1、年產(chǎn)3噸堿性蛋白酶發(fā)酵工藝設(shè)計王鑫（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院）摘要 在現(xiàn)代食品工業(yè)中, 酶的應(yīng)用幾乎涉及到食品加工的各個領(lǐng)域。隨著酶制劑日益廣泛的應(yīng)用,經(jīng)濟效益顯著。蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈的一類酶的總稱, 而堿性蛋白酶則適宜在堿性條件( pH911) 下水解動植物蛋白質(zhì), 廣泛存在于動植物及微生物中。設(shè)計中首先根據(jù)參考資料選定了堿性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)的具體工藝流程，通過物料衡算確定需要 立方米發(fā)酵罐 臺和 立方米種子罐 臺，在此基礎(chǔ)上得出發(fā)酵工段所需要的各種原料量，通過能量衡算確定水、無菌空氣和蒸汽等的消耗量。然后對主要設(shè)備進行計算和選型，得出發(fā)酵罐、種子罐及通用設(shè)備、非標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備等的結(jié)構(gòu)尺寸、冷卻裝

2、置、傳動裝置，根據(jù)工藝要求確定罐的附屬設(shè)備和輔助設(shè)備以及發(fā)酵過程中的優(yōu)化控制。根據(jù)計算結(jié)果，設(shè)計了兩張圖紙，分別為發(fā)酵罐裝配圖、工藝流程圖。關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶 發(fā)酵罐 種子罐 物料衡算1緒論11.1堿性蛋白酶概述11.2堿性蛋白酶的性質(zhì)11.3堿性蛋白酶的使用條件11.4堿性蛋白酶的保存11.5注意事項11.6堿性蛋白酶的主要應(yīng)用21.6.1在洗滌劑中的應(yīng)用21.6.2在皮革中的應(yīng)用21.6.3在飼料添加劑中的應(yīng)用31.6.4在紡織行業(yè)的應(yīng)用31.6.7在玉米深加工中的應(yīng)用31.7堿性蛋白酶的發(fā)展前景42設(shè)計任務(wù)42.1設(shè)計內(nèi)容42.2設(shè)計要求43堿性蛋白酶生產(chǎn)工藝選擇53.1生產(chǎn)工藝的選擇5

3、3.2工藝流程圖53.3工藝流程圖說明6菌種的制備63.3.2孢子的制備63.3.3種子的制備63.4菌種的改良63.5培養(yǎng)基的制備83.6滅菌的方法83.6.1濕熱滅菌83.6.2培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌93.6.3空氣除菌93.6.4無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)103.6.5無菌空氣的制備103.7發(fā)酵113.8分離純化124工藝計算124.1 堿性蛋白酶發(fā)酵工藝技術(shù)指標(biāo)124.2 工藝參數(shù)與基本物性數(shù)據(jù)的選取124.2.1 工藝參數(shù)124.2.2基本物性數(shù)據(jù)的選取134.3物料衡算134.4熱量衡算144.4.1 基準(zhǔn)溫度的選定144.4.2 連消塔的熱量衡算144.4.3 發(fā)酵罐的熱量衡算145分離干燥

4、145.1雙水相萃取145.2干燥156后記16參考文獻：171緒論1.1堿性蛋白酶概述堿性蛋白酶是由細(xì)菌原生質(zhì)體誘變選育出的地衣芽孢桿菌2709，經(jīng)深層發(fā)酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶，其主要成分為地衣芽孢桿菌蛋白酶，是一種絲氨酸型的內(nèi)切蛋白酶，它能水解蛋白質(zhì)分子肽鏈生成多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白酶的能力。生產(chǎn)工藝是采用微濾超濾膜分離、噴霧干燥或真空冷凍干燥等先進技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、釀造、洗滌、絲綢、制革等行業(yè)。堿性蛋白酶是目前市場上流行的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌去污能力，特別對血漬、汗?jié)n、奶漬、油漬等蛋白類污垢，具有獨特的洗滌效果。堿性蛋白酶在技術(shù)采用細(xì)菌原生質(zhì)體誘變

5、處理方法，從國內(nèi)堿性蛋白菌生產(chǎn)菌2709枯草桿菌中研究選育出若干穩(wěn)定高性能菌株，在后處理上，采用去渣鹽析沉淀法，減少了蛋白酶的雜質(zhì)含量和產(chǎn)品特有的氣味，提高了溶解速度，與洗滌劑有更好的配伍性，延長了保質(zhì)期。目前，在世界范圍內(nèi)蛋白分解酶是工業(yè)酶種中用得最多的一種酶，約占酶總量的60%，其中堿性蛋白酶就占25%.它在商業(yè)中的巨大應(yīng)用前景及在基礎(chǔ)研究中的重要作用，吸引著國際國內(nèi)的許多公司及研究單位競相對其進行多方面的研究。1.2堿性蛋白酶的性質(zhì) 堿性蛋白酶外觀為褐色粉末，有酵曲的特殊臭味，能夠分解蛋白質(zhì)分子中的肽鍵成為小分子的氨基酸和肽。堿性蛋白酶是由造育的地衣芽孢桿菌發(fā)酵而得，主要成分為枯草桿菌蛋

6、白酶，是一種內(nèi)切酶，催化部位為絲氨酸，分子量約為27300.1.3堿性蛋白酶的使用條件底物濃度1025%，溫度5060，pH值911，反應(yīng)時間36小時（根據(jù)要求可長可短），添加酶0.030.06%（以水解溶液重量計）。1.4堿性蛋白酶的保存5保藏，保質(zhì)期一年；25儲存，酶活保存期至少3個月以上。1.5注意事項（1）此產(chǎn)品可完全溶于水，使用安全可靠。操作時請勿直接與酶制劑接觸，若有接觸需及時用清水沖洗。（2）原包裝打開后盡快食用，剩余部分需扎口保存。（3）本品在貯存中要避免雨淋和曝曬，禁止與有毒有害物質(zhì)混運混存。1.6堿性蛋白酶的主要應(yīng)用1.6.1在洗滌劑中的應(yīng)用日常生活中遇到的污垢，特別是衣服

7、上的污垢組成是十分復(fù)雜的，一般來說，主要有塵土的微粒、人體分泌的皮脂和汗液、食物的汁液和殘余物等，有機污垢是以蛋白質(zhì)與纖維結(jié)合的方式存在的。用于洗滌這些污物的洗滌劑是由表面活性劑、純堿、水玻璃(硅酸鹽)、三磷酸鹽等配制而成，洗滌時水溶液顯示出較高的堿性pH一般在9-11之間，在這種條件下，堿性蛋白酶正好可以發(fā)揮其催化活性，催化污物中的蛋白質(zhì)水解，使復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解成結(jié)構(gòu)簡單、相對分子量較小的水溶性膚，或者進一步分解為氨基酸。這樣，原來粘在衣物上的其它污物也可以一起被洗下來。在整個洗滌過程中，堿性蛋白酶可反復(fù)起分解蛋白質(zhì)的作用，只是酶活越來越低。1.6.2在皮革中的應(yīng)用我國皮革工業(yè)資源豐富，發(fā)展

8、十分迅速，豬、羊皮產(chǎn)量居世界之首。豬、牛、羊皮制革時，首先要除去皮上的毛，然后才能進一步加工蹂制成革。過去脫毛工藝沿用石灰、硫化鈉浸漬，不僅時間長，工序多，而且勞動強度大，污染嚴(yán)重。采用蛋白酶脫毛是利用酶分解毛、表皮同真皮層連接處的蛋白質(zhì)，從而使毛同皮的聯(lián)結(jié)松開而脫毛。目前，我國的皮革制品不僅滿足了國內(nèi)市場的需求，還大量出口創(chuàng)匯。另外，在豬皮加工的包酶階段，因皮液系統(tǒng)pH值約在10士0.5之間，故常用堿性蛋白酶進行局部處理1.6.3在飼料添加劑中的應(yīng)用豬、禽等單胃動物消化道的內(nèi)源酶系不全;幼齡畜禽缺乏淀粉酶、糖化酶和蛋白酶：處于疾病的畜禽，其內(nèi)源酶(如淀粉酶、蛋白酶等)急劇下降。動物飼料是以淀

9、粉、蛋白質(zhì)等大分子化合物作為營養(yǎng)源，不同動物消化道中的酶系不同，數(shù)量也很有限，再加上飼料在消化道中停留的時間一般都很短，飼料往往未被充分消化就隨糞便排出體外，造成部分浪費。據(jù)研究，不少動物對飼料的消化吸收率僅20%左右。在飼料中添加酶制劑就可以與動物內(nèi)源酶發(fā)揮協(xié)同作用，將難消化吸收的蛋白質(zhì)、淀粉等大分子化合物降解為氨基酸、膚、脈、單糖、寡糖等小分子物質(zhì)，從而提高飼料的消化率和利用率，并提高畜禽及魚類的生產(chǎn)性能，同時可以減少畜禽排泄物中氮、磷的排泄量，保護水體和土壤免受污染。飼用酶制劑多為復(fù)合酶，由非內(nèi)源消化酶和內(nèi)源消化酶兩大類組成。非內(nèi)源消化酶包括木聚糖酶、p-葡聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露

10、聚糖酶等，內(nèi)源消化酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。其中蛋白酶是主要成分，可將飼料中的蛋白質(zhì)分解多肽及游離氨基酸，從而提高飼料的利用率。1.6.4在紡織行業(yè)的應(yīng)用在紡織工業(yè)中應(yīng)用堿性蛋白酶可一定程度的取代強堿等有毒有害物質(zhì)，為減少污染、保護生態(tài)環(huán)境提供經(jīng)濟有效的方法。特別是在羊毛減量加工和絲綢精煉脫膠等方面具有廣泛應(yīng)用，使用堿性蛋白酶可以解決羊毛仿羊絨物質(zhì)的生硬、粗糙等問題，并能改善和提高絲綢與棉、麻、毛等纖維混紡產(chǎn)品的手感和風(fēng)格，增加羊毛產(chǎn)品的附加值。1.6.7在玉米深加工中的應(yīng)用玉米黃粉是玉米濕法淀粉廠的副產(chǎn)品，其中含有40%-60%的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)大部分是醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白。玉米

11、醇蛋白具有大區(qū)域的a-螺旋結(jié)構(gòu)，N-末端有很強的疏水性，是高憎水蛋白，因此只能溶于異丙酮和乙醇中，不溶于水。谷蛋白只溶于堿水溶液。因此與其它商業(yè)化蛋白源相比，玉米蛋白的疏水性使得其食品功能特性極差。要想使蛋白質(zhì)具有理想的食品功能，就必須使其成為水溶解狀態(tài)或處于較好的懸浮狀態(tài)。為了提高玉米蛋白的水溶性以制備一些特殊產(chǎn)品，用堿性蛋白酶修飾玉米蛋白使其成為可溶性膚的研究成為熱點。王梅谷等對堿性蛋白酶水解玉米蛋白的反應(yīng)動力學(xué)進行了研究，探索了酶法修飾玉米蛋白的可行性，在適宜的反應(yīng)體系中，可大幅度提高酶促玉米蛋白的溶解量。為玉米黃粉的食品工業(yè)應(yīng)用和飼料營養(yǎng)的特殊要求提供可靠的依據(jù)。玉米鼓質(zhì)白質(zhì)具有獨特的

12、氨基酸組成，使它成為多種生理活性功能膚的良好天然來源。1.7堿性蛋白酶的發(fā)展前景 蛋白酶是一種重要的工業(yè)用酶，占世界酶制劑銷售量的60%以上。上世紀(jì)五十年代蛋白酶的主要來源是植物的木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶和動物內(nèi)臟，而微生物來源的蛋白酶一經(jīng)研究，因具有培養(yǎng)簡便，耗時短，產(chǎn)量豐富等優(yōu)點，應(yīng)用尤為廣泛，被認(rèn)為是最重要的酶資源。水解蛋白的最適PH在堿性范圍內(nèi)的蛋白酶稱為堿性蛋白酶。它在工業(yè)上具有巨大的應(yīng)用潛力，如洗滌劑、皮革制造、食品加工、制藥以及廢物處理等工業(yè)中，堿性蛋白酶的使用能顯著改善產(chǎn)品品質(zhì)，大大減少了對環(huán)境的污染，節(jié)約成本，為傳統(tǒng)的行業(yè)和生產(chǎn)帶來了一場革命。尤其是作為無磷洗衣粉的添加劑使用，

13、已使堿性蛋白酶商業(yè)制劑的銷售占整個蛋白酶市場的1/3。由于堿性蛋白酶作用環(huán)境的特殊性，要求其在極端的條件下具有較高的蛋白質(zhì)水解活力。其克服不良環(huán)境的能力愈強，應(yīng)用愈廣泛，愈能耐受惡劣的工業(yè)條件。2設(shè)計任務(wù)2.1設(shè)計內(nèi)容包括菌種選育、培養(yǎng)基的設(shè)計及滅菌、空氣除菌（如為需氧發(fā)酵）、種子的擴大培養(yǎng)、發(fā)酵過程中的控制參數(shù)和下游加工等，并由此形成一套完整的生產(chǎn)工藝。2.2設(shè)計要求按照年產(chǎn)量要求進行工藝設(shè)計，不得造成設(shè)備浪費，節(jié)約人力、物力和能源。進行簡單的物料衡算。繪制設(shè)計圖，要求至少一張工藝流程圖和一張主設(shè)備結(jié)構(gòu)圖，A4紙。3堿性蛋白酶生產(chǎn)工藝選擇3.1生產(chǎn)工藝的選擇采用液態(tài)深層發(fā)酵3.2工藝流程圖空

14、氣 菌種 培養(yǎng)基 離心分離 PEG鹽 預(yù)熱 冷凍干燥除菌 連消產(chǎn)品無菌空氣 二級種子 維持 降溫 發(fā)酵液 高壓勻質(zhì)機 離心分離廢液項 PEG水相3.3工藝流程圖說明菌種的制備選擇合適的產(chǎn)堿性蛋白酶的菌，經(jīng)過分離、選育、純化和鑒定后成為菌種。菌種可用沙土管保存，若有條件可采用液氮超低溫保存。孢子的制備（1）制備母液斜面孢子 將保存在冰箱中的沙土孢子，在無菌超凈工作臺上接種于以滅菌的斜面培養(yǎng)上于37培養(yǎng)9-10天，放入2-6冰箱中備用。（2）制備子瓶斜面孢子 將生長好且在冰箱存放一周以上的母瓶取出，制成菌懸液接種于子瓶斜面上，于37恒溫培養(yǎng)8-9天，培養(yǎng)好的子斜面?zhèn)葥u瓶效價合格后保存在2-6冰箱中

15、備用。種子的制備 其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲，并接種到發(fā)酵罐中，種子制備可用搖瓶培養(yǎng)后再接入種子罐進行逐級擴大培養(yǎng)。以微孔壓差法或打開接種口在火焰保護下接種。接種量視需要而定，在罐內(nèi)培養(yǎng)過程中需要攪拌和通入無菌空氣。控制罐溫、罐壓，并定時取樣做無菌試驗，觀察菌絲形態(tài)，測定種子液中發(fā)酵單位和進行生化分析，并觀察有無雜菌的情況種子質(zhì)量合格后移到發(fā)酵罐中。3.4菌種的改良菌種改良的方法有很多，最常用的方法有誘變育種。誘變育種的原理：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。誘變的方法：A:物

16、理方法：射線（紫外線、X 光線、Y 射線，中子線），激光 微束，離子束，微波，超聲波，熱力等。 B:化學(xué)誘變 常用方法：浸漬法、涂抹法、 滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。化學(xué)誘變劑有堿基類似物、烷化劑，移碼誘 變劑，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧 啶（5BU）、氮芥（Nm）。C: 生物方法：空間條件處理誘變，病原微生物誘變，轉(zhuǎn)基因誘變。出發(fā)菌株 誘變育種的過程 原種特性考察 斜面制備單孢子菌懸液做活菌計數(shù)，統(tǒng)計存活率誘變處理觀察菌株形態(tài)稀釋涂平板挑取單菌落傳種斜面搖瓶初篩挑出高產(chǎn)斜面埋制沙土管留種保藏傳種斜面復(fù)篩，搖瓶次數(shù)搖瓶復(fù)篩挑出高產(chǎn)菌株做穩(wěn)定性試驗和菌種特性考察放大罐試驗，中試考察大型

17、投產(chǎn)3.5培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基是指可供微生物細(xì)胞生長繁殖所需的一組營養(yǎng)物質(zhì)和原料，同時也為微生物生長提供除營養(yǎng)外的其他生長所需的條件。原則上必須含有細(xì)胞組成所必須原料；滿足一般生化反應(yīng)的基本條件（溫度、溶氧和批pH）；來源豐富、價格低廉、取材方便、質(zhì)量穩(wěn)定；培養(yǎng)基成分性質(zhì)穩(wěn)定不影響下游產(chǎn)品的提取加工。培養(yǎng)基按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長迅速,產(chǎn)生數(shù)量多而且優(yōu)質(zhì)的孢子,并且不會引起菌體變異。所以孢子培養(yǎng)基的配置要求如下：培養(yǎng)基的營養(yǎng)不要太豐富，特別是有機氮源要低一些，否則孢子不易形成。無機鹽的濃

18、度要適當(dāng),不然會影響孢子的顏色和數(shù)量。應(yīng)注意培養(yǎng)基的pH值和濕度。3.6滅菌的方法 常用的滅菌方法有：化學(xué)滅菌；射線滅菌；干熱滅菌；濕熱滅菌和過濾除菌等。影響滅菌效果的因素：微生物的種類和數(shù)量，培養(yǎng)基性質(zhì)、濃度、成分，滅菌的溫度、時間。本實驗采用濕熱滅菌。濕熱滅菌即利用飽和水蒸氣進行滅菌。由于蒸汽有很強的穿透力，而且冷凝時放出大量的冷凝熱，很容易是蛋白質(zhì)凝固而殺滅各種微生物。通常蒸汽滅菌的條件是在121（表壓約0.1MPa）維持30min。3.6.1濕熱滅菌 對培養(yǎng)基進行濕熱滅菌時，培養(yǎng)基中的微生物受熱死亡速率與殘存數(shù)量成正比，即 （31）式中：N 培養(yǎng)基中活微生物的個數(shù)；為微生物受熱時間，s

19、； 為比死亡速率，；若開始滅菌時（=0），培養(yǎng)基中或微生物數(shù)為N0，將式（31）積分可得 （32）上式被稱為對數(shù)殘留定律。其中N為經(jīng)時間滅菌后培養(yǎng)基中活微生物數(shù)。3.6.2培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌 培養(yǎng)基連續(xù)滅菌在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度(130140),短時間保溫（一般為58min），升降溫時間相對較短，可以實現(xiàn)自動控制、提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率、蒸汽用量平穩(wěn)等優(yōu)點，培養(yǎng)基在短時間內(nèi)被加熱到滅菌溫度，短時間保溫后被快速冷卻，再進入早已滅完菌的發(fā)酵罐，這樣不但可以節(jié)省時間，更重要的是減少了培養(yǎng)基的破壞率。對補料培養(yǎng)基的滅菌方法跟發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌方法一樣都是濕熱滅菌，其加熱蒸汽的壓力要求較高，一般不小于0

20、.45Mpa.連續(xù)滅菌的流程，如圖所示3.6.3空氣除菌 根據(jù)國家藥品質(zhì)量管理規(guī)范的要求，生物制品、藥品的生產(chǎn)場地業(yè)需要符合空氣潔凈度的要求。3.6.4無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 國家所規(guī)定無菌空氣的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：1、連續(xù)提供一定流量的壓縮空氣。2、空氣的壓強為0.20.4Mpa。3、進入過濾器前空氣的相對濕度應(yīng)小于等于70.4、進入發(fā)酵罐的空氣溫度可比培養(yǎng)基溫度高1030左右。5、壓縮空氣的潔凈度，在設(shè)計空氣過濾器時，一般取失敗概率為0.001為指標(biāo)。3.6.5無菌空氣的制備 過濾是空氣除菌的主要手段，按過濾介質(zhì)孔隙將空氣過濾器分為兩類：絕對過濾，深層過濾。后者主要原理為：1、慣性滯留作用2、攔截滯留

21、作用3、布朗擴散作用4、重力沉降5、靜電作用。其過濾除菌流程為：采風(fēng)塔粗過濾器空氣壓縮機空氣儲存罐冷卻器氣液分離設(shè)備空氣加熱設(shè)備空氣過濾設(shè)備。如圖5-1。圖5-1 空氣除菌設(shè)備流程圖設(shè)備如下：采風(fēng)塔：采風(fēng)塔建在工廠的上風(fēng)頭，遠(yuǎn)離煙囪，采風(fēng)塔越高越好，高至少10 m,氣流速度8 m/s。粗過濾器：安裝在空壓機吸入口前，主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保護空氣壓縮機，同時起一定的除菌作用，減輕總過濾器的負(fù)擔(dān)。應(yīng)阻力小，容量大。空氣壓縮機：作用是提供動力，以克服隨后各設(shè)備的阻力?？諝鈨蓿鹤饔檬窍龎嚎s空氣的脈動。要求：H/B=22.5 ， V=（0.10.2）V1 其中，H為罐高；B為罐直徑；V1

22、為空壓機每分鐘排氣量（20，1×105Pa狀況下），旋風(fēng)分離器：是利用離心力進行氣-固或氣-液沉降分離的設(shè)備。作用是分離空氣中被冷卻成霧狀的較大的水霧和油霧粒子。冷卻器：空壓機出口溫度氣溫在120左右，必須冷卻。另外在潮濕的地域和季節(jié)還可以達(dá)到降濕的目的。空氣冷卻器可采用列管式熱交換器空氣走殼程，管內(nèi)走冷卻水。絲網(wǎng)除沫器：可以除去空氣中絕大多數(shù)的20µm 以上的液滴和1µm以上的霧滴，一般采用規(guī)格為直徑0.25×40孔且高度為150的不銹鋼絲網(wǎng)?？諝饧訜崞鳎翰捎昧泄軗Q熱器，空氣走管程，蒸汽走管外。總過濾器：填充物按下面順序安裝：孔板 鐵絲網(wǎng)麻布 活性炭

23、麻布 棉花 麻布 鐵絲網(wǎng) 孔板介質(zhì)要緊密均勻，壓緊一致，上下棉花層厚度為總過濾層厚度的1/4，中間活性炭層為1/3。無菌空氣的檢查空氣系統(tǒng)的無菌檢測主要考察過濾器是否失效。過濾器失效的檢測方法之一是檢測過濾器兩側(cè)的壓降，壓降大說明過濾介質(zhì)被堵塞；二是用粒子計數(shù)器測定空氣中的粒子數(shù)是否超標(biāo)，有無達(dá)到潔凈度要求。3.7發(fā)酵以2的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，35培養(yǎng)56小時，進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)；在發(fā)酵過程中，采取調(diào)節(jié)pH的方法控制發(fā)酵，即：將種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后，使發(fā)酵液初始pH為7；在發(fā)酵期間，當(dāng)發(fā)酵液酸性逐漸增加時，應(yīng)控制發(fā)酵液pH不低于6.0；隨后，當(dāng)發(fā)酵液堿性逐漸增加時，應(yīng)控制發(fā)酵液的pH不

24、高于8.0。3.8分離純化 工業(yè)中使用的基本都是堿性蛋白酶的粗制品，進一步的分離純化有助于更好地確定酶的性質(zhì)及作用機制。 以菌株的發(fā)酵液為處理對象，首先離心除去菌體細(xì)胞及其它不溶性物質(zhì)，對無細(xì)胞發(fā)酵液進行沉淀，達(dá)到分離和濃縮的目的。再通過等電層析、親和層析等不同的色譜層析手段對堿性蛋白酶進一步純化。4工藝計算4.1 堿性蛋白酶發(fā)酵工藝技術(shù)指標(biāo)指標(biāo)名稱單位指標(biāo)數(shù)生產(chǎn)規(guī)模t/a3生產(chǎn)方法深層液態(tài)發(fā)酵年生產(chǎn)天數(shù)d/a100產(chǎn)品日產(chǎn)量t/a0.03產(chǎn)品質(zhì)量比活力（U/g）50萬倒罐率%1.0發(fā)酵周期h36發(fā)酵液酶活力U/ml18000堿性蛋白酶提取率%85冷凍干燥酶收率%80平均總收率率%684.2

25、工藝參數(shù)與基本物性數(shù)據(jù)的選取4.2.1 工藝參數(shù)堿性蛋白酶比活力比活力為50萬U/g，生產(chǎn)周期為36h，發(fā)酵溫度為37，溶氧為0.03-0.04MPa。4.2.2基本物性數(shù)據(jù)的選取在低溫下油或油脂的平均熱容在2.05-2.51kJ/(kg·)，隨著溫度升高比熱將增加。4.3物料衡算根據(jù)物料衡算的質(zhì)量守衡定律，在間歇操作過程中，若系統(tǒng)內(nèi)不發(fā)生物料量的積累，輸入的物料量等于輸出的物料量。表1 物料的基本物性參數(shù)密度（kg/m3）汽化替熱kJ/kg比熱容kJ/(kg·)沸點()培養(yǎng)基10004.183水99822584.183100生產(chǎn)1000kg比活力為50萬U/g的發(fā)酵液量：

26、50萬U/g×1000×1000=108萬U 108萬U/18000=2.78×107ml=27.8m3 18000U/ml 發(fā)酵液酶活每日所需量V0=V發(fā)/(0.68×0.7)=0.278/(0.68×0.7)=1.75m30.68平均總收率 0.7填充系數(shù)發(fā)酵液所需淀粉量:1.75×2%=0.035kg發(fā)酵液所需麩皮量:1.75×5%=0.0875kg發(fā)酵液所需玉米漿量:1.75×3%=0.0525kg二級接種量：V2=1%V1=0.0175m3 吐溫-80(M / V)：0.02%×1.75=0.0

27、0035kg MgSO4(M / V)：0.02%×1.75=0.00035kg 發(fā)酵罐的尺寸個數(shù)： 尺寸：2立方米 個數(shù);1個4.4熱量衡算4.4.1 基準(zhǔn)溫度的選定為便于計算，熱量輸入和輸出的基準(zhǔn)溫度選為20(293K)。4.4.2 連消塔的熱量衡算Q=Gc(t2-t1)=13406×3.91×(115-70)=2.36×106(kJ/h)4.4.3 發(fā)酵罐的熱量衡算發(fā)酵時放出的生物熱：Q總=4.18×6000×102.14=2.56×106(kJ/h)5分離干燥5.1雙水相萃取萃取原理:將親水性聚合物加入水中會形成兩相

28、。聚合物以不同的比例分配與這兩相中，而水分在每一相中都會占很大的比例(85%-95%)，生物蛋白質(zhì)等在這種體系中能夠保持自然活性。當(dāng)兩種聚合物的水溶液相互混合時，究竟是分層成兩相，還是混合成一相，取決于兩種因素，一是混合熵的變化，二是分子間的作用力。對大分子而言，則分子間的作用力占主導(dǎo)地位，也就是說，由分子間的作用力決定混合的結(jié)果。若兩種聚合物的分子間存在斥力，那么再某一分子的周圍就可能系同種分子而非異種分子。當(dāng)達(dá)到平衡后則分成兩相，兩種聚合物分別進入到每一相中，達(dá)到分離的目的。反過來，如果兩種聚合物之間存在引力，如在帶相反電荷的兩種聚合物電解質(zhì)之間，則它們相互結(jié)合而存在于同一相中，若兩種聚合

29、物間不存在分子間力，則它們相互混合。根據(jù)上述分析可知，能夠進行雙水相萃取的必要條件是：形成的兩種聚合物分子間存在引力。雙水相萃取中，影響分配的主要參數(shù)有聚合物的分子質(zhì)量和濃度、pH、鹽的種類和濃度、操作穩(wěn)定等。聚合物分子質(zhì)量低時，生物大分子易分配于富含該聚合物的相中，當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點時，雙水相萃取本身受溫度的影響很小。大規(guī)模生產(chǎn)總是在常溫下操作，一則節(jié)省制冷費用，再則聚合物在常溫下對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，不會引起損失，同時溫度高時，粘度低，有利于相的分離操作。因此，確定適宜的操作條件，可達(dá)到較高的分配系數(shù)和選擇性。雙水相萃取的一個重要優(yōu)點是可直接從細(xì)胞破碎漿液中萃取蛋白質(zhì)而無需將細(xì)胞碎片分離，一步操作

30、可達(dá)到固液分離和純化兩個目的。雙水相萃取方法： 雙水相萃取法的一個主要應(yīng)用是胞內(nèi)酶的提取，采用雙水相系統(tǒng)可使欲提取的酶與細(xì)胞碎片以較大的分配系數(shù)分配在不同的相中，進而采用離心法就可實現(xiàn)分離。采用雙水相萃取時，通常將蛋白質(zhì)分配在上相(PEG)，細(xì)胞碎片分配在下相(鹽)。反過來對相的分離不利，因為當(dāng)上相固含量髙時，分離機的性能會受到影響。在操作時，單位重量相系統(tǒng)中料漿的加入量是一個重要參數(shù)。顯然，料漿的加入量愈多愈經(jīng)濟，但過量的料漿會影響原來聚合物的成相系統(tǒng)，是分配系數(shù)降低，結(jié)果收率降低。根據(jù)經(jīng)驗，一般每1kg萃取系統(tǒng)處理200-400濕菌體為宜。5.2干燥冷凍干燥原理：冷凍干燥是將濕物料在較低溫

31、度下凍結(jié)成固態(tài)，然后在高度真空(130Pa-0.1MPa)下，將其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)而除去的干燥過程，也稱為升華干燥。冷凍干燥也是真空干燥的一種特例。冷動干燥也可將濕物料不預(yù)凍，而是利用高度真空時水分汽化吸熱而將物料自行凍結(jié)。這種凍結(jié)能量消耗小，但對液體物料易產(chǎn)生泡沫或飛濺現(xiàn)象而遭致?lián)p失，同時也不易獲得多孔性的均勻干燥物。冷凍干燥中升華溫度一般為-35-5，而抽出的水分可在冷凝器上冷凍聚集或直接為真空泵排出。若升華時需要的熱量直接由所干燥的物料供給，這種情況下，物料溫度減低很快，以至于冰的蒸汽壓很低而使升華速率降低。一般情況下，熱量由加熱介質(zhì)通過干燥室的間壁供給，因此，既要供給濕物料的熱

32、量以保證一定的干燥數(shù)率，又要避免冰的融化。與其他干燥相比，冷凍干燥具有以下特點：1) 干燥溫度低，特別適合于高熱敏性物料的干燥，生物制品的干燥。又系在真空下操作，氧氣極少，物料中易氧化物質(zhì)得到了保護，因此，制品中的有效物質(zhì)及營養(yǎng)成分損失很少。2) 能保持原物料的外觀形狀。物料在升華脫水前先進行預(yù)凍，形成穩(wěn)定的固體骨架。干燥后體積形狀基本不變，不失原有的固體結(jié)構(gòu)，無干縮現(xiàn)象。3) 凍干制品具有多孔結(jié)構(gòu)，因而有理想的速溶性和快速復(fù)水性。干燥過程中，物料中溶于水的溶質(zhì)就地析出，避免了一般干燥方法中因物料水分向表面轉(zhuǎn)移而將無機鹽和其他有效成分帶到物料表面，產(chǎn)生表面硬化現(xiàn)象。4) 冷凍干燥脫水徹底(一般

33、低于2%-5%)，質(zhì)量輕，產(chǎn)品保存期長，若采用真空密封包裝，常溫下即可運輸、保存，十分簡便。但冷凍干燥需要昂貴的專用設(shè)備，干燥周期長，能耗較大，產(chǎn)量小，加工成本高。冷凍干燥流程：冷凍干燥過程分為兩個階段，第一階段，在低于熔點的溫度下，使物料中的固態(tài)水分直接升華，大約有98%-99%的水分在這一階段除去。第二階段中，將物料溫度逐漸升高甚至高于室溫，使水分汽化除去，此時水分可以減少到0.5%。冷東干燥系統(tǒng)主要有4部分組成，即冷凍裝置、真空裝置、水汽去除裝置和加熱部分，用于生物制品的了扭動干燥流程見帶控制點餓工藝流程圖。預(yù)冷凍和干燥均在一個箱內(nèi)完成。帶干燥的物料放入干燥室內(nèi)，開動預(yù)冷用冷凍機對物料進

34、行冷凍，隨之開啟冷凝器和真空裝置，實現(xiàn)升華干燥操作。加熱器以作冷凝器內(nèi)化霜之用。第一階段升華干燥結(jié)束后，開啟油加熱循環(huán)泵對干燥室加熱升溫，使之汽化排除剩余的水分。6后記 通過此次課程設(shè)計使我更扎實的掌握了有關(guān)發(fā)酵的一系列問題，使本來枯燥乏味的發(fā)酵課程變得有趣。在這過程中遇到了很多問題，從前都未曾涉獵，但經(jīng)過這次課程設(shè)計讓我不光懂得了有關(guān)發(fā)酵的問題，還懂得了CAD的使用，增加了自己各方面的認(rèn)識，我不斷地查找資料，遇到不懂得及時請教豐富了自己的知識面，同時深刻領(lǐng)悟了“致知于行”的意義。從理論到實踐的過程是一個很重要的過程，終于明白“紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行”的意義，紙上談兵終究不能讓自己在所學(xué)的領(lǐng)域有多大的成就與貢獻，我在這段時間里學(xué)到的我覺得比我這一學(xué)期的都多，因為這是一種實踐和理論的結(jié)合。歷時兩個星期的課程設(shè)計，查閱了大量的資料，在這個過程中我有時候真的心煩，由于找不到堿性蛋白酶的相關(guān)資料，但最后還是耐心的尋找，通過去圖書館查閱教輔資料和上網(wǎng)查找再加上向?qū)W長學(xué)姐請教，終于完成了這份課程設(shè)計，無論質(zhì)量如何，這都是我精心設(shè)計的成果，