1、第一章 重組DNA技術(shù)1. 寄主的限制和修飾現(xiàn)象： 細(xì)菌能將外來(lái)的 DNA片段某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不 為外來(lái)噬菌體所感染，而其自身的染色體 DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護(hù)，這 種現(xiàn)象叫做主的限制和修飾現(xiàn)象2.1限制性核酸內(nèi)切酶H類酶特點(diǎn)：識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一，并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)將DNA鏈切斷2.2 n類限制性核酸內(nèi)切酶命名：屬名一個(gè)字母（大寫(xiě)）+種名兩個(gè)字母（小寫(xiě)）+株名等+發(fā)現(xiàn)順序（羅馬字母）2.3限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些限制性核酸內(nèi)切酶的切割序列發(fā)生低特異性，這種性質(zhì)稱為限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性（限制性內(nèi)切酶在含

2、 50%甘油的緩沖液中，于-20C穩(wěn)定保存）2.4部分酶切：部分酶切是指，只對(duì)片段上一部分酶切位點(diǎn)產(chǎn)生切割。這種一般是在建庫(kù)， 或者需要酶切基因組后， 獲得一定大小范圍內(nèi)的片段而使用的酶切方法。這種酶切不要求獲得某一大小的片段，而是要獲得例如200-500bp的片段，在電泳上沒(méi)有條帶，而是smear。所以部分酶切需要嚴(yán)格控制酶的用量和時(shí)間，要嘗試稀釋后的酶液，切一定時(shí)間段內(nèi)，哪一個(gè)條件可以獲得目標(biāo)范圍的片段。部分酶切的條件需要更多的摸索，而且重復(fù)性要求也會(huì)更高。2.5同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同但切出的 DNA片段具有相同的末端序列2.6同裂酶：來(lái)源不同，識(shí)別序列相同，切割位點(diǎn)可以相同（同序同切酶）也

3、可以不同（同 序異切酶），存在位點(diǎn)偏愛(ài)現(xiàn)象。3.1甲基化酶：許多n類限制性核酸內(nèi)切酶都相應(yīng)存在著相對(duì)的甲基化酶，它們可修飾限制 性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列中某位堿基甲基化，從而使DNA免受相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶的切割。用途：就是在必要時(shí)可以封閉某一限制性核算內(nèi)切酶的切口。命名：在對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶名字前面加M甲基化對(duì)限制性核算內(nèi)切酶的影響：1.修飾酶切位點(diǎn) 2.產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)3.2 T4-DNA連接酶：在實(shí)驗(yàn)中絕大多數(shù)情況下使用的是T4-DNA連接酶，具有粘性末端和平末端。目前商品化的 T4-DNA連接酶是由大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)DNA連接酶：借助ATP或NAD水解提供的能量催化 DNA中相鄰的3

4、' -OH和5' -P之間形成 的磷酸二酯鍵3.3 S1核酸酶：來(lái)源于米曲霉菌，其特征如下：1降解單鏈DNA or RNA,降解DNA的速度大于降解 RNA的速度2降解發(fā)生的方式為內(nèi)切和外切，產(chǎn)生帶5 '磷酸的單核苷酸或寡核苷酸3. 酶切活性需要的酸性環(huán)境，且為 Zn2+所激活4. 酶量小時(shí)僅切割帶缺口或缺刻的雙鏈DNA5. 酶量過(guò)大時(shí)會(huì)降解雙鏈核酸，因?yàn)殡p鏈降解活性比單鏈低7.5萬(wàn)倍S1核酸酶常用來(lái)切平突出的單戀末端3.4 DNA聚合酶I :5'-3'聚合酶活性一聚合作用3'-5'外切酶活性一校對(duì)作用5'-3'外切酶活性

5、一切除修復(fù)作用（切口平移）Klenow酶：是大腸桿菌DNA聚合酶I的氨基大片段，沒(méi)有5' -3'外切酶活性，基因工程中常用該酶填平5 '突出的粘性末端3.5末端脫氫核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）:不需要模版只需要帶 3 '羥基末端引物的 DNA聚合酶, 在二價(jià)陽(yáng)離子的作用下，催化DNA的聚合作用，產(chǎn)生同源 3 '末端3.6堿性磷酸單酯酶：能將DNA RNA鏈及核苷酸的5 '端磷酸基團(tuán)切除。4.1載體：指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具，載體同外源DNA在體外重組成 DNA重組分子，在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因

6、子4.2載體應(yīng)具備的條件：1. 具有獨(dú)立復(fù)制的能力，有復(fù)制起點(diǎn)2. 具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)3. 具有合適的選擇標(biāo)記基因，用來(lái)篩選重組體DNA4. 能接納盡可能大的外源DNA片段，具有較高的外源 DNA的裝載能力4.3拷貝數(shù)：一種質(zhì)粒在一個(gè)細(xì)胞中存在的數(shù)目4.4多克隆位點(diǎn)：許多限制酶的切點(diǎn)5. 質(zhì)粒的基本特征：自主復(fù)制性、可擴(kuò)增性、不相容性、可轉(zhuǎn)移性、攜帶標(biāo)記基因嚴(yán)緊型復(fù)制：除了受本身的復(fù)制機(jī)制的控制外，還受染色體的嚴(yán)緊控制。質(zhì)粒的復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的在每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝松弛型復(fù)制：只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的約束宿主細(xì)胞不合成蛋

7、白質(zhì)時(shí)，松弛型質(zhì)粒仍繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞中通常具有較高的 拷貝數(shù)（10個(gè)以上）在增殖松弛型質(zhì)粒時(shí)，總是要讓宿主菌經(jīng)氯霉素處理抑制蛋白質(zhì)的合成 不相容性：兩種質(zhì)粒不能共存于同一受體細(xì)胞內(nèi)6.1入DNA載體及類型載體的構(gòu)建：縮短長(zhǎng)度-刪除重復(fù)的酶切口-加裝選擇標(biāo)記-構(gòu)建琥珀型密碼子的突變體 載體類型：插入型&取代型6.2入DNA包裝和限制包裝蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)合成，包裝蛋白首先結(jié)合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動(dòng)復(fù)合物，因此cos區(qū)對(duì)包裝至關(guān)重要包裝時(shí)由一個(gè)蛋白因子將 cos區(qū)交錯(cuò)切開(kāi)，從而保證只有一個(gè) DNA線狀分子被包裝在一個(gè) 噬菌體內(nèi)，每個(gè)宿主細(xì)胞可包裝多達(dá)100個(gè)成熟的入DNA分

8、子包裝對(duì) DNA本身的性質(zhì)無(wú)關(guān)，但對(duì)其大小要求比較嚴(yán)格，它只能包裝入DNA分子的75%-105% 入DNA全長(zhǎng)48.5kb，也就是說(shuō)可以包裝 36.4kb-50.9kb 范圍內(nèi)的 DNA包裝好了的入DNA便形成具有感染力的成熟的噬菌體顆粒7. 考斯質(zhì)粒及其特點(diǎn)含有入DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒由于入DNA在包裝時(shí)，其包裝蛋白只識(shí)別其粘性末端附近的一小段序列（cos區(qū)）將這一小片段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個(gè)重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段（45.9kb ）,同時(shí)它仍可像入DNA一樣在體外被包裝成具有感染活性的噬菌體顆粒，并高效 感染大腸桿菌不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞，其制備與質(zhì)粒相同進(jìn)入

9、細(xì)胞后，完全依靠質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制-攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選 含有多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆8. DNA片段的連接定向克??；外源 DNA片段定向插入載體分子粘性末端：（不同粘性末端的連接）1. 突出末端相同（5'突出）：用Klenow酶補(bǔ)平或S1核酸酶切平，之后再用T4DNA 連接酶連接2. 突出末端相同（3'突出）：用T4DNA聚合酶切平，之后再用 T4DNA連接酶連 接。3. 突出末端不同：用 Klenow酶補(bǔ)平或S1核酸酶切平，之后再用 T4DNA連接酶 連接平末端：屬于分子內(nèi)的連接，反應(yīng)速度要比粘性末端的連接慢得多添加同聚尾末端方向：用Klenow補(bǔ)平或者用同聚

10、結(jié)尾法都是從5' -3'，切5'突出用S1核酸酶，切3'突出用T4DNA聚合酶9. 提高重組率的方法：（1 ）提高外源DNA片段與載體的分子比（2）載體分子在連接前先除磷（3 ）用TdT加裝人工粘性末端10.1轉(zhuǎn)化子：將質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子10.2重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞10.3轉(zhuǎn)化率：產(chǎn)生菌落的總數(shù)/DNA的加入量。定義：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)11.感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞處于攝入外源 DNA的狀態(tài)12.1轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程12.2

11、轉(zhuǎn)染：將噬菌體（病毒） DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程12.3轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體顆粒為媒介轉(zhuǎn)移DNA的過(guò)程13.1抗菌性篩選法（ex環(huán)絲氨酸篩選）最常見(jiàn)的載體攜帶的標(biāo)志是抗藥性標(biāo)志，如抗氨芐青霉素（Ampr）、抗四環(huán)素（Tetr ）、抗卡那霉素（kanr ）等當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素是，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個(gè)抗藥性標(biāo)志就會(huì)消失13.2顯色模型篩選法（藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)）物體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子和非重組子14目的基因獲取方法： 基因組

12、文庫(kù)、CDNA文庫(kù)、人工合成、PCRT增提取等15.1基因組文庫(kù)：從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA將DNA降降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞， 這樣每一個(gè)細(xì)胞接受了含有一個(gè)基因組DNA片段與載體連接的重組 DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起組成一個(gè)含有基因 組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫(kù)15.2 cDNA文庫(kù)：提取出組織細(xì)胞的全部 mRNA在體外反轉(zhuǎn)錄成 cDNA與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA!息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)具有組織

13、細(xì)胞特異性15.3 cDNA合成(第二鏈的合成)：(1)自身引導(dǎo)法：由于尚不完全清楚的原因，單鏈cDNA的3'端會(huì)自發(fā)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。此法所得的cDNA在其5 '端有幾對(duì)堿基的缺失(2 )置換合成法：該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn)生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系 列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成第二鏈。此法所得的cDNA在其5 '端也有幾對(duì)堿基缺失。(3)引導(dǎo)合成法：首先制備一端帶有Poly (dG)的片段 n和帶有Poly (dT

14、)的載體片段I,并用片段I來(lái)代替 Oligo (dT)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈 cDNA合成后直 接采用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly (dC)的尾巴，同時(shí)進(jìn)行 酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段n 一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶I和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。此法所得的cDNA保留了完整的5 '端序列。第二章PCR1. PCR反應(yīng)體系主要由什么構(gòu)成的？作用？PCR反應(yīng)體系：核酸模版、引物、DNA聚合酶、dNTP Mg2+緩沖液核酸模版：可以以 DNA或 RNA為模版對(duì)靶序

15、列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增引物：互補(bǔ)于單鏈 DNA片段的一小段寡核苷酸。PCR產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定 dNTP四種濃度應(yīng)相同。dNTP能與Mg2+吉合，使游離的 Mg2+濃度降低TaqDNA聚合酶：可在高溫下仍具有活性。TaqDNA聚合酶具有5' -3'外切酶活性，但不具有3' -5'外切酶活性，因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒(méi)有校正功能。Taq聚合酶同時(shí)具有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的功能Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必須的，也影響著引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、 產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的形成等緩沖液：有利于引物退火2. PCR產(chǎn)物的特點(diǎn)：3 

16、9;都有一個(gè) A突出2. PCR技術(shù)的特點(diǎn)：RNA或 cDNA對(duì)起始材料質(zhì)量要求低、應(yīng)用敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快速、可擴(kuò)增 范圍廣3. 設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)一般要注意哪幾個(gè)方面：(3' 比 5'重要)引物長(zhǎng)度：不宜太長(zhǎng)或太短引物擴(kuò)增跨度：以 200-500bp為宜引物堿基 G+C含量：以40%-60為宜堿基分布：最好隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列引物自身和引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列：避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)引物3'端的堿基：特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基 不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗引物的5'端不嚴(yán)格，可以修飾引物的特異性：引物

17、應(yīng)與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其他序列無(wú)明顯同源性引物量應(yīng)適中，過(guò)高引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增；過(guò)低引起產(chǎn)物量降低4. PCR循環(huán)溫度參數(shù)的含義及設(shè)定PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟組成的。如某設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是 94C變性一分鐘，60C退火（低于擴(kuò)增引物在 PCR條件下真是Tm值5C） 1min , 72C延伸 1.5min。第三章原材料的選擇和處理1. 原材料預(yù)處理的目的：防止有效成分降解失活、后續(xù)操作的要求、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸2.1發(fā)酵液預(yù)處理的目的： 改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，以利于固液分離 去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作2.2發(fā)酵液預(yù)處理的主要方法：凝聚

18、和絮凝、稀釋、加熱、調(diào)ph、加沉淀劑等凝聚：在電解質(zhì)作用下，發(fā)酵液中的膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小的凝聚體的過(guò)程,由于雙電層排斥電位的降低，膠體表面水化層破壞或變薄，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象絮凝：在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過(guò)程，是種以物理的集合為主的過(guò)程3 細(xì)胞破碎有哪些方法？基本原理機(jī)械法：高壓勻漿法：利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針型閥，由于突然減壓和高速撞擊使細(xì)胞破裂高速珠磨法：進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的相互剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物 超聲波破碎法：由于超聲波的

19、 空穴作用（在超聲波作用下，氣泡形成、長(zhǎng)大和破碎，在氣泡 破碎期間，大量聲能轉(zhuǎn)化成機(jī)械能，引起局部的剪切使細(xì)胞破碎）引起的沖擊力和剪切力使 細(xì)胞破碎組織搗碎法：使用高速組織搗碎機(jī)，是一種激烈的破碎器。這種絞切力對(duì)動(dòng)植物組織有效 研磨法：可以利用研缽和研杵進(jìn)行研磨非機(jī)械法：化學(xué)法：化學(xué)滲透法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成 有機(jī)溶劑：用脂溶性的溶劑（如丙酮、氯仿、甲苯等）處理細(xì)胞時(shí)，可把細(xì)胞壁、細(xì)胞膜 的結(jié)構(gòu)部分溶解，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而將胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái) 表面活性劑：表面活性劑是兩性化合物，分子中有一個(gè)親水基團(tuán)和一個(gè)疏水基團(tuán)，在適當(dāng)?shù)膒h值和離子強(qiáng)度下，它們凝聚在一起形成微膠束，疏水

20、基團(tuán)聚集在膠束內(nèi)部將溶解的脂蛋白包在中心，而親水集團(tuán)則向外層，這樣使膜或壁的通透性改變或使之溶解，表面活性劑 方法特別適合于膜結(jié)合蛋白酶的溶解物理法：主要通過(guò)各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法 滲透法：將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中，達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到低滲透壓的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破碎，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放 到溶液中 反復(fù)凍融法：將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水形成的冰晶粒，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂酶溶法：利用酶反應(yīng)，

21、分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁的目的4. 蛋白質(zhì)和酶水溶液提取影響因素：離子強(qiáng)度：低離子強(qiáng)度溶液除了增加許多生化物質(zhì)的溶解度外，還對(duì)一些物質(zhì)生理活性有穩(wěn)定作用，所以稀鹽溶液常用于大多數(shù)生化物質(zhì)的提?。}溶和鹽析現(xiàn)象）PH值：一般選擇的ph值應(yīng)在偏離被提取的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的穩(wěn)定區(qū)內(nèi)。通常堿性蛋白質(zhì)選擇 偏酸的一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選在偏堿的一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度。盡量避免過(guò)酸，過(guò)堿， 一般控制在Ph6-8范圍溫度：蛋白質(zhì)和酶一般都不耐熱，提取時(shí)通常要求低溫操作攪拌：攪拌能促使溶質(zhì)與提取液的接觸，并能增加溶解度，一般采用溫和的攪拌方法，太快易產(chǎn)生泡沫是某些蛋白質(zhì)和酶變性失活5.1包含體：很多利

22、用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物不僅不能分泌到細(xì)胞外，反而在細(xì)胞內(nèi)聚集成沒(méi)有生物活性的直徑約為0.1-1微米的固體顆粒包含體 （過(guò)度表達(dá)產(chǎn)生的）。包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分是基因表達(dá)產(chǎn)物5.2包含體提取的一般操作步驟和方法：收集細(xì)胞t裂解細(xì)胞t回收包含體t洗滌包含體t溶解包含體t蛋白質(zhì)復(fù)性t蛋白質(zhì)純化 收集包含體：破碎含包含體的宿主細(xì)胞，通常使用機(jī)械破碎法，如高壓均漿法、超聲波破碎法、超聲波 結(jié)合溶菌酶破碎法等。離心收集包含體。洗滌包含體：為了出去包含體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白、核酸、脂質(zhì)等。洗滌劑通常是含去污劑 Triton X-100、脫氧膽酸鹽、低濃度的變性劑尿素、鹽酸胍等的

23、緩 沖液溶解包含體：一般采用強(qiáng)的變性劑：常用鹽酸胍濃度5-6mol/L、尿素6-8mol/L。加入還原劑，打開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵：二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、半胱氨酸等。加入金屬螯合劑如 EDTA等，防止已處于還原狀態(tài)的巰基與金屬離子發(fā)生反應(yīng)。蛋白質(zhì)復(fù)性：通過(guò)稀釋法把變性溶解的蛋白質(zhì)直接加入到復(fù)性液中，通過(guò)透析或凝膠過(guò)濾 法完全去掉變性劑和還原劑。第四章萃取技術(shù)1.1分配定律：在一定溫度，一定壓力的條件下，溶質(zhì)分配在兩個(gè)互不相溶的溶劑中，達(dá)到 平衡時(shí)溶質(zhì)在兩相中的活度之比為一常數(shù)，如果是稀溶液，活度可以用濃度代替1.2分配系數(shù)：分配定律中的常數(shù)被稱為分配系數(shù)K= 萃取相濃度/萃余項(xiàng)濃度。K越大，則在萃

24、取相中溶質(zhì)的溶解度越大1.3分離因素3 :表示目的產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果，可用分離因素表示。3值定義為產(chǎn)物與雜質(zhì)分配系數(shù)之比。分離因素體現(xiàn)了不同溶質(zhì)分配系數(shù)的差異，是實(shí)現(xiàn)萃取分離的基礎(chǔ)， 決定了兩種溶質(zhì)是否能分離2. 溶劑萃取的影響因素：pH值：水相ph值影響弱電解質(zhì)分配系數(shù)溶質(zhì)在不同ph下有著不同的解離狀態(tài)，在水中或有機(jī)溶劑中便有不同溶解度離子狀態(tài)的物質(zhì)易溶于水，非解離的分子狀態(tài)易溶于有機(jī)溶劑酸性物質(zhì)處于低 ph值，堿性物質(zhì)處于高 ph值時(shí)為分子狀態(tài)，轉(zhuǎn)溶于有機(jī)溶劑 溫度：溫度印象溶質(zhì)分配系數(shù)和萃取速度萃取操作一般在常溫或較低溫度下進(jìn)行離子強(qiáng)度：無(wú)機(jī)鹽的存在可降低溶質(zhì)在水相中的溶解度，有利于溶

25、質(zhì)向有機(jī)相中分配無(wú)機(jī)鹽的加入還能減少有機(jī)溶劑在水相中的溶解度無(wú)機(jī)鹽用量要適量，用量過(guò)多也有可能促使雜質(zhì)一起轉(zhuǎn)入溶劑相3.1雙水相體系：將兩種不同水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值時(shí)， 體系會(huì)自然地分成互不相溶的兩相，兩相中均含有水分，構(gòu)成雙水相體系3.2雙水相體系形成的原理由于高聚物之間的不相溶性：高聚物分子空間的阻礙作用，使其無(wú)法相互滲透， 不能形成均一相，從而產(chǎn)生相互分離的傾向。當(dāng)兩者濃度達(dá)到一定時(shí)即可分成兩相某些聚合物溶液和一些無(wú)機(jī)鹽溶液相混時(shí)，在一定濃度下，由于鹽析作用，也會(huì)形成兩相3.3相分離速度影響：相分離速度直接取決于相密度差，兩相密度差越大，相分離速度越快靠近臨

26、界點(diǎn)的相間密度差較小，因此相的分離速度較慢遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)的聚合物濃度高，聚合物富相的粘度會(huì)增加也會(huì)導(dǎo)致低的分離速度在中間組成時(shí)，分離速度最佳4.1超臨界流體：液體和壓力超過(guò)超臨界溫度和臨界壓力，介于氣體和液體之間的液體。4.2超臨界流體的特性：低粘度，高密度，擴(kuò)散系數(shù)大等特性4.3超臨界流體萃?。旱葴胤ǎ阂揽繅毫ψ兓妮腿》蛛x方法在一定溫度下，使超臨界流體和溶質(zhì)減壓，經(jīng)膨脹后分離，溶質(zhì)由分離器下部取出， 氣體經(jīng)壓縮機(jī)返回萃取器循環(huán)使用等壓法：依靠溫度變化的萃取分離法經(jīng)加熱、升溫使氣體和溶質(zhì)分離， 從分離器下部取出萃取物，氣體經(jīng)冷卻、壓縮后返回萃 取器循環(huán)使用吸附法：用吸附劑進(jìn)行的萃取分離法在分離器

27、中，經(jīng)萃取出的溶質(zhì)被吸附劑吸附，氣體經(jīng)壓縮后返回萃取器循環(huán)使用第五章沉淀法1.1鹽析原理：向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為鹽析。溶液中的鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度（失去水化膜），暴露出疏水區(qū)域，使蛋白質(zhì)的溶解度降低。鹽離子所帶電荷部分地中和蛋白質(zhì)分子上的電荷，蛋白質(zhì)表面的雙電層厚度降低，使蛋白質(zhì)分子之間靜電排斥作用減弱，也促使蛋白質(zhì)沉淀。1.2鹽析公式和各參數(shù)的意義以及影響因素：鹽析公式：lgS= 3 -KsIS為溶解度3為假設(shè)離子強(qiáng)度等于 0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度的對(duì)數(shù)值，它可由直線延長(zhǎng)與縱軸交點(diǎn)的截距

28、 求得。其不但與 蛋白質(zhì)的性質(zhì)和鹽的種類 有關(guān)，而且還與 溶液的ph值和溫度 有關(guān)，在高離 子強(qiáng)度的溶液中，溫度升高一般使3值下降，即蛋白質(zhì)的溶解度下降。Kb為鹽析常數(shù)，它等于直線的斜率。它與溶液的ph和溫度無(wú)關(guān)，只依賴于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和鹽的種類。I為離子強(qiáng)度 2.鹽析方法：Ks鹽析：固定蛋白質(zhì)溶液的ph值和溫度，改變鹽的濃度（即離子強(qiáng)度）以達(dá)到沉淀的目的， 常用于蛋白質(zhì)的粗品分級(jí)沉淀，如酶制劑的制備等3鹽析：在一定的離子強(qiáng)度下， 改變?nèi)芤旱膒h值或溫度以達(dá)到沉淀的目的。3鹽析常用于蛋白質(zhì)的進(jìn)一步分離純化，如蛋白質(zhì)、酶在飽和硫酸銨溶液中保溫結(jié)晶等3. 沉淀曲線及影響因素：沉淀曲線：在溶解度曲線中

29、，以曲線的斜率對(duì)硫酸銨溶液的飽和度作圖，由于這種沉淀作用的起始很迅速，以后逐漸變慢，形成了一條前沿陡峭，后沿比較平坦的蛋白質(zhì)沉淀的分布曲 線。影響因素：蛋白質(zhì)沉淀分布曲線的峰寬，由鹽析公式中的Ks決定，而峰在橫軸上的位置是由3值和蛋白質(zhì)的濃度決定的，所以說(shuō)其不但與 蛋白質(zhì)的性質(zhì)和鹽的種類 有關(guān)，而且還與溶液的ph值和溫度有關(guān)。4.1常用鹽的選用：硫酸銨是最普遍使用的鹽析劑無(wú)機(jī)鹽的挑選原則：較高的鹽析效能高溶解度，能配制高離子強(qiáng)度的鹽溶液溶解度受溫度的影響小鹽溶液的密度不高便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離不易引起蛋白質(zhì)的變性價(jià)格低廉4.2加入方式：加入固體鹽法飽和溶液法：可加入預(yù)先配制好的硫酸銨飽和溶液

30、透析鹽析：將蛋白質(zhì)溶液盛于透析袋，放入一定濃度的鹽溶液中，由于滲透壓的作用，使蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度發(fā)生連續(xù)性的變化，也會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的沉淀作用反抽提法4.3鹽析后脫鹽方法： 滲透法/超濾法、凝膠過(guò)濾法5.1有機(jī)溶劑沉淀原理：有機(jī)溶劑的加入會(huì)使溶液的介電常數(shù)減小，導(dǎo)致溶劑的極性減小水溶液有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有水化層的厚度有機(jī)溶劑可能破壞蛋白質(zhì)的某些鍵如氫鍵等，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某種變化， 致使一些原來(lái)包在內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于表面并與有機(jī)溶劑的疏水基團(tuán)結(jié)合形成疏水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形超過(guò)一定程度時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致完全的變性5.2影響因素：

31、溫度：多數(shù)蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑與水的混合液中，溶解度隨溫度降低而下降 ph值：一般在等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最低蛋白質(zhì)濃度：樣品較稀時(shí)，將增加溶劑投入量，降低了溶質(zhì)收率，容易產(chǎn)生稀釋變性，但 共沉作用小，濃的樣品會(huì)增強(qiáng)共沉作用，降低分辨率，但減少了溶劑用量，提高了回收率， 且樣品變性小于稀溶液離子強(qiáng)度：中性鹽存在會(huì)增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，溶液中含有適量的低的離子強(qiáng)度，對(duì)酶或蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用，可防止變性，但加入量太多，影響分級(jí)作用多價(jià)陽(yáng)離子的影響6. 介電常數(shù)和溶劑極性的關(guān)系：介電常數(shù)越小，溶劑極性越小第六章膜分離1.1膜分離：利用具有一定選擇透過(guò)特性的介質(zhì)在推動(dòng)力作用下進(jìn)行物質(zhì)的分離純化1.2各

32、類膜分離技術(shù)的原理：以濃度差為推動(dòng)力的過(guò)程A、滲透：當(dāng)把溶液和溶劑分別置于此膜的兩側(cè)時(shí)，純?nèi)軇⒆匀淮┻^(guò)半透膜而自發(fā)地向溶 液（或從低濃度向高濃度）一側(cè)流動(dòng)B 透析：借助膜的擴(kuò)散使各種溶質(zhì)得以分離的過(guò)程，與滲透的區(qū)別：膜不同。以壓力差為推動(dòng)力的過(guò)程A、反滲透：在溶液的液面上施加一個(gè)大于滲透壓的壓力P時(shí)，溶劑將于原來(lái)的滲透方向相反，開(kāi)始從溶液向溶劑一側(cè)流動(dòng)，這就是反滲透B 超濾：通過(guò)膜的篩分作用將溶液中大于膜孔的大分子溶質(zhì)截留，使這些溶質(zhì)與溶劑小分 子組成分離的膜過(guò)程C 納濾：納濾膜的孔徑為納米級(jí)，介于反滲透膜和超濾膜之間，能截留透過(guò)超濾膜的那部 分小分子量的有機(jī)物，透過(guò)被反滲透膜所截留的無(wú)機(jī)鹽

33、D微孔過(guò)濾：利用膜的篩分性質(zhì)，以壓差為傳遞推動(dòng)力進(jìn)行分離的膜過(guò)程 以電場(chǎng)力為推動(dòng)力的過(guò)程A、電滲析：在透析的基礎(chǔ)上加上直流電，極大加快離子的透析速度。膜分離過(guò)程中，離子 在電勢(shì)的驅(qū)動(dòng)下，通過(guò)選擇性滲透膜，從一種溶液向另一種溶液遷移2.1分離膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)一是分不分層及各層的厚度，二是每一層內(nèi)孔的形態(tài)及多少?？煞譃閷?duì)稱膜（均質(zhì)膜）和不對(duì)稱膜（主要由起膜分離作用的表面活性層和起支撐強(qiáng)化作用的惰性層構(gòu)成）2.2孔道結(jié)構(gòu)：包括孔徑、孔徑分布和孔隙度孔徑分布是指膜中一定大小的孔的體積占整個(gè)孔體積的百分?jǐn)?shù)，孔隙度是指整個(gè)膜中孔所占的體積百分?jǐn)?shù)，孔徑分布窄的膜比孔徑分布寬的膜要好3.1截留率：表征膜對(duì)溶質(zhì)的截

34、留能力，如果膜能完全截留溶質(zhì)，R=1,弱國(guó)溶質(zhì)可自由透過(guò)，則R=03.2截留分子量：指能被膜截留住的最小溶質(zhì)分子質(zhì)量4.1膜污染：由于在膜表面上形成了附著層或膜孔堵塞等外部因素，導(dǎo)致膜性能變化，它不 僅使膜的透水率降低，而且使其截留分子變小4.2膜劣化：膜自身發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變化等內(nèi)部因素導(dǎo)致膜性能變化5.1濃差極化：在膜分離操作中，所有溶質(zhì)均被透過(guò)液傳送到膜表面上，不能完全透過(guò)膜的 溶質(zhì)受到膜的截留作用，在膜表面附近濃度升高，這種在膜表面附近濃度高于主體濃度的現(xiàn) 象稱為濃度極化或濃差極化5.2減小濃差極化的方法：采用切向流過(guò)濾法使被處理溶液平行于濾膜表面流動(dòng)，與濾過(guò)方向垂直(相切)，溶液在壓

35、力的作用下濾過(guò)，可有效地破壞濃差極化的形成條件采用湍流，可加快料液流速，大大減少濃差極化對(duì)透水率的影響降低料液粘度等第七章層析技術(shù)1.凝膠層析的原理：利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對(duì)混合物中各組分按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)2.1 Kd參數(shù)及大小的意義：分配系數(shù)Kd是衡量溶質(zhì)被排阻程度的一個(gè)特征性常數(shù)：Kd=(Ve-Vo) /ViVe：洗脫體積Vo：外水體積Vi :內(nèi)水體積Kd=0表示全排阻，Kd=1表示全通過(guò)，一般來(lái)說(shuō) 0 < Kdw 12.2床體積、內(nèi)水體積、外水體積、洗脫體積床體積Vt :凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積外水體積Vo：層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間的空隙內(nèi)

36、水體積 Vi :凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這部分間隙的總和稱為內(nèi)水體積，不包含固體支持物體積Vg洗脫體積Ve：指被分離物質(zhì)通過(guò)凝膠柱所需洗脫液的體積3.1組別分離：如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分写蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，由于他們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離3.2分級(jí)分離：如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又 叫分級(jí)分離4.Sephadex G類凝膠及代號(hào)的意義葡聚糖凝膠的商品名為Sephadex,它是由葡聚糖加入交聯(lián)劑環(huán)氧丙烷通過(guò)醚鍵相互交聯(lián)聚合而成的，其網(wǎng)孔大小可通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡萄糖的比例以及反應(yīng)條件來(lái)控制。不同規(guī)格型

37、號(hào)的葡聚糖用英文字母 G表示，后面的數(shù)字為凝膠吸水量的10倍，數(shù)字越大，孔徑越大。5.1離子交換劑及類型離子交換劑通常由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成，通常是一種不溶性高分子化合物，有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或巨大的表面積，有較多的交換基團(tuán)，有穩(wěn)定的物化性質(zhì)類型：陽(yáng)離子交換劑：強(qiáng)酸型、弱酸型陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑：強(qiáng)堿型、弱堿型陰離子交換劑正離子用陽(yáng)離子交換劑分離，負(fù)離子用陰離子交換劑分離，酸性蛋白質(zhì)用陰離子交換劑較好，堿性蛋白質(zhì)用陽(yáng)離子交換劑較好。5.2轉(zhuǎn)型：離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過(guò)程5.3再生：使用過(guò)的離子交換劑，可采用一定的方法令其恢復(fù)原來(lái)的性狀5.4交換容量：離子交換劑與溶液中離

38、子或離子化合物進(jìn)行交換的能力6. 離子交換層析的原理離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子的溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑對(duì)需要分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。低離子強(qiáng)度有利于吸附，高離子強(qiáng)度有利于洗脫平衡：讓緩沖液恒壓流過(guò)層析床，流速可比操作時(shí)的流速略高。緩沖液的用量至少為床體積 的兩倍，這樣才能使層析床壓實(shí)穩(wěn)定，并使交聯(lián)劑與緩沖液達(dá)到平衡洗脫：使起始條件下發(fā)生吸附的目的物從離子交換劑上解吸?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的ph值或離子強(qiáng)度，改變離子強(qiáng)度是最常用的洗脫法。7. DEAE-Sephadex A-25、DEAE-Sepharose CL-6B （或

39、 CM類各符號(hào)的意義）CM-（羧甲基） DEAE-（二乙基氨基乙基）為功能基Sephadex為葡聚糖，Sepharose為瓊脂糖CM纖維素為陽(yáng)離子交換劑，DEAE纖維素為陰離子交換劑陰離子交換劑用英文字頭 A,陽(yáng)離子交換劑用英文字頭C,英文字母后面的數(shù)字表示型號(hào)。Sepharose CL-6B中的數(shù)字代表凝膠中瓊脂糖含量的百分?jǐn)?shù)，數(shù)字越大孔徑越小8. 親和層析的基本原理可親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組分的樣品通過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其他沒(méi)有親和力的無(wú)關(guān)組分就隨流動(dòng)相流出，然后改變流動(dòng)組成分，將結(jié)合的親和物洗脫下來(lái)。9. 載體的排斥效應(yīng)？空間障礙和解決方法載體的排斥效應(yīng)：利用凝膠作親和層析的載體時(shí)，孔徑大小決定了配基與其親和化合物相互 作用的可能性，如果將特異性配基固定在小孔徑凝膠載體上，載體會(huì)明顯地阻止大分子化合物與配基結(jié)合，從而影響親和柱的吸附效率。載體的空間障礙：當(dāng)配基固定在載體上后，載體往往產(chǎn)生對(duì)配基的空間障礙作用，影響了分離物與固定化配基的親和效果，小分子配基尤其