1、第三章第三章 氨基酸氨基酸掌握：氨基酸的分類、酸堿化學及化學反應掌握：氨基酸的分類、酸堿化學及化學反應熟悉熟悉: 氨基酸的分子組成氨基酸的分子組成了解：氨基酸的光學活性、光譜性質及分離純化了解：氨基酸的光學活性、光譜性質及分離純化第四章第四章 蛋白質的共價結構蛋白質的共價結構（一）掌握：肽的結構及其與功能的關系（一）掌握：肽的結構及其與功能的關系（二）熟悉：蛋白質的分子組成、分類（二）熟悉：蛋白質的分子組成、分類（三）了解：蛋白質的氨基酸序列與生物功能（三）了解：蛋白質的氨基酸序列與生物功能第五章第五章 蛋白質的三維結構蛋白質的三維結構（一）掌握：蛋白質的二、三、四級結構及其（一）掌握：蛋白質

2、的二、三、四級結構及其與功能的關系與功能的關系（二）熟悉：穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力（二）熟悉：穩(wěn)定蛋白質三維結構的作用力第六章第六章 蛋白質結構與功能的關系蛋白質結構與功能的關系（一）掌握：肌紅蛋白與血紅蛋白結構與功能（一）掌握：肌紅蛋白與血紅蛋白結構與功能的關系的關系（二）熟悉：血紅蛋白分子病的生化原理（二）熟悉：血紅蛋白分子病的生化原理第七章第七章 蛋白質的分離純化和表征蛋白質的分離純化和表征（一）掌握：蛋白質的分離和純化方法（一）掌握：蛋白質的分離和純化方法（二）熟悉：蛋白質的分子組成、理化性質（二）熟悉：蛋白質的分子組成、理化性質（三）了解：蛋白質的分離和純化的評價（三）了解：蛋白質

3、的分離和純化的評價第七章第七章蛋白質分離、純化蛋白質分離、純化 和表征和表征蛋白質的理化性質與分離純化蛋白質的理化性質與分離純化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein蛋白質結構和功能整體的生物化學描述來蛋白質結構和功能整體的生物化學描述來自于對于許多個別蛋白質的研究。自于對于許多個別蛋白質的研究。為了詳細地研究一個蛋白質為了詳細地研究一個蛋白質, ,必須將其從必須將其從細胞中存在的所有其它蛋白質中分離出來細胞中存在的所有其它蛋白質中分離出來, ,還必須有一些可用的技術來測定其

4、特征。還必須有一些可用的技術來測定其特征。蛋白質性質蛋白質性質 Ultraviolet light absorption( (紫外吸收紫外吸收) )Colour reaction( (顏色反應顏色反應) )（一）蛋白質的兩性電離（一）蛋白質的兩性電離 蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pHpH條件下條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 * * 蛋白質的等電點蛋白質的等電點( isoelectric point, pI) ( isoelect

5、ric point, pI) 當?shù)鞍踪|溶液處于某一當?shù)鞍踪|溶液處于某一pHpH時，蛋白質解離成正、時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的此時溶液的pHpH稱為稱為蛋白質的等電點。蛋白質的等電點。一、理化性質一、理化性質 凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質，等電凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質，等電點就偏堿性，如組蛋白、精蛋白等。反之，點就偏堿性，如組蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質，等電點就凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質，等電點就偏酸性，人體體液中許多蛋白質的等電點在偏酸性，人體體液中許多蛋白質的等電點在

6、pH5.0pH5.0左右，所以左右，所以在體液中以負離子形式存在體液中以負離子形式存在在。PrCOOH3N+H+OH+OHPrCOOH2NPrCOOHH3N+H+正離子，PHpI Protein Properties : 氨基酸的氨基酸的等電點等電點為其特征值為其特征值。而對蛋白質來說而對蛋白質來說, ,只有在無其它鹽類存在的條件只有在無其它鹽類存在的條件下測得的所謂下測得的所謂“等離子點等離子點”對每種蛋白質才是對每種蛋白質才是特征值。特征值。 中性鹽（中性鹽（CaCa2+2+、MgMg2+2+、ClCl- -、HPO4HPO42-2-）影響滴定曲）影響滴定曲 線形狀和等電點。線形狀和等電點

7、。等電點測定等電點測定: : 溶解度法和聚焦電泳法溶解度法和聚焦電泳法等電聚焦分離蛋白質的過程等電聚焦分離蛋白質的過程蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，在堿蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，在堿性區(qū)域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，當移動性區(qū)域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，當移動至某一至某一pHpH位點時失去電荷而停止移動，此處介質位點時失去電荷而停止移動，此處介質的的pHpH恰好等于該蛋白質分子恰好等于該蛋白質分子pIpI。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質分子帶正電荷向陰同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止，就不再極移動，直到它們的等電點上聚焦為止，就

8、不再泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。泳動，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 101098765432pHpI8.0蛋白質pI4.0蛋白質等電聚焦電泳分離蛋白等電聚焦電泳分離蛋白質質等電聚焦電泳法測定蛋白質等電聚焦電泳法測定蛋白質pI二、二、 蛋白質的大小與形狀蛋白質的大小與形狀測分子量的方法：測分子量的方法：化學組成法測定最低分子量化學組成法測定最低分子量SDS-PAGESDS-PAGE法法凝膠過濾法凝膠過濾法滲透壓法滲透壓法擴散系數(shù)法擴散系數(shù)法沉降系數(shù)法和沉降沉降系數(shù)法和沉降 平衡法平

9、衡法第二節(jié)蛋白質分子的大小與形狀第二節(jié)蛋白質分子的大小與形狀一、根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量：一、根據(jù)化學組成測定最低相對分子質量：假定某種假定某種微量成分微量成分只有一個，只有一個，測出其百分含量測出其百分含量后，可用比例式算出最低相對分子質量后，可用比例式算出最低相對分子質量。若測出兩種微量成分的百分含量，分別用比例若測出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對分子質量不相同時，可計算式算出的最低相對分子質量不相同時，可計算兩個最低相對分子質量近似的最小公倍數(shù)兩個最低相對分子質量近似的最小公倍數(shù)。 例題：一種純酶含亮氨酸（例題：一種純酶含亮氨酸（Mr 131Mr 131）1.

10、65%1.65%，含異亮，含異亮氨酸（氨酸（Mr131Mr131）2.48%2.48%，求最低相對分子質量。，求最低相對分子質量。解：按照解：按照LeuLeu的百分含量計算，最低的百分含量計算，最低Mr X1Mr X1： X1=(100X1=(100131)/1.65=7939.4131)/1.65=7939.4。按照按照IleIle的百分含量計算最低的百分含量計算最低Mr X2Mr X2： X2=(100X2=(100131)/2.48=5282.3131)/2.48=5282.3。由于由于X1X1和和X2X2數(shù)字差異較大，提示這種酶含數(shù)字差異較大，提示這種酶含LeuLeu和和IleIle不

11、止不止1 1個，為了估算個，為了估算LeuLeu和和IleIle的個數(shù)，的個數(shù)，首先計算：首先計算： X1/X2=7939.4/5282.31.5X1/X2=7939.4/5282.31.5。這種酶這種酶含任何氨基酸的個數(shù)均應是整數(shù)含任何氨基酸的個數(shù)均應是整數(shù)，說明該酶至少，說明該酶至少含有含有2 2個個LeuLeu，3 3個個IleIle，其最低相對分子質量為：，其最低相對分子質量為：7939.47939.42 =15878.82 =15878.8或或5282.35282.33=15846.93=15846.9。二、滲透壓法測定相對分子質量二、滲透壓法測定相對分子質量 三、沉降分析法測定相對

12、分子質量三、沉降分析法測定相對分子質量四、凝膠過濾法測定相對分子質量四、凝膠過濾法測定相對分子質量 當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分大分子物質由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的子物質由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，微孔，沿凝膠顆粒的沿凝膠顆粒的間隙間隙以較快的速度流過凝以較快的速度流過凝膠柱。而膠柱。而小分子物質小分子物質能夠進入凝膠顆粒的微孔能夠進入凝膠顆粒的微孔中，中，向下移動的速度較慢向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組，從而使樣品中各組分按相對分子質量從大到小的順序先后流出層分按相對分子質量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離

13、的目的。析柱，而達到分離的目的。 log SDS是是陰離子表面活性劑陰離子表面活性劑，與蛋白質結合形成，與蛋白質結合形成SDS-蛋白蛋白復合物，蛋白質分子即帶大量的負電荷，并遠遠超過原來復合物，蛋白質分子即帶大量的負電荷，并遠遠超過原來所帶的電荷，使天然蛋白質分子之間的電荷差別降低，甚所帶的電荷，使天然蛋白質分子之間的電荷差別降低，甚至可以忽略至可以忽略 同時蛋白質在同時蛋白質在SDS作用下結構變得松散，形狀趨向一致作用下結構變得松散，形狀趨向一致基本原理基本原理（電荷效應）三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀（一）蛋白質的膠體性質（一）蛋白質的膠體性質 大小在

14、大小在1-100nm1-100nm范圍內；范圍內； 同種電荷互相排斥；同種電荷互相排斥； 質點外圍有水化層。質點外圍有水化層。 （二）蛋白質的沉淀（二）蛋白質的沉淀 1.1.鹽析法鹽析法 2.2.有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 3.3.重金屬鹽沉淀法重金屬鹽沉淀法 4.4.生物堿試劑和某些酸類沉淀法生物堿試劑和某些酸類沉淀法 5.5.加熱變性沉淀法加熱變性沉淀法蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1 1萬至萬至100100萬之巨，其分子的直徑可達萬之巨，其分子的直徑可達1 1100nm100nm，為膠粒范圍之內。為膠粒范圍之內。 * * 蛋白質膠體穩(wěn)定的因素蛋

15、白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷顆粒表面電荷水化膜水化膜蛋白質的高分子性質蛋白質的高分子性質+帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉溶液中蛋白質的聚沉* * 蛋白質沉淀蛋白質沉淀在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變

16、性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。淀，但并不變性。 * * 蛋白質的凝固作用蛋白質的凝固作用(protein coagulation) (protein coagulation) 蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。 1.1.鹽析鹽析(salt precipitation)(salt precipitation) 在蛋白質溶液中加入大量中性鹽使蛋白質從在蛋白質溶液中加入大量中性鹽使蛋白質從溶液中析出的現(xiàn)象。溶液中析出的現(xiàn)象。

17、鹽析法不引起蛋白質的變性鹽析法不引起蛋白質的變性。 常用如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等常用如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等 原理：原理： 蛋白質表面電荷被中和蛋白質表面電荷被中和 水化膜被破壞水化膜被破壞 （三）蛋白質的沉淀（三）蛋白質的沉淀蛋白質的鹽溶和鹽析蛋白質的鹽溶和鹽析 定義定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質的一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽溶。原理原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質分子低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質分子間相互聚集

18、并從溶液中析出間相互聚集并從溶液中析出。 有機溶劑具有脫水劑功能，使蛋白質的水化膜脫有機溶劑具有脫水劑功能，使蛋白質的水化膜脫去。如乙醇、丙酮；（等電點、去。如乙醇、丙酮；（等電點、低溫低溫、短時間條件）、短時間條件）常用于實驗室蛋白質的提取。常用于實驗室蛋白質的提取。 丙酮沉淀丙酮沉淀時，必須在時，必須在0 044低溫下進行，丙酮低溫下進行，丙酮用量一般用量一般1010倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。淀。2.2.有機溶劑法有機溶劑法3.3.重金屬鹽法重金屬鹽法重金屬

19、離子帶正電荷與蛋白質結合生成不溶性重金屬離子帶正電荷與蛋白質結合生成不溶性的沉淀。的沉淀。( (醋酸鉛醋酸鉛) )蛋白質與重金屬結合成鹽共沉淀，蛋白質變性，蛋白質與重金屬結合成鹽共沉淀，蛋白質變性，用于除蛋白。用于除蛋白。蛋白質帶負離子蛋白質帶負離子臨床：蛋白質制劑催吐劑臨床：蛋白質制劑催吐劑4.4.生物堿試劑法生物堿試劑法某些酸：鞣酸、苦味酸、烏酸、三氯醋酸等能某些酸：鞣酸、苦味酸、烏酸、三氯醋酸等能與與帶正電荷的蛋白質帶正電荷的蛋白質結合產(chǎn)生不溶性的沉淀。結合產(chǎn)生不溶性的沉淀。蛋白質變性，無蛋白濾液的制備。蛋白質變性，無蛋白濾液的制備。由于蛋白質分子中由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪含有共

20、軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸氨酸和色氨酸，因此在，因此在280nm280nm波長波長處有特處有特征性吸收峰。蛋白質的征性吸收峰。蛋白質的ODOD280280與其濃度呈正與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。比關系，因此可作蛋白質定量測定。（四）蛋白質的紫外吸收（四）蛋白質的紫外吸收茚三酮反應茚三酮反應(ninhydrin reaction)(ninhydrin reaction) 蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚蛋白質經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。三酮反應。 雙縮脲反應雙縮脲反應(biuret reaction)(biuret reaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中

21、與硫蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反雙縮脲反應應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。（五）蛋白質的呈色反應（五）蛋白質的呈色反應考馬斯亮藍反應考馬斯亮藍反應 G G250250染料在酸性條件下和蛋白質染料在酸性條件下和蛋白質結合形成結合形成藍色藍色物質，波長由物質，波長由465nm465nm變成變成595nm595nm?？蛇M行定量檢測。可進行定量檢測。在水和各種有機溶劑中的溶解性。在水和各種有機溶劑中的溶解性。在不同溫度、在不同溫度、pHpH值和各種緩沖液中生物大分子的

22、穩(wěn)值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。定性。各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性。其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學試劑的穩(wěn)定性。性和對各種化學試劑的穩(wěn)定性。對其他生物分子的特殊親和力對其他生物分子的特殊親和力。目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是目前純化

23、蛋白質等生物大分子的關鍵技術是 （一）透析及超濾法（一）透析及超濾法* * 透析透析(dialysis)(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。開的方法。* * 超濾法超濾法 應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。半透膜阻留半透膜阻留prpr分子，而分子，而讓小的溶質分子和水通讓小的溶質分子和水通過，以達到除去蛋白質過，以達到除去蛋白質溶液中小分子（鹽、低溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。分子酸等）

24、。施以一定的壓力使小施以一定的壓力使小分子溶質通過一半透分子溶質通過一半透膜，而按半透膜的篩膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應的蛋孔大小截留相應的蛋白質分子白質分子（二）根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行分離（二）根據(jù)蛋白質溶解度的差異進行分離等電點沉淀等電點沉淀鹽析、有機溶劑沉淀鹽析、有機溶劑沉淀* * 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)(ultracentrifugation)既既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。定蛋白質的分子量。 * *蛋白質在離心場中的行為用蛋白質在離心場中的行為用沉降系數(shù)沉降系數(shù)(sediment

25、ation coefficient, S)(sedimentation coefficient, S)表示表示, ,沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關 。超速離心超速離心因為沉降系數(shù)因為沉降系數(shù)S S大體上和分子量成正比大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質不適用。維狀蛋白質不適用。沉降的速度與顆粒的重量、沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關。密度和形狀有關。離心后離心后按其沉降的速度不同，彼按其沉降的速度不同，彼此分開

26、形成區(qū)帶。再進行此分開形成區(qū)帶。再進行光學定位，針刺或冰凍切光學定位，針刺或冰凍切片采樣分析片采樣分析層析層析(chromatography)(chromatography)分離蛋白質的原理分離蛋白質的原理待分離蛋白質溶液（流動相）經(jīng)過一個固待分離蛋白質溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋態(tài)物質（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質的目的速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質的目的 。（四）層析（四）層析蛋白質分離常用的層析方法蛋白質分離常用的層析方法* * 離子交換層析：離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。質不同進行分離。* * 凝膠過濾凝膠過濾(gel filtration)(gel filtration)又稱分子篩層析，又稱分子篩層析，利用各蛋白質分子大小不同分離。利用各蛋白質分子大小不同分離。目目 錄錄目目 錄錄蛋白質在高于或低于其蛋白質