1、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS）技術(shù)）技術(shù)20022002年諾貝爾化學(xué)獎年諾貝爾化學(xué)獎發(fā)展了對生物大分子進行鑒定和結(jié)構(gòu)分析的方法，建發(fā)展了對生物大分子進行鑒定和結(jié)構(gòu)分析的方法，建立了軟解析電離法對生物大分子進行質(zhì)譜分析立了軟解析電離法對生物大分子進行質(zhì)譜分析田中耕一田中耕一【日日】約翰約翰貝內(nèi)特貝內(nèi)特芬恩芬恩【美美】MALDIMALDI技術(shù)技術(shù)離子化技術(shù)：離子化技術(shù)：MALDIMALDIMatrix-Assisted Laser Desorption/ IonizationMALDIMALDI技術(shù)的原理技術(shù)的原

2、理樣品與基質(zhì)，在樣品靶表面形成的共結(jié)晶薄膜激光照射，基質(zhì)吸收能量基質(zhì)把能量傳遞給樣品分子，將電荷轉(zhuǎn)移給樣品，樣品電離。質(zhì)譜分析原理質(zhì)譜分析原理進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)離子源離子源質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器檢測器檢測器1.氣體擴散2.直接進樣3.色譜1.電子轟擊2.化學(xué)電離3.場致電離 4.激光 1.單聚焦 2.雙聚焦 3.飛行時間4.四極桿 基質(zhì)輔助激光解吸電離基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)(MALDI)常用基質(zhì)：常用基質(zhì)： 芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸)（SA)、龍膽酸(2,5-二羥基苯甲酸)(DHB)、-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羥基吡啶甲酸(3HPA)。M

3、ALDIMALDI技術(shù)中基質(zhì)的作用技術(shù)中基質(zhì)的作用l把樣品分子彼此分開(基質(zhì)：樣品=10，000：1)，削弱樣品分子之間的相互作用。l基質(zhì)吸收激光的能量，并將部分能量傳遞給樣品。l幫助樣品離子化?；|(zhì)是如何幫助樣品分子電離的？以正離子模式為例： 基質(zhì)吸收激光的紫外波長后增加能量，並將能量部分釋放給樣品分子 幫助樣品分子質(zhì)子化，並帶有電荷（M+H+） M+H+ 在真空狀態(tài)下，霧化形成氣態(tài)單一分子。在高壓電場的吸引下M+H+ 離開離子源飛向飛行管Matrix - CHCA常用基質(zhì)及選擇基質(zhì)樣品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，極性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，極性聚合物HPA核苷酸Dithra

4、nol非極性聚合物IAA非極性聚合物E=Uz=1/2mvE=Uz=1/2mv2 2 和和 t=t=L/VL/V E E：離子在加速電場獲得的動能離子在加速電場獲得的動能; ; UU：加速電場電壓加速電場電壓z z：離子所帶電荷離子所帶電荷; ; mm：離子質(zhì)量離子質(zhì)量v v：離子飛行速度離子飛行速度; ; L L：飛行管道長度飛行管道長度t t：離子飛行時間離子飛行時間; ; c c：常數(shù)常數(shù) 質(zhì)量分析范圍：質(zhì)量分析范圍：500500Da-100KDaDa-100KDaMALDI-TOF質(zhì)譜的原理t = c m/zPulsed laser3.多肽離子在多肽離子在TOF管里飛行，飛行速度管里飛行

5、，飛行速度取決于多肽離子的取決于多肽離子的M/Z的大小的大小 Flight tube1：基質(zhì)與多肽樣本共同：基質(zhì)與多肽樣本共同置于剛靶上。置于剛靶上。High vacuumTimeHigh voltage2. 樣本被激光電離形成多肽樣本被激光電離形成多肽離子混合物離子混合物 。20 - 25 kV5. 檢測到每個離子的檢測到每個離子的M/Z后，同一張圖譜上計算機輸后，同一張圖譜上計算機輸出每個肽段出每個肽段M/Z，即蛋白質(zhì)的多肽圖譜，通過與理論，即蛋白質(zhì)的多肽圖譜，通過與理論數(shù)據(jù)庫中的肽圖片比對，從而鑒定蛋白。數(shù)據(jù)庫中的肽圖片比對，從而鑒定蛋白。4. 到達檢測器的離到達檢測器的離子，通過檢測器

6、檢子，通過檢測器檢測出每個肽段離子測出每個肽段離子的的M/Z.1.3 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜的分析步驟質(zhì)譜的分析步驟LaserMALDI-TOF-MS線性模式檢測SampleplateAnalytemolecules in matrixAccelerationgridsDrift tubeIon detectorMass spectrumVacuum systemVacuumlock幾秒鐘即可得到結(jié)果 MALDI-TOF MALDI-TOF 質(zhì)譜的特點質(zhì)譜的特點 軟電離質(zhì)譜碎片少 檢測質(zhì)量范圍寬400kDa 靈敏度高 fmol 分析速度快自動化 數(shù)據(jù)容易解釋 可以測試混合物 可以測試高分

7、子 儀器容易使用、維護triggerdiode laservariableattenuator250 l/sturbo250 l/sturbo3.4 m reflector1.8 m linearMALDI TOF MS的構(gòu)成的構(gòu)成檢測器檢測器1：線性模式：線性模式檢測器檢測器2：反射模式：反射模式線性模式和反射模式反射模式（linear）1. 一般測試分子量小于4000的樣品2. 分辨率高，單同位素清晰準確線性模式（reflection）1. 一般測試大分子量樣品（M4000）2. 分辨率低，得到是平均分子量的質(zhì)荷比反射模式下反射模式下TOFTOF的分辨率高于線性模式的分辨率高于線性模式Br

8、uker公司儀器示意圖ABI公司儀器示意圖島津公司儀器示意圖DetectorHelium collision cell for fragmentgenerationIon gate forparent ionselectionPulsed LasergeneratesMALDI ions20 KeVMALDI IonSourceMALDI-TOF質(zhì)譜的應(yīng)用質(zhì)譜的應(yīng)用應(yīng)用應(yīng)用MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技術(shù)技術(shù)鑒定和分類微生物鑒定和分類微生物待檢樣品克隆選擇樣品制備質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)分析菌種鑒定?Bacillus globigiiProfiling results from dif

9、ferent Bacillus strains -6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000a.i.B. globigiiB. licheniformisB. subtilisB. thuringiensis實驗流程Result Report | Detected Species | Ranking |act Sc |max Sc |Rel Score |PN k |PN b |PN m |Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro-Spectrum #12 | Ps. mendocina DSM50017 | 1 | 3813 | 4271 | 0.89

10、| 41 | 10 | 83 | 0.55 | 0.88 | 438 | Ps. oleovorans B396 | 2 | 1671 | 3450 | 0.48 | 14 | 8 | 83 | 0.22 | 0.39 | 41 | Ps. fluoreszens B340 | 3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19 | 4 | Ps. veronii DSM11331 | 4 | 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 | 3 | Ps. putida DSM291 | 5 | 374

11、 | 2821 | 0.13 | 3 | 3 | 83 | 0.05 | 0.12 | 1 | Ps. putida B401 | 6 | 329 | 2638 | 0.12 | 3 | 2 | 83 | 0.05 | 0.11 | 1基于譜圖模式比對的細菌鑒定應(yīng)用軟件應(yīng)用軟件BIOTYPERBIOTYPER細細菌鑒定結(jié)果的報告菌鑒定結(jié)果的報告MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定微生物優(yōu)勢技術(shù)鑒定微生物優(yōu)勢l速度快速度快，操作簡單，操作簡單l結(jié)果不受生長培養(yǎng)基影結(jié)果不受生長培養(yǎng)基影響，結(jié)果不受細菌響，結(jié)果不受細菌生長狀態(tài)影響生長狀態(tài)影響l重復(fù)性重復(fù)性, ,穩(wěn)定性好。穩(wěn)定性好

12、。( (在標準條件下進行樣在標準條件下進行樣本制備和測量后，在不同的本制備和測量后，在不同的MALDI-TOFMALDI-TOF儀器儀器上獲取的質(zhì)譜譜圖具有很高的可比性上獲取的質(zhì)譜譜圖具有很高的可比性。) )l高通量，成本低。高通量，成本低。建立已知微生物的標準蛋白質(zhì)組建立已知微生物的標準蛋白質(zhì)組指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫指紋質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫l取得微生物標準品的單克隆取得微生物標準品的單克隆樣品樣品l樣品進行樣品進行MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS分析分析得到標準品質(zhì)譜得到標準品質(zhì)譜l建立多種常規(guī)檢測目標微生建立多種常規(guī)檢測目標微生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫l未知樣品通過未知樣品通過MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS分析得到質(zhì)譜分析得到質(zhì)譜l未知樣品質(zhì)譜進入建立好的未知樣品質(zhì)譜進入建立好的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行比對質(zhì)譜數(shù)