1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)考試試題細(xì)胞破碎 1 常用的細(xì)胞破碎的方法有哪些？ 機(jī)械法：研磨，高速搗碎機(jī)；物理法：反復(fù)凍溶，超聲波破碎，壓榨法；化學(xué)與生物化學(xué)法：自溶，溶脹法，酶解法，有機(jī)溶劑處理。 2 有機(jī)溶劑法破碎細(xì)胞原理，常用的有機(jī)溶劑有哪些 ？有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等 3 酶法破碎細(xì)胞原理：酶分解作用 4 反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞原理：通過(guò)反復(fù)將細(xì)胞放在低溫下突然冷卻和室溫下融化達(dá)到破壁作用 層析技術(shù) 1.什么叫層析技術(shù)？層析技術(shù)是利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差別（分子親和力、吸附力、分子的形狀和大小、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相，其中一個(gè)是固定相，

2、另一個(gè)是流動(dòng)相，從而使各組分以不同速度移動(dòng)而使其分離的方法。 2、按層析過(guò)程的機(jī)理，層析法分哪幾類(lèi)？按操作形式不同又分哪三類(lèi)？根據(jù)分離的原理不同分類(lèi)，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析等。按操作形式不同又分層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。3.指出常用層析技術(shù)的應(yīng)用范圍。 凝膠層析法：脫鹽；用于分離提純；測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量；高分子溶液的濃縮 離子交換層析法：主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子 高效液相層析法：液-固吸附層析；液-液分配層析；離子交換層析 4.SephadexG-100凝膠柱層析分離蛋白質(zhì)

3、原理是什么？ 大小不同的分子經(jīng)過(guò)的路線長(zhǎng)短不同而達(dá)到分離作用。5.用Sephadex G25脫鹽時(shí)蛋白質(zhì)和鹽哪個(gè)先出峰？ 蛋白質(zhì) 6.相對(duì)分子量為8萬(wàn)和10萬(wàn)的蛋白質(zhì)能否在SephadexG-75柱中分開(kāi)？為什么？ 不能,分子量差距太小。 7.將分子量分別為a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三種蛋白質(zhì)混合溶液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，正常情況下，將它們按被洗脫下來(lái)的先后排序。 c、a、b 8.離子交換層析與凝膠過(guò)濾哪種分辨率高？ 離子交換層析較高。 9.如果樣品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4條件下，這兩種氨基酸那一種與CM（陽(yáng)離

4、子交換劑）結(jié)合的緊密？如果用pH4-7的洗脫液梯度洗脫，那種氨基酸先洗脫出來(lái)？ Ala 10. 柱層析時(shí)濕裝柱的注意事項(xiàng)有哪些？ 用水灌注、不能有氣泡。 11.說(shuō)說(shuō)離子交換層析中洗脫液的選擇原則 陰離子交換劑選用陽(yáng)離子緩沖液（如氨基乙酸、銨鹽、Tris等），陽(yáng)離子交換劑選用陰離子緩沖液（如乙酸鹽、磷酸鹽等），以防緩沖離子參與交換過(guò)程，降低交換劑的交換容量。緩沖液pH值的選擇要使被分離物質(zhì)的電荷與平衡離子電荷的正負(fù)性相同。選用的緩沖系統(tǒng)對(duì)分離過(guò)程無(wú)干擾。要確定一定的離子強(qiáng)度。 12、離子交換層析的原理：離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相,利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來(lái)

5、分離離子型化合物的一種方法。 13、親和層析的原理：親和層析是應(yīng)用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理,將配基通過(guò)共價(jià)鍵牢固結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對(duì)它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識(shí)別。 14、吸附層析的原理：組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑, 各能力不同而進(jìn)行分離的方法。 15、試述凝膠層析原理，并列出常用凝膠名稱凝膠層析柱裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各組分的混合液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，各組分在層析柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)。一種是隨著溶液流動(dòng)而進(jìn)行的垂直向下的移動(dòng)，另一種是無(wú)定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠微孔，只能分布于凝膠顆粒的間歇中以較快

6、速度流過(guò)凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠微孔，不斷進(jìn)出一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，因此流動(dòng)速度較慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子量由大到小順序先后流出層析柱得到分離。 常用凝膠：葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠。 16、 說(shuō)明紙層析和離子交換層析分離氨基酸混合物的方法是根據(jù)氨基酸的什么性質(zhì)? 紙層析是分配層析，利用分配系數(shù)不同，即氨基酸在兩相中的溶解能力不同。離子交換層析利用氨基酸是兩性物質(zhì)，在一定pH下不同氨基酸帶電性質(zhì)和帶電量不同，因此交換能力不同。 17、簡(jiǎn)述薄層層析法分離糖類(lèi)的原理? 薄層層析的實(shí)質(zhì)就是吸附層析，也就是在鋪有吸附劑的薄層上，經(jīng)過(guò)反復(fù)地被吸附劑吸附以及被擴(kuò)展劑擴(kuò)展的過(guò)程

7、。而吸附劑對(duì)不同的物質(zhì)的吸附力不同，從而使糖在薄層上的涌動(dòng)速度不同達(dá)到分離的目的紙層析分離氨基酸 1為什么苯丙氨酸的Rf值大于賴氨酸 因?yàn)樗c濾紙的吸附性很強(qiáng)，故擴(kuò)散的慢，郵寄溶劑與濾紙吸附性差，故擴(kuò)散的快。苯丙氨酸是非極性氨基酸，其易隨著有機(jī)溶劑一起擴(kuò)散，而賴氨酸正好相反。故最后苯丙氨酸走的更遠(yuǎn)些，因而使苯丙氨酸Rf較大些。 2為什么脯氨酸和茚三酮加熱后是黃色斑點(diǎn) 脯氨酸等伯胺氨基酸與茚三酮反應(yīng)可生成黃色化合物。 4紙層析和柱層析的一般操作步驟 紙層析：點(diǎn)樣、層析、標(biāo)記前沿、烘干、顯色、得到層析圖譜、標(biāo)記色斑 柱層析：裝柱、平衡、上樣、洗脫、收集、檢測(cè)、測(cè)定 5.何謂Rf值？影響Rf值的因素

8、？Rf是原點(diǎn)到層析中心的距離與原點(diǎn)到溶劑前沿的距離之比。Rf的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，性質(zhì)，溶劑系統(tǒng)，層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度有關(guān)，對(duì)同一種物質(zhì)來(lái)講Rf是一個(gè)常量。電泳原理 1、電泳的原理：電泳是指帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 2.常見(jiàn)的凝

9、膠電泳有哪幾種？說(shuō)明其主要用途，并比較其主要優(yōu)缺點(diǎn)。 A醋酸纖維素薄膜電泳。用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，類(lèi)固醇及同工酶等的分離分析中。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)缺點(diǎn)是它的分辨力不夠高。（比聚丙酰胺凝膠電泳低） B凝膠電泳。用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)，如大的DNA或者RNA分子的分離，酶譜法等。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無(wú)法分離的DNA片段。 C等電聚焦電泳。應(yīng)用蛋白質(zhì)和兩性分子的分離等。兩性優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，區(qū)帶清晰、窄，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可測(cè)定蛋白或多肽的等電點(diǎn)。缺點(diǎn)是需無(wú)鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白

10、。 3.從分離原理和實(shí)際應(yīng)用兩方面簡(jiǎn)單說(shuō)明SDS-PAGE和PAGE技術(shù)方法有何主要區(qū)別？ 非變性凝膠電泳，也稱為天然凝膠電泳，與變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過(guò)程中和電泳后都不會(huì)變性。最主要的有以下幾點(diǎn)： A. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS，而變性凝膠的有SDS。 B. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒(méi)有SDS，也沒(méi)有巰基乙醇。 C.在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小，不像SDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)分離只與其分子量有關(guān)。 D.非變性凝膠電泳中，酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的，不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動(dòng)。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通

11、常是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶正電荷，需要將陰極和陽(yáng)極倒置才可以電泳。 因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳，所有的電泳時(shí)候電流不能太大，以免電泳時(shí)產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性，而且步驟都要在0-4度的條件下進(jìn)行，這樣才可以保持蛋白質(zhì)的活性，也可以降低蛋白質(zhì)的水解作用。這點(diǎn)跟變性電泳也不一樣。 所以與SDS-PAGE電泳相比，非變性凝膠大大降低了蛋白質(zhì)變性發(fā)生的機(jī)率。 4、試分析影響電泳的主要因素有哪些？ （1）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快； （2） 顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快； （3）電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快； （4） 溶液的pH值：影響被分

12、離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快； （5） 溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快； （6） 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；（7）電滲現(xiàn)象：電場(chǎng)中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)； （8）支持物篩孔大小，孔徑越小，電泳速度越慢，反之越快。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白時(shí)，使用的電泳緩沖液PH8.3，那么樣品應(yīng)點(diǎn)在哪端？為什么？ 在負(fù)極。因?yàn)殡娪揪彌_液PH8.3時(shí)，血清蛋白的幾種蛋白電離后都帶上負(fù)電荷，所有只有點(diǎn)樣在負(fù)極端，外加電壓后，才能向正極移動(dòng)，彼此才能分開(kāi)。（PH值大于等電點(diǎn)時(shí)帶負(fù)電荷 ,小于等電點(diǎn)時(shí)帶正電） 6.簡(jiǎn)述不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電

13、泳中的三個(gè)不連續(xù)及三種物理效應(yīng)。 三個(gè)不連續(xù)：（1）凝膠由上下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同； （2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同； （3）在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。 三種物理效應(yīng)：（1）電荷效應(yīng)：酶蛋白按其所帶電荷的種類(lèi)及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定的電極以一定的速度泳動(dòng)。 （2）分子篩效應(yīng)：分子量、形狀不同的分子在經(jīng)過(guò)凝膠孔徑過(guò)程中，受到的阻力不同，因此移動(dòng)速率不等。 （3）濃縮效應(yīng)：使待分離樣品中的各組分在濃縮膠中被壓縮成層，使原來(lái)很稀的樣品得到高度的濃縮。 7、為什么SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量？在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉

14、（SDS），形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合了大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)，形成了僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間的天然的電荷差異，此時(shí)，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值呈直線關(guān)系，符合下列方程： 10Mr = b?mR + K 8、連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳與不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有什么不同？不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳包含了兩種以上的緩沖液成分、pH值和凝膠孔徑，而且在電泳過(guò)程中形成的電位梯度亦不均

15、勻。由此產(chǎn)生的濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 9、聚丙烯酰胺凝膠電泳的主要優(yōu)點(diǎn)及用途：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N'甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，沒(méi)有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不易和樣品相互作用。 由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的凝膠成分，使之既有適宜的空隙度，又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。當(dāng)丙烯酰胺的濃度增加時(shí)可以減少雙含丙烯酰胺，以改進(jìn)凝膠的機(jī)械性能。 在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對(duì)熱穩(wěn)定。凝膠無(wú)

16、色透明，易觀察，可用檢測(cè)儀直接測(cè)定。 丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過(guò)自由基引發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝膠。 10、瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)？（1） 瓊脂含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附極微。（2）瓊脂作為支持體有均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。（3）電泳速度快。（4）透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測(cè)儀作定量測(cè)定。（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收，有利于制止備。然而瓊脂中有較多硫酸根，電滲作用大。瓊脂糖是從

17、瓊脂中提取出來(lái)的，是由半乳糖和3.6-脫水-L- 半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。含硫酸根比瓊脂少，因而分離效果明顯提高。 瓊脂（糖）電泳常用緩沖液的pH在6-9之間，離子強(qiáng)度為0.02-0.05。離子強(qiáng)度過(guò)高時(shí)，會(huì)有大量電流通過(guò)凝膠，因而產(chǎn)生熱量，使凝膠的水份量蒸發(fā)，析出鹽的結(jié)晶，甚至可使凝膠斷裂，電流中斷。常用的緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。為了防止電泳時(shí)兩極緩沖液槽內(nèi)pH和離子強(qiáng)度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內(nèi)的緩沖液，混勻后再用。 11、凝膠電泳的一般操作步驟：制膠，加入電泳緩沖液，加樣，電泳，剝膠，染色，脫色。蛋白質(zhì)電泳 1、簡(jiǎn)述血清蛋白的醋酸纖維薄膜的電泳原理？血清蛋白中各種蛋

18、白質(zhì)離子在電場(chǎng)力的作用下向著與自身電荷相反的方向涌動(dòng)，而各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同，且在PH為8.6時(shí)所帶電荷不同，分子大小不等，形狀各有差異，所以在同一電泳下永動(dòng)速度不同從而實(shí)現(xiàn)分離。2、醋酸纖維薄膜電泳時(shí)點(diǎn)樣端應(yīng)靠近電極的哪一端，為什么？電泳時(shí)點(diǎn)樣端應(yīng)靠近負(fù)極，因?yàn)檠逯懈鞣N蛋白質(zhì)在PH為8.6的環(huán)境中均帶負(fù)電，根據(jù)同性相吸，異性相斥原理，點(diǎn)樣端在負(fù)極時(shí)蛋白質(zhì)向正極泳動(dòng)從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分離。3、血清醋酸纖維薄膜電泳可將血清蛋白依次分為哪幾條帶？哪帶電泳最快？影響電泳速度有哪些？有血清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白、r-球蛋白；其中血清蛋白點(diǎn)用最快。影響因素蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)，分子大小與

19、形狀以及緩沖液濃度。4、醋酸纖維薄膜電泳分離人血清實(shí)驗(yàn)方法中，電壓正常范圍是多大？電壓過(guò)大會(huì)造成什么樣的結(jié)果？ 電泳電壓的大小，時(shí)間的長(zhǎng)短與緩沖液的離子強(qiáng)度都有一定的關(guān)系。一般電流約0.40.6mA/cm，電壓110160V，通電時(shí)間4060min。電壓高，電流大，電泳速度加快，時(shí)間縮短，但薄膜上蒸發(fā)嚴(yán)重，因此不能無(wú)限增大電流。5、PAGE是現(xiàn)代生物科學(xué)研究中主要用來(lái)分離分析蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的核心技術(shù)之一，該技術(shù)分辨率較高的主要因素有哪幾種？簡(jiǎn)要說(shuō)明。 A.聚丙烯酰胺凝膠是一種透明而不溶于水的韌性凝膠，其在電泳中除了具有電泳的分離外，還具有分子篩的作用，故而提高了分辨率 B聚合物分子中含

20、有許多酰胺基，所以凝膠具有良好的親水性，能在水中溶脹但不溶解。 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 1 紫外吸收法與Folin-酚比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量相比，有何缺點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)？ 紫外吸收法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，靈敏度高。缺點(diǎn)：核酸干擾 2 若樣品中含有核酸類(lèi)雜質(zhì)，應(yīng)如何校正？ 校正:計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的OD280/OD260比值后，查(紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量校正數(shù)據(jù)表）校正因子“F”值，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式-蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F×1/d×OD280×D計(jì)算該溶液的蛋白質(zhì)濃度；D-溶液的稀釋倍數(shù)，d比色杯的厚度（cm） 3 試說(shuō)明考馬斯亮藍(lán)G250法的優(yōu)缺點(diǎn)。 考馬斯亮藍(lán)G250 當(dāng)該染料

21、與蛋白質(zhì)結(jié)合后為青色 ，在波長(zhǎng)595nm有最大吸收；其吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。靈敏度高，是常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定法。缺點(diǎn)：、大量的去污劑如TritonX-100，SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定。B、蛋白質(zhì)與改染料2min反應(yīng)達(dá)平衡，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)穩(wěn)定。時(shí)間太長(zhǎng)，結(jié)果偏低。 4 簡(jiǎn)述4種測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法及其原理。 (1)考馬斯亮藍(lán)G-250染色法： 考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合蛋白質(zhì)后，形成藍(lán)色CBG-蛋白質(zhì)結(jié)合物，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（10-1000ug/ml），CBG-蛋白質(zhì)結(jié)合物的O.D595nm值與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用分光光度法進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。 （

22、2）雙縮脲法： 蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量及aa成分無(wú)關(guān)，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量； （3）Folin-酚試劑法（Lowry法）： 是雙縮脲法的發(fā)展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，然后這個(gè)復(fù)合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物）比雙縮脲法靈敏，但費(fèi)時(shí)； （4）紫外吸收法： 蛋白質(zhì)中一些氨基酸殘基中的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，最大吸收峰在280nm處，在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，可用

23、作定量測(cè)定，簡(jiǎn)單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃度的鹽類(lèi)不干擾。 （5）微量凱式定氮法： 根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，因此，測(cè)得1g蛋白氮，相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)。5 蛋白質(zhì)的分離常用的方法有哪些？1、 前處理：選擇適當(dāng)?shù)钠扑榧?xì)胞的方法破碎細(xì)胞，組織細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)（一般用緩沖液）把所要的蛋白質(zhì)提取出來(lái)。2、粗分離：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物提取液獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)。一般這一步的分級(jí)用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。這種方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)溶液。 3、細(xì)分離：也就是樣品的進(jìn)一步提純，一般使用層析法，包

24、括凝膠過(guò)濾層析，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可以選擇電泳法。 6 蛋白質(zhì)顯色黃色反應(yīng)的原理是什么?反應(yīng)結(jié)果為什么深淺不一？含有苯環(huán)的氨基酸如酪氨酸和色氨酸，能被硝酸硝化成黃色的物質(zhì)，而且不同蛋白質(zhì)中所含的苯環(huán)數(shù)量不同，造成與試劑反應(yīng)的程度不同，因此呈現(xiàn)顏色深淺不一 。雙縮脲法測(cè)蛋白質(zhì)含量 1.雙縮脲法定量測(cè)生物材料中蛋白質(zhì)是否適合所有樣品，如植物塊莖等 不是。在生物實(shí)驗(yàn)中，雙縮脲是用來(lái)測(cè)蛋白質(zhì)的，現(xiàn)在是出現(xiàn)紫紅色。選材時(shí)要注意蛋白質(zhì)含量要高，材料顏色為白色或接近白色。故并非適用所有樣品。 2.比值法雙縮脲法定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點(diǎn)？ 優(yōu)點(diǎn)：快速，蛋白質(zhì)特異性影響小。 缺點(diǎn)：

25、準(zhǔn)確度差，蛋白質(zhì)樣品被破壞，干擾因素不易排除。 沉淀技術(shù) 1 蛋白質(zhì)沉淀的常用方法有哪些 鹽析沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法 2什么是鹽析，鹽析的原理，列舉鹽析時(shí)常用的鹽 一般是指溶液中加入無(wú)機(jī)鹽類(lèi)而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過(guò)程。 原理：蛋白質(zhì)在水中的溶解度受到溶液中鹽濃度的影響。一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。而在鹽濃度升高到一定濃度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨鹽濃度的升高而降低，使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。在某一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度各不相同，由此可達(dá)到彼此分離的目的。 主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉 3簡(jiǎn)

26、述等電點(diǎn)沉淀及原理 通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值至某種溶質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)時(shí)，使其溶解度降低，沉淀析出，而與其他組分分離的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。 原理：在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點(diǎn)時(shí)的許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過(guò)濾。 4什么是有機(jī)溶劑沉淀，列舉常用的有機(jī)溶劑 利用要分離物質(zhì)與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過(guò)添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使某種溶質(zhì)沉淀析出，從而與其他組分分離的方法稱為有機(jī)溶劑沉淀法。 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、

27、丙酮、異丙醇、甲醇等。 5雞蛋清可以用作鉛汞中毒的解毒劑是為什么? 由于重金屬離子能與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)如COOH等作用，生成難溶重金屬的蛋白質(zhì)鹽，減少機(jī)體對(duì)重金屬的吸收。6影響蛋白質(zhì)沉淀的因素是什么？沉淀和變性有什么聯(lián)系？水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面形成水化層和雙電層從而形成穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下蛋白質(zhì)顆粒因失去電荷和脫水而沉淀。這些因素包括溶液的酸堿度、鹽溶液的濃度、溫度、重金屬離子以及有機(jī)溶劑等。變性蛋白質(zhì)不一定沉淀，沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性。沉淀時(shí)蛋白質(zhì)可能仍然保持天然構(gòu)像，而變性是蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞失去活性。維生素C的測(cè)定 1. 指出本實(shí)驗(yàn)采用的定量測(cè)定維生素C

28、的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？ 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行，快速，比較準(zhǔn)確。 缺點(diǎn)：易受其它還原物質(zhì)干擾，滴定終點(diǎn)難以確定。 2. 2,6-D的作用是什么？ A.氧化劑的作用。還原抗壞血酸。 B作為指示劑，判斷滴定終點(diǎn)，以計(jì)算樣品含量 3.滴定管的使用 洗滌、裝液、計(jì)數(shù)、滴定 酶的提取純化與活力測(cè)定 1. 從某細(xì)胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質(zhì)，總活力為360單位。經(jīng)過(guò)一系列純化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，總活力為288單位。請(qǐng)問(wèn)回收率是多少？純化了多少倍？比活力=酶活力單位數(shù)/酶蛋白質(zhì)量 純化倍數(shù) =純化后的比活力 / 粗抽提液比活力 產(chǎn)率(回收率) =純化后的總活

29、力單位 / 粗抽提液總活力單位 2.簡(jiǎn)述酶分離純化的基本過(guò)程 A 抽提：破碎細(xì)胞，動(dòng)植物組織一般可用組織搗碎器；或者加石英砂研磨，將材料做成丙酮粉或進(jìn)行冰凍融解；對(duì)細(xì)菌，常采用加砂或加氧化鋁研磨和超聲波振蕩方法破碎。 B濃縮：加中性鹽或冷乙醇沉淀后再溶解，膠過(guò)濾濃縮以及超過(guò)濾濃縮法等。 C純化：利用鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、層析純化法、等電點(diǎn)法吸附分離法進(jìn)行純化。 D結(jié)晶：濃縮液經(jīng)過(guò)各種方法的純化，可得到較純的結(jié)晶產(chǎn)品。 4 酶的制備及提取過(guò)程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng) 3.常用的酶活力單位？ U（指特定條件（25，其它為最適條件）下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量）、Kat（在最適條件下，1秒鐘能使

30、1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量）。1 Kat=6×107U， 1U=16.67n 比活力概念及意義 比活力用每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)表示。 比活力=酶活力單位數(shù)/酶蛋白質(zhì)量 酶的比活力比活力代表酶制劑的純度。對(duì)于同一種酶來(lái)說(shuō)，比活力愈大，表示酶的純度愈高。 4.什么是抑制劑？什么是變性劑？區(qū)別是什么？凡是能使酶活性降低而不使酶失活變性的物質(zhì)成為抑制劑；凡是能引起蛋白質(zhì)變性失活的物質(zhì)叫變性劑。抑制劑只是抑制蛋白質(zhì)的特性而變性劑則破環(huán)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。淀粉酶活力的測(cè)定 1如何正確繪制和使用標(biāo)準(zhǔn)曲線? 在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度一般可選擇5種濃度梯度，測(cè)其吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制

31、曲線，需要至少有三個(gè)點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線才可用，繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后相同條件下操作測(cè)定相同物質(zhì)時(shí)使用。 2.淀粉酶原液和1%的淀粉溶液置于40水浴中保溫的作用 酶反應(yīng)需要適宜的溫度。只有在一定的溫度條件下才表現(xiàn)出最大活性。40°C是淀粉酶的最適溫度，所以將酶液和底物先分別保溫至最適溫度，然后再進(jìn)行酶反應(yīng)，這樣才能使測(cè)得的數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。 3.3,5二硝基水楊酸作用： 提供堿性環(huán)境，使酶失去活性；做氧化劑，與還原糖反應(yīng)，起到顯色作用。 4.淀粉酶的最適溫度為40°C，最適PH為5.6.5.如何操作能減小標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果誤差？ A：標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能

32、包括待測(cè)樣品的可能變異最低和最高指，一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加，并應(yīng)與被測(cè)液同樣條件下顯色測(cè)定。 B標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀23次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而造成的誤差。核酸1、核酸的含量測(cè)定常用的方法有哪些？（1）紫外分光光度法；（2）定磷法：鉬藍(lán)比色法（3）瓊脂糖凝膠電泳法 （4）定糖法： RNA+鹽酸糠醛+地衣酚670，鮮綠色； DNA+二苯胺595,藍(lán)色化合物 2、如何證明提取到的某種核酸是DNA還是RNA？（1）用定糖法檢測(cè)。（2）用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。（3）用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3、RNA水解后的三大組分是什么？怎樣各自驗(yàn)證的？核糖，磷酸

33、，嘌呤堿。核糖+苔黒酚Fe（濃HCI）綠色物質(zhì)；磷酸+鉬酸銨藍(lán)色；嘌呤堿+硝酸銀白色粗脂肪的提取1、粗脂肪的提取和含量測(cè)定的基本原理。脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸結(jié)合成的脂類(lèi)化合物, 能溶于脂溶性有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑將脂肪提取出來(lái)，借蒸發(fā)除去溶劑后稱量。整個(gè)提取過(guò)程均在索氏提取器中進(jìn)行。通常使用的脂溶性溶劑為乙醚或沸點(diǎn)為30oC -60 oC的石油醚。用此法提取的脂溶性物質(zhì)除脂肪外，還含有游離脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故稱為“粗脂肪”。 2、索氏提取器是由哪幾部分組成的？提取瓶，提取管和冷凝管三部分組成。 3、粗脂肪的提取實(shí)驗(yàn)中

34、如何減少誤差？（1）材料和提取瓶充分干燥。（2）材料盡可能的不損失。(3)提取充分完全。（4）提取后瓶子還要充分的干燥。離心技術(shù) 15、普通離心機(jī)的使用注意事項(xiàng)？ (1).離心機(jī)要置水平位置,以保證旋轉(zhuǎn)軸垂直地球水平面。 (2).使用前應(yīng)檢查套環(huán)是否平衡(臺(tái)稱)。 (3).離心杯及其外套(離心管套)是否平衡(臺(tái)稱)。 (4).樣品傾入離心杯后應(yīng)與離心管套一起兩兩平衡，平衡后把它們放置于轉(zhuǎn)子的對(duì)稱位置。 (5).蓋好蓋子,打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),調(diào)整離心時(shí)間。 (6).啟動(dòng)離心時(shí)轉(zhuǎn)速應(yīng)由小至大,緩慢升速(一般要23min)。 (7).達(dá)到預(yù)定轉(zhuǎn)速后再調(diào)整離心時(shí)間至預(yù)定時(shí)間(10min)。 (8).離心完成后要調(diào)整調(diào)速連桿至零位,同時(shí)關(guān)上電源。 (9).要等到轉(zhuǎn)速為零時(shí)才能打開(kāi)離心機(jī)蓋,取出樣品。2.制備離心機(jī)有哪幾種類(lèi)型？比較它們的特點(diǎn)和用途。 A普通離心機(jī)；特點(diǎn)型號(hào)很多，容量不同，轉(zhuǎn)速不同，控制不精密；用途固液沉淀分離。 B高速離心機(jī)；特點(diǎn)型號(hào)較多，轉(zhuǎn)速不同，有控溫裝置，控制精密（時(shí)間、轉(zhuǎn)速），用途菌體、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器等的分離。 C超速離心機(jī)；特點(diǎn)控制精密：時(shí)間控制