1、分子生物學(xué)與基因工程緒論1、分子生物學(xué)與基因工程的含義從狹義上講，分子生物學(xué)主要是研究生物體主要遺傳物質(zhì)-基因或DNA的結(jié)構(gòu)及其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達和調(diào)節(jié)控制等過程的科學(xué)?；蚬こ淌且豁棇⑸锏哪硞€基因通過載體運送到另一種生物的活體細(xì)胞中，并使之無性繁殖和行使正常功能，從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)。2、分子生物學(xué)與基因工程的發(fā)展簡史，特別是里程碑事件，要求掌握其必要的理由上個世紀(jì)50年代，Watson和Crick提出了的DNA雙螺旋模型；60年代，法國科學(xué)家Jacob和Monod提出了的乳糖操縱子模型；70年代，Berg首先發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，并構(gòu)建了世界上第一個重組DNA分子；80年代

2、，Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)技術(shù)；90年代，開展了“人類基因組計劃”和模式生物的基因組測序，分子生物學(xué)進入“基因組時代”3、分子生物學(xué)與基因工程的專業(yè)地位與作用。核酸概述1、核酸的化學(xué)組成2、核酸的種類與特點：DNA和RNA的區(qū)別(1) DNA含的糖分子是脫氧核糖，RNA含的是核糖;（2）DNA含有的堿基是腺嘌吟（A）、胞嘧啶（C）、鳥嘌吟（G）和胸腺嘧啶（T）,RNA含有的堿基前3個與DNA完全相同，只有最后一個胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替；（3）DNA通常是雙鏈，而RNA主要為單鏈；（4）DNA的分子鏈一般較長，而RNA分子鏈

3、較短。3、DNA作為遺傳物質(zhì)的直接和間接證據(jù)；間接：（1）一種生物不同組織的細(xì)胞，不論年齡大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖細(xì)胞精子的DNA含量則剛好是體細(xì)胞的一半。多倍體生物細(xì)胞的DNA含量是按其染色體倍數(shù)性的增加而遞增的，但細(xì)胞核里的蛋白質(zhì)并沒有相似的分布規(guī)律。（2）DNA在代謝上較穩(wěn)定。（3）DNA是所有生物的染色體所共有的，而某些生物的染色體上則沒有蛋白質(zhì)。（4）DNA通常只存在于細(xì)胞核染色體上，但某些能自體復(fù)制的細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體有其自己的DNA。（5）在各類生物中能引起DNA結(jié)構(gòu)改變的化學(xué)物質(zhì)都可引起基因突變。直接：肺炎鏈球菌試驗、噬菌體侵染實驗4、DNA的變性與

4、復(fù)性：兩者的含義與特點及應(yīng)用變性：它是指當(dāng)雙螺旋DNA加熱至生理溫度以上（接近100°C）時，它就失去生理活性。這時DNA雙股鏈間的氫鍵斷裂，最后雙股鏈完全分開并成為無規(guī)則線團的過程。簡而言之，就是DNA從雙鏈變成單鏈的過程。增色效應(yīng)：它是指在DNA的變性過程中，它在260nm的吸收值先是緩慢上升，到達某一溫度后即驟然上升的效應(yīng)。復(fù)性：它是指熱變性的DNA如緩慢冷卻，已分開的互補鏈又可能重新締合成雙螺旋的過程。復(fù)性的速度與DNA的濃度有關(guān)，因為兩互補序列間的配對決定于它們碰撞頻率。DNA復(fù)性的應(yīng)用-分子雜交：由DNA復(fù)性研究發(fā)展成的一種實驗技術(shù)是分子雜交技術(shù)。雜交可發(fā)生在DNA和DN

5、A或DNA與RNA間。5、Tm的含義與影響因素Tm的含義：是指吸收值增加的中點。影響因素：1）DNA序列中G+C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（決定性因素）；2）溶液的離子強度3）核酸分子的長度有關(guān)：核酸分子越長，Tm值越大4）某些化學(xué)物質(zhì)5）溶液pH值6、DNA的一級結(jié)構(gòu)的含義與特點，包括化學(xué)本質(zhì)7、DNA雙螺旋模型的發(fā)現(xiàn)過程、基本內(nèi)容與生物學(xué)意義（1）兩條多核苷酸鏈以右手螺旋的形式彼此以一定的空間距離，平行地環(huán)繞于同一軸上；（2）兩條多核苷酸鏈走向為反向平行，即一條鏈磷酸二酯鍵為5'3'方向，而另一條為3'5'方向，二者剛好相反；3）每條長鏈的內(nèi)側(cè)是扁平

6、的盤狀堿基，堿基一方面與脫氧核糖相聯(lián)系，另一方面通過氫鍵與它互補的堿基相聯(lián)系?；パa堿基對A與T之間形成兩對氫鍵，而C與G之間形成三對氫鍵。上下堿基對之間的距離為0.34nm；（4）每個螺旋為3.4nm長，剛好含有10個堿基對，其直徑約為2nm；（5）在雙螺旋分子的表面大溝和小溝交替出現(xiàn)。3、DNA精細(xì)結(jié)構(gòu)的含義與重要參數(shù)（1）依賴于序列的B-DNA構(gòu)象變化；（2）連續(xù)AT序列的構(gòu)象；（3）含錯配堿基對的B-DNA；（4）DNA的局部構(gòu)象與DNA結(jié)合蛋白4、DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的形成與鑒定超螺旋DNA可采取兩種拓?fù)鋵W(xué)上相當(dāng)?shù)男问?。一種相當(dāng)于雙螺旋繞圓柱體旋轉(zhuǎn)；另一種相當(dāng)于雙螺旋相互盤繞。超螺旋的這兩

7、種形式可以相互轉(zhuǎn)變。天然的DNA都呈負(fù)超螺旋，但在體外可得正超螺旋5、DNA不尋常結(jié)構(gòu)有哪些，有何作用？交替的嘧啶、嘌吟重復(fù)序列傾向形成Z-DNA反向重復(fù)序列傾向形成十字形結(jié)構(gòu)構(gòu)成鏡像重復(fù)的同型嘧啶-同型嘌吟序列可能形成三鏈結(jié)構(gòu):在形成三鏈DNA過程中游離出來的多聚嘌吟鏈則保持單鏈狀態(tài)。故三鏈DNA對S1核酸酶的作用敏感。由于三鏈DNA含有鏡像重復(fù)，故可形成兩種異構(gòu)體：一是多聚嘌呤鏈的5'部分成單鏈；另一是3'部分成單鏈。富含G的序列可能形成四鏈結(jié)構(gòu)：端粒DNA的序列具有一定的取向特征。在每一染色體末端，富含G的一股鏈由5'向3'-末端延伸，并突出于互補的富含C

8、一股鏈1216核苷酸。染色體的末端與特定的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。染色體與基因組的結(jié)構(gòu)1、真核生物染色體的結(jié)構(gòu)，包括基本單元的化學(xué)組成染色體是由染色質(zhì)構(gòu)成的，染色質(zhì)是由DNA、RNA和蛋白質(zhì)形成的復(fù)合體。染色體是動態(tài)的物體，其外觀隨細(xì)胞周期的不同階段發(fā)生明顯的改變。僅當(dāng)細(xì)胞分裂時，每個染色體才呈現(xiàn)出凝聚型。（1）組蛋白：組蛋白在翻譯后是受到修飾的，其中包括特異精、組、賴、絲和蘇氨酸殘基的甲基化、乙?；土姿峄?）核小體（3）30nm纖絲（4）輻射的環(huán)2、真核生物基因組的C值與特點在真核生物中，每種生物的單倍體基因組的DNA總量是恒定的，稱之為C值。3、基因組中DNA的大小、形狀與序列組織：包括衛(wèi)

9、星DNA和微衛(wèi)星DNA的含義DNA一般為長而無分支的雙股線性分子，但有些為環(huán)型，也有少數(shù)為單股環(huán)型。不同的DNA大小相差懸殊。例如，SV40含5.1kb,而南美肺魚的基因組含102000000kb。雖然一般而言，復(fù)雜的有機體需要更多的DNA,但不存在嚴(yán)格的對應(yīng)關(guān)系。真核生物DNA堿基組成上的異質(zhì)性主要由于存在著以下3類DNA序列:高度重復(fù)序列；中度重復(fù)序列；單一序列。4、真核生物的基因組特點（與原核生物比較）真核生物基因組與原核生物的相比，主要有以下幾方面的差異（特點）（1）分布部位（2）基因特性（3）遺傳信息的傳遞過程（4）自身的復(fù)制過程蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能1、蛋白質(zhì)的含義蛋白質(zhì)一詞最早來自希

10、臘語“proteios”，其含義為“第一重要的”。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，蛋白質(zhì)是由20種左右的-氨基酸通過肽鍵相互連接而成的一類具有特定的空間構(gòu)象和生物學(xué)功能的高分子有機化合物。1、二十種氨基酸的英文簡稱，要求掌握一個字母的含義齬壽gg囂蠶蠶且曰1:1A:GaHm叩"鼻uetbeoiE-lrPBIllLL-s-4、ilHn!liLe-ey俎h廠ehr-yy411antn-eE-iTiineAsparapineasparticacidcystine：Lutarmine.Lul-amiicacidLycineTilsrldlnieisoleucineleucine1-ysineLnet

11、77;»io-niti«-ptienyia.laniiejarolineerin-e-tfireoniKLetrypto-ptiantyrosinevaline-1、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的含義它是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸殘基的排列順序，也是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。它是由基因上遺傳密碼的排列順序所決定的。各種氨基酸按遺傳密碼的順序，通過肽鍵連接起來，成為多肽鏈，故肽鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的主鍵。2、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的類型，包括阿爾法結(jié)構(gòu)與DNA雙螺旋的異同點a-螺旋、B-折迭、B-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲(填空題)(1) 多個肽鍵平面通過a-碳原子旋轉(zhuǎn)，相互之間緊密盤曲成穩(wěn)固的右手螺旋；(2) 主鏈呈螺

12、旋上升，每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm,這與X衍射圖符合；(3) 相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中C=O和硫氫基形成許多鏈內(nèi)氫健，即每一個氨基酸殘基中的NH和前面相隔三個殘基的C=O之間形成氫鍵，這是穩(wěn)定a-螺旋的主要鍵；(4) 肽鏈中氨基酸側(cè)鏈R分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響a-螺旋的形成。酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于a-螺旋形成；較大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸)集中的區(qū)域，也妨礙a-螺旋形成；脯氨酸因其a-碳原子位于五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，故不易形成上述a-螺旋；甘氨酸的R基為H,空間占位很小，也會影響該處螺旋的穩(wěn)

13、定。1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(1) 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，特定的空間構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團形成的次級鍵來維持，在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的多肽鏈一旦被合成后，即可根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的特點自然折疊和盤曲，形成一定的空間構(gòu)象。(2) 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象與功能活性的關(guān)系：蛋白質(zhì)多種多樣的功能與各種蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象密切相關(guān)，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象是其功能活性的基礎(chǔ)，構(gòu)象發(fā)生變化，其功能活性也隨之改變。蛋白質(zhì)變性時，由于其空間構(gòu)象被破壞，故引起功能活性喪失，變性蛋白質(zhì)在復(fù)性后，構(gòu)象復(fù)原，活性即能恢復(fù)。血紅蛋白是紅細(xì)胞中所含有的一種結(jié)合蛋白質(zhì)，它的蛋白質(zhì)部分稱為珠蛋白

14、，非蛋白質(zhì)部分（輔基）稱為血紅素（X）DNA復(fù)制1、一些基本概念：復(fù)制子、復(fù)制單元、復(fù)制起始點、半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、前導(dǎo)鏈隨后鏈、岡崎片段。DNA在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂使兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA,另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。連續(xù)合成的鏈比不連續(xù)合成的鏈超前一步，稱為前導(dǎo)鏈。2、不連續(xù)合成的鏈要滯后一步，稱為后隨鏈。前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制和后隨鏈的不連續(xù)復(fù)制，稱為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。隨從鏈的前進方向是與復(fù)制叉的打開方向相反的。隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做岡崎片段。復(fù)制

15、是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點。生物體的單個復(fù)制單位稱為復(fù)制子。1、要求掌握DNA定點雙向復(fù)制4、單鏈結(jié)合蛋白的作用它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用。5、DNA復(fù)制的酶學(xué)基礎(chǔ)及原核生物復(fù)制的一般過程，包括DNA復(fù)制前導(dǎo)鏈和隨后鏈的起始、延長和終止6、真核生物DNA復(fù)制的特點（1）與原核生物不同，真核生物DNA復(fù)制有許多起始點（2）在真核生物DNA復(fù)制叉處，需要兩種不同的酶。（3）由于真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端區(qū)，端區(qū)是由重復(fù)的寡核苷酸序列構(gòu)成

16、的。（4）真核生物具有多重復(fù)制原點，原核生物只有一個。RNA生物合成及其加工1、一些基本概念：不對稱轉(zhuǎn)錄、編碼鏈（信息鏈）、模板鏈、啟動子、轉(zhuǎn)錄因子在DNA的兩條多苷酸鏈中只有其中一條鏈作為模板，這條鏈叫做模板鏈，又叫反義鏈。DNA雙鏈中另一條不做為模板的鏈叫做編碼鏈，又叫有意義鏈。編碼鏈的的序列與轉(zhuǎn)錄本RNA的序列相同，只是在編碼鏈上的T在轉(zhuǎn)錄本RNA為U,由于RNA的轉(zhuǎn)錄合成是以DNA的一條鏈為模板而進行的,所以這種轉(zhuǎn)錄方式又叫做不對稱轉(zhuǎn)錄。啟動子：指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的區(qū)域，還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合序列。轉(zhuǎn)錄因子：凡是轉(zhuǎn)錄起始過程必需的蛋白質(zhì)，只要

17、不是RNA聚合酶的組成成分，就可以將其定義為轉(zhuǎn)錄因子。2、RNA生物合成的酶學(xué)基礎(chǔ)：包括該酶的組成與特點3、原核生物DNA轉(zhuǎn)錄的基本過程，包括啟動子的識別、起始、延長和終止4、真核生物轉(zhuǎn)錄與原核生物的區(qū)別5、原核生物轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的主要區(qū)別6、mRNA加工基本過程：要求掌握帽子與尾巴結(jié)構(gòu)的名稱與作用及形成過程 5,端形成帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppNp) 3,端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail) 中部剪接除去內(nèi)含子 鏈內(nèi)部核苷酸的甲基化mRNA帽子的生理功能：帽子結(jié)構(gòu)參與翻譯起始，帽0結(jié)構(gòu)是核糖體識別mRNA所必需的；核糖體上有帽結(jié)合蛋白。帽子結(jié)構(gòu)增加mRNA的穩(wěn)定性，保護mRNA防止其受5核酸外

18、切酶的降解。促進某些RNA的合成。7、tRNA加工基本過程：要求掌握氨基酸臂名稱、加工酶系及堿基修飾方式剪切內(nèi)含子核酸外切酶修剪3末端，逐個切去附加序列；加上CCA-OH的3末端，完成柄部結(jié)構(gòu)。堿基修飾蛋白質(zhì)生物合成1、蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)基礎(chǔ)包括哪些方面(1) 合成原料(2) mRNA是合成蛋白質(zhì)的直接模板(3) tRNA是氨基酸的運載工具(4) 核糖體-蛋白質(zhì)的合成場所(5) 蛋白質(zhì)生物合成的必需因子2、遺傳密碼的特點及解析(1) 起始碼：絕大多數(shù)生物的起始密碼子都是AUG,作為多肽鏈合成的起始信號，同時編碼一種氨基酸，原核生物的起始密碼子AUG翻譯對應(yīng)的是甲酰甲硫氨酸，真核生物的起始密碼子A

19、UG翻譯對應(yīng)的是甲硫氨酸。(2) 終止碼：密碼子UAA、UAG、UGA并不編碼任何氨基酸，起著終止肽鏈合成的作用，因此成為終止密碼子。（3）密碼無標(biāo)點符號（4）密碼的簡并性：簡并性主要是由于密碼子的第三個堿基發(fā)生擺動現(xiàn)象形成的，也就是說密碼子的專一性主要由前兩個堿基決定，（5）密碼的通用性：蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。但已發(fā)現(xiàn)少數(shù)例外，如動物細(xì)胞的線粒體、植物細(xì)胞的葉綠體。3、核糖體作為蛋白質(zhì)或多肽裝配機器的原因核糖體作為蛋白質(zhì)的合成場所,它提供了模板mRNA的結(jié)合位點、肽?；鵷RNA位、氨基酰tRNA位、轉(zhuǎn)肽酶活性部位及蛋白質(zhì)合成起始因子IF、延長因子EF和終止因子RF

20、的結(jié)合部位。4、原核生物蛋白質(zhì)合成的基本過程,包括氨基酸的活化、合成的起始、多肽鏈的延長與釋放。5、多核糖體循環(huán)的含義事實上在細(xì)胞內(nèi)一條mRNA鏈上結(jié)合著多個核糖體,甚至可多到幾百個。蛋白質(zhì)開始合成時，第一個核糖體在mRNA的起始部位結(jié)合，引入第一個蛋氨酸，然后核糖體向mRNA的3'端移動一定距離后,第二個核糖體又在mRNA的起始部位結(jié)合,向前移動一定的距離后，在起始部位又結(jié)合第三個核糖體，依次下去，直至終止。兩個核糖體之間有一定的長度間隔，每個核糖體都獨立完成一條多肽鏈的合成，所以這種多核糖體可以在一條mRNA鏈上同時合成多條相同的多肽鏈，這就大大提高了翻譯的效率?；虮磉_調(diào)控1、一

21、些基本概念：基因表達、基因表達組織特異性、基因表達階段特異性、組成性表達、適應(yīng)性表達、順式作用元件、反式作用元件（1）基因表達：指儲存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。（2）基因表達組織特異性：遺傳信息的表達是受到嚴(yán)格調(diào)控的，通常各組織細(xì)胞只合成其自身結(jié)構(gòu)和功能所需要的蛋白質(zhì)。不同組織細(xì)胞中不僅表達的基因數(shù)量不相同，而且基因表達的強度和種類也各不相同，這就是基因表達的組織特異性。（3）基因表達階段特異性：細(xì)胞分化發(fā)育的不同時期，基因表達的情況是不相同的，這就是基因表達的階段特異性。（4）組成性表達：指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達。（5）適應(yīng)性表達：指環(huán)境的變化容易使

22、其表達水平變動的一類基因表達。（6）順式作用元件：指DNA上對基因表達有調(diào)節(jié)活性的某些特定的調(diào)節(jié)序列，其活性僅影響與其自身處于同一分子的基因。（7）反式作用元件：調(diào)控基因可以在結(jié)構(gòu)基因群附近、也可以遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因，它是通過其基因產(chǎn)物-調(diào)控蛋白來發(fā)揮作用的，因而調(diào)控基因不僅能對同一條DNA鏈上的結(jié)構(gòu)基因起表達調(diào)控作用，而且能對不在一條DNA鏈上的結(jié)構(gòu)基因起作用，在遺傳學(xué)實驗上稱為反式作用，調(diào)控基因就屬于反式作用元件。2、乳糖操縱系統(tǒng)的組成部分及作用乳糖操縱元含有z、y和a三個結(jié)構(gòu)基因。z基因長3510bp，編碼含1170個氨基酸、分子量為135kD的多肽，以四聚體形式組成有活性的B-半乳糖苷酶，催

23、化乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，再分解為半乳糖和葡萄糖；y基因長780bp，編碼由260個氨基酸組成、分子量30kD的半乳糖透過酶，促使環(huán)境中的乳糖進入細(xì)菌；a基因長825bp，編碼含275氨基酸、分子量為32kD的轉(zhuǎn)乙?；?，以二聚體活性形式催化半乳糖的乙?；?。3、乳糖操縱子模型的基本內(nèi)容及在分子生物學(xué)中的地位操縱元是原核基因表達調(diào)控的一種重要的組織形式，大腸桿菌的基因多數(shù)以操縱元的形式組成基因表達調(diào)控的單元。在分子生物學(xué)中的地位：重要的里程碑4、真核生物基因表達調(diào)控的特點（與原核生物比較）（1）真核基因表達調(diào)控的環(huán)節(jié)更多（2）真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)（3）真核基因表達以正性調(diào)控為主基因操作

24、工具酶1、一些基本概念：工具酶、粘性末端、平末端、同位酶、同尾酶、同裂酶、酶活力單位（1）工具酶：在DNA分子水平的操作中，依賴于一些重要的酶，如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶等，作為工具對DNA進行切割和拼接，這些酶統(tǒng)稱為基因工程工具酶（2）黏性末端：大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶并不是在DNA兩條鏈的同一個位置切斷，而是在兩條鏈錯開24個核苷酸切斷，這樣產(chǎn)生的DNA末端會帶有5'突出或是3'突出的DNA單鏈，這種末端稱為黏性末端。（3）平末端：有些限制性核酸內(nèi)切酶能夠在識別序列中間的同一個位置將DNA雙鏈切斷,產(chǎn)生的DNA末端是平末端。4）同位酶：識別相同的序列但切割位點不一樣的限制性核

25、酸內(nèi)切酶。(5) 同尾酶:許多不同的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列雖然不完全相同，但切割DNA產(chǎn)生的末端是相同的，這些酶統(tǒng)稱為同尾酶。(6) 同裂酶：具有相同識別序列的限制性核酸內(nèi)切酶稱為同裂酶。(7) 酶活力單位：在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下(包括溫度、pH和離子強度等),lh內(nèi)在50ul容積中完全酶解lug特定DNA底物(通常用入DNA)所需要的酶量。2、基因操作工具酶的分類與舉例說明(1)限制性內(nèi)切酶：根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的特異性，即其識別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，可將已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)切核酸酶分為三類：即I型、II型、III型酶I型和III型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性內(nèi)切核酸酶活性，又因

26、其識別位點與切割位點不固定，所以價值不大II型酶切割DNA片斷活性和甲基化作用是分開的，且核酸內(nèi)切作用又具有序列特異性,在基因克隆中廣泛使用通常所用的限制性內(nèi)切核酸酶是指II型的(2)DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶I；KlenowDNA聚合酶；T4DNA聚合酶；T7噬菌體DNA聚合酶；耐熱DNA聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶(3)DNA連接酶 T4DNA連接酶；大腸桿菌DNA連接酶：T4RNA連接酶3、限制性內(nèi)切酶的含義、分類、命名、特點與影響因素含義：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某些特定的核苷酸序列，并在該序列切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。分類：按水解斷裂分子的方式不同，核酸酶可分為2種類型：一類是從

27、核酸分子的末端開始逐個消化降解多核苷酸鏈，叫做核酸外切酶；另一類是從核酸分子內(nèi)部切割磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔殉尚∑?，叫做核酸?nèi)切酶?？茖W(xué)家們根據(jù)酶分子結(jié)構(gòu)和功能特性的差異，又把限制性核酸內(nèi)切酶分為3種類型：I型酶、II型酶、III型酶。命名：采用Smith和Athens提議的方案，根據(jù)限制性內(nèi)切核酸酶來源和菌株進行命名 用來源細(xì)菌的英文縮寫斜體符號命名； 它的第一個字母大寫，來源細(xì)菌屬名的第1個字母； 第二、三字母小寫，來源細(xì)菌種名的頭2個字母； 第四個字母代表菌株； 最后用羅馬字母表示同一菌株中不同限制酶的編號。特點：專一性:一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA

28、分子多樣性:限制酶有200多種影響因素：星活性DNA樣品的純度DNA的甲基化程度DNA的分子結(jié)構(gòu)側(cè)翼序列長度4、DNA連接酶的含義、種類及作用機理含義：催化DNA上裂口兩側(cè)（相鄰）核苷酸裸露的3羥基和5磷酸之間形成共價結(jié)合的磷酸二酯鍵，使斷開的DNA裂口連接起來。種類：T4DNA連接酶；大腸桿菌DNA連接酶：T4RNA連接酶連接酶的作用：在雙鏈DNA中，DNA連接酶能催化具有鄰近3'-羥基和5'-磷酸基的單鏈形成磷酸二酯鍵，促使具有互補粘性末端或平末端的載體和供體DNA片段連接，使之成為一個完整的重組DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。結(jié)果

29、：黏性末端（包括平末端）連接起來。基因操作載體1、載體的含義與特點含義：攜帶目的基因進入宿主細(xì)胞進行復(fù)制、擴增和表達的工具稱載體（Vector）;即用于克隆、運載和轉(zhuǎn)移目的基因并能自我復(fù)制的DNA分子。載體特點：（1）能在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存-具復(fù)制原點。:在宿主細(xì)胞中不僅能獨立地自我復(fù)制，而且能與攜帶的外源DNA一起復(fù)制（2）能與目的基因連接-具多個限制酶切點，而每一個這樣的酶切位點在載體DNA中只有一個（廣泛、特異）（3）便于篩選鑒定-具有標(biāo)記基因，這種選擇標(biāo)記基因通常是抗抗菌素基因或某種酶基因，而宿主細(xì)胞并不具有（4）操作簡單-分子量小,高拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)化效率高,容易從宿主細(xì)胞中分離純

30、化2、載體的主要類型細(xì)菌質(zhì)粒載體（10kb）包括大腸桿菌和枯草桿菌質(zhì)粒載體 入噬菌體衍生載體(9-23kb) 柯斯質(zhì)粒(Cosmid)載體(40-50kb)一種由質(zhì)粒和入噬菌體cos尾巴構(gòu)建復(fù)合載體 M13載體一類專門用于Sanger法測序的載體 Phagemid載體一類由噬菌體功能片段和質(zhì)粒構(gòu)建的復(fù)合載體3、質(zhì)粒載體的特點與作用4、藍白斑篩選的基本原理pUC18/pUC19上含有一個LacZ基因的調(diào)控序列和編碼B-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的序列(a-互補肽)的DNA序列(標(biāo)記為lacZ')，多克隆位點就存在于lacZ'上。B-半乳糖苷酶的C端編碼基因卻位于相應(yīng)的宿主菌上。

31、當(dāng)這兩個部分基因產(chǎn)物(缺陷型-半乳糖苷酶)結(jié)合才會形成一個有活性的B-半乳糖苷酶。這種機制稱為a-互補作用。5、基因表達載體與克隆載體的區(qū)別克隆載體是在克隆過程中用到的各種質(zhì)粒，比如為了擴增目的基因的高拷貝質(zhì)粒、為了方便測序的測序質(zhì)粒、為了連接PCR產(chǎn)物的TA質(zhì)粒、為了重組的穿梭質(zhì)粒等等?？寺≥d體一般有較強的復(fù)制能力，利于基因的保存和擴增，而且提供豐富的酶切位點等等。它不必有強啟動子，因為不重于表達。表達載體是基因克隆結(jié)束后，為了在特定細(xì)胞內(nèi)表達而構(gòu)建的。他重點在于表達，有各種各樣的啟動子適應(yīng)于不同種類的細(xì)胞，并且有各種各樣，如誘導(dǎo)等可控的表達調(diào)控方式。6、真核生物載體（pEGFP-Nl載體）

32、的類型與特點 從結(jié)構(gòu)上看，該質(zhì)粒具有很強的復(fù)制能力，可以滿足隨宿主細(xì)胞分裂時跟隨胞質(zhì)遺傳給新生的子細(xì)胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達的因素之一； 含有高效的功能強大的啟動子SV40和PCMV,可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達; 具有多克隆位點，便于目的基因的插入； 該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞?；虿僮鞒Ｓ眉夹g(shù)1、分子雜交技術(shù)的分類及基本原理原理：核酸分子雜交是指來源不同的具有互補序列的兩條核酸單鏈，在一定條件下，按堿基配對原則結(jié)合成雜化雙鏈的過程。雜交的雙方分別稱為探針和待測核酸。2、PCR技術(shù)的基本原理（包括反應(yīng)體系和反應(yīng)進程）PCR反應(yīng)體系主要由

33、寡核苷酸（引物）、4種dNTP、TaqDNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反應(yīng)緩沖液體系組成。94°C預(yù)變性510min,94°C變性30s2min，退火30s2min,72°C延伸15min72°C延伸510min，中間三步循環(huán)，具體時間依自己的模板和引物情況而定。3、PCR的主要類型及應(yīng)用（1）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）反轉(zhuǎn)錄PCR即以mRNA作為模板，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的PCR方法其樣品模板為mRNA。一般分兩步進行：第一步用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步以cDNA為模板進行PCR擴增目前已發(fā)現(xiàn)一種rTth酶，既有反轉(zhuǎn)錄酶活性又有DN

34、A聚合酶活性。因此做RT-PCR可簡單到用一種酶和一種緩沖體系在一個反應(yīng)管內(nèi)直接擴增RNA（2）巢式PCR巢式PCR是指用兩對引物先后擴增同一樣品的方法。先用一對外側(cè)引物擴增含目的基因的大片段DNA,再用一對內(nèi)側(cè)引物以大片段DNA為模板擴增目的基因優(yōu)點：較常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時第二次擴增又可鑒定第一次擴增產(chǎn)物的特異性用于臨床檢驗（如血清中丙型肝炎的檢測）（3）多重PCR在反應(yīng)中用多組引物同時擴增基本稱復(fù)合PCR在同一反應(yīng)中加入多對引物，以一個DNA分子為模板，同時擴增幾種不同序列的PCR片段的方法用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體；多點突變性分子病的診斷（4）熒光定量PCR是用PCR方法對樣品起始模板濃度進行定量分析的一種方法通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品的初始模板量用這一方法對組織細(xì)胞中的特定mRNA進行定量分析，從而了解某一基因的表達水平。（5）原位PCR利用PCR技術(shù)在細(xì)胞涂片或組織切片上直接對靶DNA片段進行擴增，然后再用原位雜交對擴增產(chǎn)物進行定量分析的一種方法原位PCR與PCR相比，不需抽提組織細(xì)胞中的核酸，形態(tài)結(jié)構(gòu)不被破壞；比原位雜交靈敏度一般可提高100倍。4、影響PCR的主要因素1、預(yù)變性2、循環(huán)中的變性步驟3、引物退火4、引物延伸5、循環(huán)數(shù)6、最后