1、Process Optimization and Scale up -Section II 細(xì)胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化與放大 II趙偉, 產(chǎn)品應(yīng)用專家,185-8882-8306wei.zhaosartorius-曲妥珠單抗生物仿制藥開發(fā)及工藝放大曲妥珠單抗生物仿制藥開發(fā)及工藝放大Biosimilar 定義定義EMA對生物仿制藥的定義 European Medicines Agency (EMA) 27 September 2012 生物仿制藥是一類與專利藥（reference medicine）高度相似的生物類制劑，與化學(xué)仿制藥不同，不是簡單化學(xué)結(jié)構(gòu)的完全仿制。生物仿制藥必須具有與專利藥相似的功能基團

2、，允許兩者之間存在微小的差異，但需要證明差異不影響藥物安全性及功效。WHO對生物仿制藥的定義 WHO Technical Report Series No. 977, 2013生物仿制藥是一類與專利藥在質(zhì)量、安全和功效上相似的治療性生物制品FDA采納的對生物仿制藥的定義 Food and Drug Administration （FDA) 2015（美國公共健康服務(wù)法，PHS Act；生物藥價格競爭與創(chuàng)新法， BPCI Act ）生物仿制藥是一類與專利藥高度相似，但又存在微小差異的生物制品，兩者在安全性、純度和效能上不存在臨床差異（ PHS Act ）。但人工合成的多肽不屬于此列（ BPCI

3、Act ）。生物仿制藥充滿機遇生物仿制藥充滿機遇生物仿制藥參考專利藥的使用范圍及用量生物仿制藥在專利藥專利保護過期后可以獲得批準(zhǔn) 1995至2017年歐美生物藥（Biologics）專利到期情況仿制藥則無需負(fù)擔(dān)藥物研發(fā)的費用；無需經(jīng)過昂貴的臨床試驗（II期臨床）提供證明其安全性和有效性的數(shù)據(jù)生物藥是在受控條件下發(fā)酵和純化產(chǎn)生的1. 插入編碼目的蛋白的基因，確定合適的宿主細(xì)胞（需要精確的DNA序列和宿主細(xì)胞類型）2. 建立細(xì)胞庫(通過反復(fù)精細(xì)的篩選，建立獨一無二的原始細(xì)胞庫)3. 生產(chǎn)蛋白質(zhì)（復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和修飾）4. 純化5. 分析6. 藥物成型5/21/2022page 5多級步驟多項測試（超過

4、2000項測試）生物（仿制）藥工藝開發(fā)流程生物（仿制）藥工藝開發(fā)流程目錄目錄 單抗仿制藥工藝放大單抗仿制藥工藝放大 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)主因素分析 放大策略選擇與試錯 工藝放大與質(zhì)量控制工藝條件的影響不同變溫條件下的培養(yǎng)基篩選不同變溫條件下的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞死亡與凋亡細(xì)胞死亡與凋亡大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)后期，維持細(xì)胞高活力顯得重要而困難。細(xì)胞在反應(yīng)器中易發(fā)生凋亡或壞死用基因工程方法導(dǎo)入bcl-2凋亡抑制基因，可以提高細(xì)胞密度與目的蛋白產(chǎn)量。流加培養(yǎng)基中三大營養(yǎng)成分流加培養(yǎng)基中三大營養(yǎng)成分葡萄糖：碳源+能源，濃度高易產(chǎn)生乳酸，抑制細(xì)胞谷氨酰胺：氮源+能源，耗竭易導(dǎo)致凋亡氨基酸、維生素及其他：必需和非必需氨基酸，膽堿、

5、生長因子和特殊氨基酸，如羥脯氨酸羧基谷氨酸流加時間點與頻率、變溫工藝研究流加時間點與頻率、變溫工藝研究目錄目錄 單抗仿制藥工藝放大單抗仿制藥工藝放大 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)主因素分析 放大策略選擇與試錯 工藝放大與質(zhì)量控制設(shè)計空間設(shè)計空間轉(zhuǎn)速 rpm通氣 Lpm泡沫粘度剪切力耗氧、CO2 累積minmaxminmax控制參數(shù)設(shè)計空間定義控制參數(shù)設(shè)計空間定義攪拌 n rpm 攪拌槳葉尖線速度u m/s 單位體積輸入功率 P/V W/m3 剪切力 1/s通氣F L/min單位體積通氣速率vvm Lpm/L通氣線速率 vs m/s體積溶氧系數(shù) kLa-value 1/hPage 23Biology + Proce

6、ss engineering BioProcess Engineering 實例實例：細(xì)胞蛋白藥物生產(chǎn)小試實驗在10L垂直攪拌罐中進行，獲得良好實驗結(jié)果后擬放大至200L，粘度=1.0510-3Pa*S，密度=1120Kg/m3。小試罐尺寸為：直徑D=174mm，攪拌葉輪d=70mm（D/d=2.5），高徑比H/D=2.1，液深HL=1.5D，裝液量為6L，通氣速率1.5vvm，使用3檔三葉斜槳攪拌槳葉，轉(zhuǎn)速n=125rpm?，F(xiàn)準(zhǔn)備在200L 反應(yīng)器（裝料60%，各工藝同上）中試驗，請設(shè)計試驗方案，獲得200L罐體放大操作參數(shù)。 請拿出紙筆進行演算，并記錄好放大的流程請拿出紙筆進行演算，并記錄

7、好放大的流程一、按照幾何相似原則確定一、按照幾何相似原則確定200L罐體尺寸：罐體尺寸：應(yīng)為幾何相似，H/D=2.1，D/d=2.5，HL/D=1.5，有效裝料體積仍取60%，由此可得：VL=0.2 m360%=/4D21.5D可得D=46.7cm， H=2.1D=98.07cm，d=D/2.5=18.68cm，HL=1.5D=70.05cm暫定仍使用3檔三葉斜槳攪拌槳葉1、核算小罐雷諾數(shù)，判斷流體流形、核算小罐雷諾數(shù)，判斷流體流形Re=nd2L/ =(125rpm/60min) (0.07m)2 (1120Kg/m3)/(1.0510-3Pa*S) =1.09104其中Np由攪拌強度及葉輪形

8、式確定，當(dāng)液體流形為充分湍流時，對六葉直槳渦輪， Np =6.0，對三葉斜槳， Np =4.7二、根據(jù)工藝條件與放大策略確定操作參數(shù)二、根據(jù)工藝條件與放大策略確定操作參數(shù)Pw0=3Npn3Ld5=34.7(125rpm/60min)3(1120Kg/m3)(0.07m)5 =2.4010-4 kW由Re=104判斷，液體流形為充分湍流當(dāng)設(shè)定為3檔攪拌時，反應(yīng)器不通氣時攪拌功率為2、試算大罐體積溶氧系數(shù)、試算大罐體積溶氧系數(shù)根據(jù)通氣速率為1.0vvm，裝液體積為6L，計算反應(yīng)器通氣時攪拌功率為：Pwg=2.2510-3(Pw02nd3/Q0.08)0.39 =2.2510-3(2.4010-4

9、kW) 2125rpm*(7cm)3/(6000mL/min)0.080.39 =2.1710-4.12 kWKLa=(2.36+3.3M)(Pwg/VL)0.56Vs0.7n0.710-9 =(2.36+3.33)(2.1710-4.12 kW/0.006m3) 0.56(37.88cm/min) 0.7(125rpm) 0.710-9 =1.2410-6Vs=Q/Ar=Q/(/4D2) =0.009m3/min /(/4(0.174m)2)=37.88cm/min 根據(jù)通氣量Q及反應(yīng)器截面積Ar，計算通氣線速度Vs為：根據(jù)福田秀雄關(guān)聯(lián)式獲得相應(yīng)體積溶氧系數(shù)KLa 計算值：3、檢驗大罐通氣線

10、速度、檢驗大罐通氣線速度根據(jù)維持通氣強度vvm不變的條件，計算大罐通氣截面線速度為：Vs=Q/Ar=Q/(/4D2) =（0.260%1.5）m3/min /(/4(0.467m)2)=105cm/min 對比小罐通氣截面線速度Vs= 37.88cm/min，大罐通氣線速度約為小罐2.8倍。經(jīng)驗表明適合氣速范圍在40至80cm/min之間。故折中取60cm/min，由此可計算出大罐通氣速率為：Q=VsAr=Vs (/4D2) =（60/100）m/min (/4(0.467m)2)=0.103m3/min通氣強度為：0.103/（0.260%）=0.858 vvm4-1、按照、按照KLa相等原

11、則計算放大罐攪拌速度和功率相等原則計算放大罐攪拌速度和功率放大罐的KLa=(2.36+3.3M)(Pwg/VL)0.56Vs0.7n0.710-9 =(2.36+3.33)(Pwg/0.12m3) 0.56(60cm/min) 0.7n0.710-9 =7.0610-7Pwg 0.56n0.7根據(jù)Kla相等條件得：KLa=1.2410-6= 7.0610-7Pwg 0.56n0.7即 Pwg=2.73n-1.25 式aPwg=2.2510-3(Pw02nd3/Q0.08)0.39 =2.2510-3Pw02n(18.68cm)3/(103000mL/min)0.080.39 =0.048Pw0

12、0.78n0.39 式b另根據(jù)經(jīng)驗公式計算大罐通氣攪拌功率為：聯(lián)立式a 與式bPwg=2.73n-1.25=0.048Pw00.78n0.39得 Pw0=177.79n-2.10 kW 式c再由非通氣攪拌功率計算公式得：Pw0=Npn3Ld5=4.7(n/60)3(1120Kg/m3)(0.1868m)5 =5.5410-6n3 kW 式d聯(lián)立式c和d：n=29.64 rpmPw0=0.144 kW Pwg= 0.0397 kW4-2、按照、按照P/VL相等原則計算放大罐攪拌速度和功率相等原則計算放大罐攪拌速度和功率利用經(jīng)驗公式求解的KLa往往有較大誤差，對一些發(fā)酵系統(tǒng)并不理想，利用實際測量的

13、KLa值，計算單位體積輸入攪拌功率P/VL則更適于真實的非牛頓流體放大根據(jù)P/VL相等原則，有n2/n1(d1/d2)2/3n2=n1 (d1/d2)2/3=125(70/186.8) 2/3=65rpm因此反應(yīng)器不通氣時攪拌功率為：Pw0=3Npn3Ld5=34.7(65rpm/60min)3(1120Kg/m3)(0.1868m)5 =4.57 kWPwg=2.2510-3(Pw02nd3/Q0.08)0.39 =2.2510-34.57265(18.68cm)3/(103000mL/min)0.080.39 =0.8036 kW根據(jù)經(jīng)驗公式計算大罐通氣攪拌功率為：取通氣截面線速度60cm

14、/min： KLa=(2.36+3.3M)(Pwg/VL)0.56Vs0.7n0.710-9 =(2.36+3.33)(0.8036 /0.12m3) 0.56(60cm/min) 0.7650.710-9 =11.60710-6目錄目錄 單抗仿制藥工藝放大單抗仿制藥工藝放大 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)主因素分析 放大策略選擇與試錯 工藝放大與質(zhì)量控制需通過可比性研究顯示在質(zhì)量、非臨床、臨床療效和臨床安全性方面的相似性，重點在于質(zhì)量相似（受生產(chǎn)過程影響），包括蛋白結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵基團的生物活性。安全與療效相似則包括風(fēng)險（免疫反應(yīng)風(fēng)險）與效益方面的一致。質(zhì)量評價質(zhì)量評價生產(chǎn)工藝鑒定物化特性生物活性免疫化學(xué)特性雜質(zhì)特性分

15、析方法穩(wěn)定性臨床評價臨床評價藥效動力學(xué)研究 （PD)藥代動力學(xué)研究 （PK)PD/PK研究功效研究等效優(yōu)劣分析等效統(tǒng)計分析安全性評價免疫原性分析安全與功效數(shù)據(jù)延展非臨床評價非臨床評價一般因素特殊因素體外實驗體內(nèi)實驗相似性評價相似性評價非臨床非臨床通過充分藥代動力學(xué)（PK）研究確定給藥方案通過充分毒理學(xué)試驗確定藥效學(xué)（PD）作用和安全特征臨床臨床比較藥代動力學(xué)、安全性和有效性所有實驗必須包含免疫原性試驗批準(zhǔn)后仍須繼續(xù)檢測安全性風(fēng)險管理風(fēng)險管理36生產(chǎn)中的動物細(xì)胞培養(yǎng)nutrients營養(yǎng)物質(zhì)cell bio massproduct yield產(chǎn)品收率cell viability細(xì)胞活性produ

16、ctstability產(chǎn)品穩(wěn)定性process parameter:工藝參數(shù)：temperature溫度pH value pH值incubation time孵育時間feeding補料shear stressing剪切應(yīng)力mixing混合混合活細(xì)胞生長信號5/21/2022page 27細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境1、氨：抑制細(xì)胞生長2、乳酸：高濃度乳酸抑制細(xì)胞生長3、二氧化碳：產(chǎn)生細(xì)胞毒性或改變代謝水平 葡萄糖和谷氨酰胺代謝 A:谷氨酰胺酶 B:谷氨酸脫氫酶 C:谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)移酶 D:蘋果酸酶盡量保證90%葡萄糖能進入三羧酸循環(huán)，生成水和CO2乳酸代謝能量代謝與產(chǎn)物表達(dá)的關(guān)系能量代謝與產(chǎn)物表

17、達(dá)的關(guān)系限制培養(yǎng)過程產(chǎn)率的關(guān)鍵因素限制培養(yǎng)過程產(chǎn)率的關(guān)鍵因素營養(yǎng)物耗竭 葡萄糖 谷氨酰胺 其他必需的氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素等 共計30種必需的營養(yǎng)成分 代謝副產(chǎn)物積累 氨（銨離子） 乳酸 非必需氨基酸 CO2 其他抑制物 BioPAT Trace藥物蛋白對生產(chǎn)條件敏感藥物蛋白對生產(chǎn)條件敏感5/21/2022page 32生產(chǎn)的細(xì)微變化影響生物藥完整功能生產(chǎn)的細(xì)微變化影響生物藥完整功能5/21/2022page 33不同的的糖基化模式可產(chǎn)生不同功效的蛋白亞型。藥物蛋白的藥效、藥代動力學(xué)特性取決于三維結(jié)構(gòu)、糖基化程度、亞型及聚集程度。全世界用全世界用10年時間才了解生物制劑生產(chǎn)過年時間才了解生物制劑生產(chǎn)過程中的小差異會導(dǎo)致巨大功效影響程中的小差異會導(dǎo)致巨大功效影響生產(chǎn)穩(wěn)定控制與生物仿制藥多樣性生產(chǎn)穩(wěn)定控制與生物仿制藥多樣性5/21/2022page 34以歐洲重組人促紅細(xì)胞生成素的質(zhì)量規(guī)范為標(biāo)準(zhǔn)，對來自巴西、韓國、印度等13個國家的31種生物仿制藥進行了分析生物仿制藥潛在危害舉例生物仿制藥潛在危害舉例-單純紅細(xì)胞再生單純紅細(xì)胞再生障礙（障礙（PRCA）Alpha-重組人腎紅細(xì)胞生成素（Eprex）上市十年后發(fā)生PRCA爆發(fā)PRCA的爆發(fā)可能