1、離子交換層析、凝膠色譜、離子交換纖維素色譜法  (2009-07-16 09:26:05)轉(zhuǎn)載標(biāo)簽： 雜談分類： 生物專業(yè)對3者進(jìn)行了細(xì)心總結(jié)離子交換層析（ion exchange chromatography）離子交換層析（簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤堿性物質(zhì)交換過程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離

2、子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂 。離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。因為蛋白質(zhì)分子在PH高于其等電點的溶液中-COOH會部分解離釋放質(zhì)子從而帶負(fù)電。蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷時叫做陰離子交換，蛋白質(zhì)帶有正電荷時叫做陽離子交換。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白

3、質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。                          離子交換層析法分離氨基酸 &#

4、160; 原理：所用樣品為天冬氨酸和組氨酸的混合液，分別屬酸性氨基酸(pI2.77)、堿性氨基酸(pI7.59)，用強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂Dowex50，在一定的洗脫條件下洗脫，將它們分離。利用氨基酸可與茚三酮反應(yīng)生成有色化合物進(jìn)行氨基酸鑒定1、層析：將Dowex50裝柱后，用0.1mol/L NaOH清洗樹脂5分鐘。再用pH4.2檸檬酸緩沖液平衡10分鐘。（方法同凝膠層析法）加樣8滴。當(dāng)樣品進(jìn)入樹脂后，加入pH4.2檸檬酸緩沖液洗脫加樣后立即收集，每管收集3ml（控制流速15滴/分鐘）。當(dāng)?shù)谝环逡怀霈F(xiàn)，換用0.1mol/L NaOH作洗脫液，直至第二峰收集完畢。用pH4.2緩沖液再平

5、衡10分鐘，再生。2、檢測：從第2管起每收集管中加入2ml茚三酮顯色液，充分混合，沸水浴15分鐘，自來水冷卻，觀察氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)，若生成紫色化合物，則說明收集到氨基酸。                       凝膠色譜法凝膠色譜技術(shù)是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。目

6、前已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。一、基本理論     （一）分子篩效應(yīng)一個含有各種分子的樣品溶液緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時，各分子在柱內(nèi)同時進(jìn)行著兩種不同的運(yùn)動：垂直向下的移動和無定向的擴(kuò)散運(yùn)動。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時向下移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，在向下移動的過程中，從一個凝膠內(nèi)擴(kuò)散到顆粒間隙后再進(jìn)入另一凝膠顆粒，如此

7、不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的凝膠就是分子篩。各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，就會全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進(jìn)入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進(jìn)入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。     綜上所述，在

8、凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進(jìn)入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，完全不能進(jìn)入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進(jìn)入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具

9、有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。     （二）色譜柱的重要參數(shù)     柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因引柱體積又稱“床”體積，常用Vt     表示。     外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這

10、部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。     內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進(jìn)入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。     不包括固體支持物的體積（Vg）。     峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve     表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置

11、所用洗脫液體積為Ve。     當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。二、凝膠的種類及性質(zhì)     （一）交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex）     Sephadex     G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephndex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水

12、值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克千膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。     Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。     （二）瓊脂糖凝膠：    商品名很多，常見的有，Sepharose

13、（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。     （三）聚丙烯酰胺凝膠：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠P （Bio-Gel

14、 P），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。     （四）聚苯乙烯凝膠商品為Styrogel ， 具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40，000，000的生物大分子，適用于有機(jī)多聚物，分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，洗脫劑可用甲基亞砜。三、實驗技術(shù)     （一）層析柱層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備

15、用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:110:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20:1100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖

16、尾出象，降低分辯力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。     （二）凝膠的選擇根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex     G-20的吸水量為20，1 克Sephadex     G200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細(xì)胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex

17、60;    G-200效果好， 脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。     （三）凝膠的制備商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時，自然膨脹需24小時至數(shù)天，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細(xì)菌和排除膠內(nèi)的空氣。     （四）樣

18、品溶液的處理 樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4（一般約0.5-2ml），進(jìn)行分族分離時樣品液可為凝膠床的10，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時，樣品可達(dá)凝膠床的20-30。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。     （五）防止微生物的污染 交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有: 

19、    疊氨鈉（NaN3）在凝膠層析中只要用0.02疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20時約為40；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)。     可樂酮Cl3C-C(OH)(CH3)2在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02。在微酸性溶液中它的殺菌效果最佳，在強(qiáng)堿性溶液中或溫度高于60時易引起分解而失效。     乙基汞代巰基水楊酸鈉 在凝膠層析中作

20、為抑菌劑使用濃度為0.05-0. 01。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。     苯基汞代鹽在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01。在微堿性溶液中抑效果最佳，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。         離子交換纖維素色譜法Sober和Peterson于1956年首次將離子交換基團(tuán)結(jié)合到纖

21、維素上，制成了離子交換纖維素，成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離。從此使生物大分子的分級分離方法取得了迅速的發(fā)展。離子交換基團(tuán)不但可結(jié)合到纖維上，還可結(jié)合到交聯(lián)葡聚糖（S-ephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）上。近年來離子交換色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體和多糖的分離和純化。它們的優(yōu)點是:具有開放性支持骨架，大分子可以自由進(jìn)入和迅速擴(kuò)散，故吸附容量大。具有親水性，對大分子的吸附不大牢固，用溫和條件使可以洗脫，不致引起蛋白質(zhì)變性或酶的失活。多孔性，表面積大、交換容量大，回收率高，可用于分離和制備。一、基本理論離子交換劑通常是一種不溶性高分子化合物，如樹脂，

22、纖維素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解離的基團(tuán)，這些基因在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用。雖然交換反應(yīng)都是平衡反應(yīng)，但在層析柱上進(jìn)行時，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷按正方向進(jìn)行，直至完全。因此可以把離子交換劑上的原子離子全部洗脫下來，同理，當(dāng)一定量的溶液通過交換柱時，由于溶液中的離子不斷被交換而波度逐減少，因此也可以全部被交換并吸附在樹脂上。如果有兩種以上的成分被交換吸著在離子交換劑上，用洗脫液洗脫時，在被洗脫的能力則決定于各自洗反應(yīng)的平衡常數(shù)。蛋白質(zhì)的離子交換過程有兩個階段吸附和解吸附。吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可以通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而達(dá)到解離但

23、更多的是通過增加離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭離子交換劑上的電荷位置，使吸附的蛋白質(zhì)與離子交換劑解開。不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成電鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的。二、離子交換的分類及常見種類（一）分類離子交換劑分為兩大類，即陽離子交換劑和陰離子交換劑。各類交換劑根據(jù)其解離性大小，還可分為強(qiáng)、弱兩種，即強(qiáng)酸劑陽離子交換劑弱酸劑強(qiáng)鹼型陰離子交換劑弱鹼型。1.陽離子交換劑陽離子交換劑中的可解離基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羥基（-OH）等酸性基。某些交換劑在交換時反應(yīng)如下：強(qiáng)

24、酸性：R-SO3-H+Na+ R-SO3- Na+H+弱酸性：R-COOHNa+ R-COONaH+國產(chǎn)樹脂中強(qiáng)酸1×7（上海樹脂732）和國外產(chǎn)品Dowex 50、Zerolit 225等都于強(qiáng)酸型離子交換劑。2.陰離子交換劑陰離子交換劑中的可解離基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺N-（CH3）2和季胺-N（CH3）2等鹼性基團(tuán)。某些交換反應(yīng)如下：強(qiáng)鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH-Cl R-N+（CH3）2 ClOH-弱鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH-Cl R-N+（CH3）2 HClOH-強(qiáng)鹼性201號國產(chǎn)樹脂和國外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強(qiáng)鹼型陰離子交換劑。（二）種類1.纖維素離子交換劑：陽離子交換劑有羥甲基纖維素（CM-纖維素），陰離子交換劑有氯代三乙胺纖維紗（DESE-纖維素）。2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：是將交換基因連接到交聯(lián)葡聚糖上制成的一類交換劑，因而既具有離子交換作用，又具有分子篩效應(yīng)，是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離