后面需加到專注的熒光，在物鏡后面需加阻斷或壓制濾光片。它的作阻斷或壓制濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻撓激發(fā)光用有二：一是吸收和阻撓激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷進(jìn)入目鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特異的熒光眼睛；二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專注的熒光顏色。透過，表現(xiàn)出專注的熒光顏色。293 3、特點(diǎn)、特點(diǎn)1 1光源為紫外線，光源為紫外線，波長較短；波長較短；2 2分辨力高于普分辨力高于普通顯微鏡；通顯微鏡；3 3有兩個(gè)特殊的有兩個(gè)特殊的濾光片；濾光片；4 4

16、照明方式通常照明方式通常為落射式。為落射式。4、分類、分類 據(jù)其光路來分有據(jù)其光路來分有兩種：兩種：1透射式熒光顯透射式熒光顯微鏡微鏡2落射式熒光顯落射式熒光顯微鏡微鏡Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 1翻開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才翻開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才干到達(dá)最亮點(diǎn)。干到達(dá)最亮點(diǎn)。 2透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡

17、裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片雙色束分別器阻斷濾片的插塊。雙色束分別器阻斷濾片的插塊。 3用低倍鏡察看，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)用低倍鏡察看，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)理安裝，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的理安裝，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。中央。 4放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可察看。放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可察看。 運(yùn)用中應(yīng)留意：運(yùn)用中應(yīng)留意：未裝濾光片不要用眼直接察看，以免引起眼的損傷；未裝濾光片不要用眼直接察看，以免引起眼的損傷；用油鏡察看標(biāo)本時(shí)，必需用無熒光的特殊油鏡；高用油鏡察看標(biāo)本時(shí)，必需用無

18、熒光的特殊油鏡；高壓汞燈封鎖后不能立刻重新翻開，需經(jīng)壓汞燈封鎖后不能立刻重新翻開，需經(jīng)5分鐘后才分鐘后才干再啟動(dòng)，否那么會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。干再啟動(dòng)，否那么會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。 組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺(tái)之下，后者在載物臺(tái)之上，用于察看培育的活細(xì)胞。載物臺(tái)之上，用于察看培育的活細(xì)胞。 集光器和載物臺(tái)間的任務(wù)間隔提高集光器和載物臺(tái)間的任務(wù)間隔提高后，可放置培育、培育瓶等容器，直接后，可放置培育、培育瓶等容器，直接對培育的細(xì)胞進(jìn)展照明和察看。對培育的細(xì)胞進(jìn)展照明和察看。38五激光共聚焦

19、掃描顯微境五激光共聚焦掃描顯微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM)種類種類波長波長氬氟激光（紫外光）193氪氟激光（紫外光）248氙氯激光（紫外光）308氮激光（紫外光）337氬激光（藍(lán)光）488氬激光（綠光）514氦氖激光（綠光）543氦氖激光（紅光）633激光種類及波長激光種類及波長40 用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。用激光作光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造。能顯示細(xì)胞樣品的立體構(gòu)造。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3 3倍。倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，構(gòu)成用途類似熒光顯

20、微鏡，但能掃描不同層次，構(gòu)成立體圖像。立體圖像。優(yōu) 點(diǎn)41LCSM Image of a Xenopus Melanophore 爪蟾黑色素細(xì)胞爪蟾黑色素細(xì)胞 microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)一透射電子顯微鏡一透射電子顯微鏡二掃描電子顯微鏡二掃描電子顯微鏡三掃描透射電子顯微鏡三掃描透射電子顯微鏡 電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理根本一樣，所電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理根本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場作透鏡；不同的是前者用電子束作光源，用電磁場作透鏡；而后者以可見光或紫外線為光源。而后者以可見光或紫

21、外線為光源。 另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。左右的超薄切片。 電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍、由電子電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍、由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。部分構(gòu)成。特點(diǎn)特點(diǎn)45不同光線的波長不同光線的波長47一透射電子顯微鏡一透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEMtransmission electron microscope, TEM48 以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓并且波長與加速電壓( (通常通常50120KV)50120KV)的平方根成反比。的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5 5部分構(gòu)成。部分構(gòu)成。 分辨力分辨力0.2nm0.2nm，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。，放大倍數(shù)可達(dá)百萬倍。 用于察看超微構(gòu)造用于察看超微構(gòu)