1、微藻的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)學(xué)生：林曉生 學(xué)號(hào)：2120180414導(dǎo)師：楊縝教授一、藻類(lèi)的概述 藻類(lèi)是原生生物界一類(lèi)真核生物(有些也為原核生物，如藍(lán)藻門(mén)的藻類(lèi)）。主要水生，無(wú)維管束，能進(jìn)行光合作用。藻類(lèi)植物共約為2100屬,27000種。根據(jù)所含色素、細(xì)胞構(gòu)造、生殖方法和生殖器官構(gòu)造的不同，分為綠藻門(mén)、 裸藻門(mén)、輪藻門(mén)、 金藻門(mén)、黃藻門(mén)、硅藻門(mén)、甲藻門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、褐藻門(mén)和紅藻門(mén)。色素的顏色劃分，藻可分為3類(lèi)：綠藻、褐藻和紅藻。 由于單胞藻具有利用太陽(yáng)光能效率高、營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)繁殖迅速、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)和容易培養(yǎng)等重要特性，因而受到重視。微藻是一類(lèi)在陸地、海洋分布廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富、光合利用度高的自養(yǎng)植物，細(xì)胞

2、代謝產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)、色素等，使其在食品、醫(yī)藥、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域具有很好的開(kāi)發(fā)前景。二、微藻的營(yíng)養(yǎng)模式和生長(zhǎng)模式（二）、微藻的生長(zhǎng)模式 藻類(lèi)在培養(yǎng)過(guò)程中，生長(zhǎng)繁殖的速度，出現(xiàn)一定的起伏，這種生長(zhǎng)模式可劃分為五個(gè)時(shí)期（延緩期、指數(shù)生長(zhǎng)期、相對(duì)生長(zhǎng)下降期、靜止期、死亡期）。三、培養(yǎng)按培養(yǎng)的場(chǎng)所分室內(nèi)培養(yǎng)和室外培養(yǎng)1） 按培養(yǎng)基的形態(tài)分固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng) 2）按培養(yǎng)的純度分 純種培養(yǎng) 和 單種培養(yǎng)3）按藻液的流動(dòng)情況分靜止培養(yǎng)和循環(huán)流動(dòng)水培養(yǎng) 4）按氣體交換情況分充氣培養(yǎng)和不充氣培養(yǎng) 5）按藻液與外界接觸程度分封閉式培養(yǎng)和開(kāi)放式培養(yǎng) 6）按培養(yǎng)規(guī)模和目的分小型培養(yǎng)、中繼培養(yǎng)和大量培養(yǎng)方式簡(jiǎn)

3、單介紹其中的四種方式：（1） 純培養(yǎng)和單種培養(yǎng)純培養(yǎng)（axenic culture）：是無(wú)菌培養(yǎng)，指排除了包括細(xì)菌在內(nèi)的一切生物的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。純培養(yǎng)操作要求十分嚴(yán)格，要求有無(wú)菌室、超凈臺(tái)等設(shè)備，容器、工具、培養(yǎng)液等均須徹底滅菌。培養(yǎng)成功率很高，是進(jìn)行科學(xué)研究不可缺少的技術(shù)。單種培養(yǎng)（single-species culture）：指區(qū)別于純培養(yǎng)的不排除細(xì)菌存在的培養(yǎng)（可以是生產(chǎn)性的，也可以是非生產(chǎn)性的）（2） 封閉式培養(yǎng)和開(kāi)放式培養(yǎng)封閉式培養(yǎng)（closed culture）：指把培養(yǎng)液密封在透明的容器中，與外界空氣隔離，暴露在陽(yáng)光中，CO2完全采用人工供給的方法。各種反應(yīng)器等開(kāi)放式培養(yǎng)：

4、指把藻類(lèi)培養(yǎng)在開(kāi)敞容器中，如廣口玻璃瓶、水族箱、玻璃鋼水槽、水泥池等。封閉式塑料薄膜袋培養(yǎng)，方法簡(jiǎn)單，成本低、培養(yǎng)的藻細(xì)胞密度大，不易污染且生產(chǎn)周期短，效果很好。（3） 小型培養(yǎng)、中繼培養(yǎng)和大量培養(yǎng)小型培養(yǎng)：一級(jí)培養(yǎng)，目的是培養(yǎng)和供應(yīng)藻種，用于科研等。一般采用封閉式不充氣一次性培養(yǎng)方式，培養(yǎng)容器一般采用1003000ml的三角燒瓶。中繼培養(yǎng)：又稱(chēng)二級(jí)培養(yǎng)，目的是藻種擴(kuò)大培養(yǎng)，供應(yīng)生產(chǎn)性大量培養(yǎng)的藻種。一般在室內(nèi)大的玻璃容器或塑料大袋中進(jìn)行。大量培養(yǎng)：也叫三級(jí)培養(yǎng)，目的是為培養(yǎng)動(dòng)物提供大量單胞藻餌料。有室內(nèi)和室外兩種。目前主要采取室內(nèi)、開(kāi)放式、通氣、一次性或半連續(xù)培養(yǎng)法，培養(yǎng)容器有大型玻璃鋼水槽

5、、大型水泥池或塑料薄膜袋等（也有用土池）。單胞藻生產(chǎn)性擴(kuò)大培養(yǎng)常用流程500mL藻種5000mL三角燒瓶細(xì)口玻璃瓶塑料桶封閉式塑料薄膜水泥池一級(jí)培養(yǎng)二級(jí)培養(yǎng)三級(jí)培養(yǎng)四、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程1.消毒2.配制培養(yǎng)液3.接種4.培養(yǎng)管理5.收獲1容器、工具和水消毒方法總結(jié)一級(jí)培養(yǎng)（實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)）：金屬器具和試管口、瓶口：直接灼燒；玻璃器皿：洗液+烘箱；紙、棉花、紗布：烘箱；培養(yǎng)用水：砂濾水脫脂棉煮沸冷卻（洗液：15g重鉻酸鉀+200mg濃硫酸混勻）2.培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配方配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹比較常用的幾種： 水生4號(hào)和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍(lán)藻可用朱氏10號(hào)或水

6、生105號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍(lán)藻）；硅藻可用朱氏10號(hào)和水生硅1號(hào)培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無(wú)海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5瓊脂。從以上各種配方，可看到配制藻類(lèi)培養(yǎng)液的幾條原則：（1）要有適量氮源（除固氮藍(lán)藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機(jī)氮等。（2）應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。（3）要考慮各種鹽類(lèi)總濃度和pH是否適合藻類(lèi)需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。（4）要加

7、入各種藻類(lèi)需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。（5）要滿(mǎn)足某些藻類(lèi)特殊需要，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅。（6）要添加適量生長(zhǎng)物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。3.藻種分離方法：常用下列四種。1）微吸管（毛細(xì)管）分離 選直徑較細(xì)（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時(shí)，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認(rèn)真仔細(xì)地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個(gè)培養(yǎng)皿中接2030個(gè)個(gè)體。從分離出少量細(xì)胞擴(kuò)大

8、培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長(zhǎng)時(shí)期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（10005000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純?cè)宸N。此法操作技術(shù)要求高，要細(xì)心。往往吸取一個(gè)細(xì)胞，要反復(fù)幾次才能成功，且適于分離個(gè)體較大藻類(lèi)。2）水滴分離法 用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過(guò)載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個(gè)載片上滴24滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個(gè)所需同種藻類(lèi)個(gè)體，無(wú)其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復(fù)重做，直到達(dá)到目的。此法簡(jiǎn)便易行，尤其適宜于

9、分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)種類(lèi)。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類(lèi)多用此法。操作時(shí)同樣要求細(xì)致、認(rèn)真，使用工具及培養(yǎng)液經(jīng)嚴(yán)格消毒。3）稀釋分離法 把含有需要分離的藻類(lèi)而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過(guò)稀釋到適宜程度的方法，達(dá)到把原混雜生物單個(gè)分離培養(yǎng)的目的。首先把水樣稀釋到每一滴含有一個(gè)左右的生物細(xì)胞（也可能一個(gè)都沒(méi)有，也可能有兩個(gè)），在稀釋過(guò)程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度，然后準(zhǔn)備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進(jìn)行培養(yǎng)。待藻類(lèi)生長(zhǎng)繁殖達(dá)一定濃度時(shí)，再檢查是否達(dá)到分離目的，若未達(dá)到，再重復(fù)做。此法操作簡(jiǎn)單易行，但有一定程度盲目性，比不上水

10、滴分離法效果好。4）平板分離法 這個(gè)方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類(lèi)的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過(guò)的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類(lèi)群落，通過(guò)顯微鏡檢查，尋找需要的純?cè)迦郝?，然后用消毒過(guò)的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過(guò)滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進(jìn)行培養(yǎng)。此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對(duì)于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類(lèi)更合適。5）底棲藻的分

11、離 在顯微鏡或放大鏡下挑取個(gè)體，一般可接種在固體培養(yǎng)基平板上，反復(fù)挑選、培養(yǎng)。6）分離浮游藍(lán)藻 可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離硅藻則可利用其易沉淀的特性。 用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北窗口附近光線充足處，但嚴(yán)防陽(yáng)光直射）培養(yǎng)，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養(yǎng)時(shí)，每天輕輕搖動(dòng)12次，但需注意勿把培養(yǎng)液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經(jīng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)物顏色逐漸變深。再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無(wú)其他混雜生物，才達(dá)到單種培養(yǎng)目的。4藻種的選擇： 特征：生長(zhǎng)迅速；對(duì)極端的溫度和輻射條件的耐性范圍大；蛋白質(zhì)，脂類(lèi)和糖類(lèi)含量高，或有選擇地積累一種特殊的代謝產(chǎn)物（如甘油）；無(wú)

12、毒性，且易于收獲。根據(jù)系統(tǒng)的要求和特殊的方法，還可有其他要求。5.接種： 在分離到單純?cè)迦汉螅涂山臃N到培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)而移養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)。 液體接種：是將藻液直接加入培養(yǎng)液中進(jìn)行攪拌，水溫較低（10以?xún)?nèi)）時(shí)，多加；約占培養(yǎng)液總量的3040左右，水溫適宜時(shí)（2530左右），可加58左右。按種后瓶口用滅菌紙包扎，放在適宜光、溫條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動(dòng)二次。大約二周后進(jìn)行一次移植。藻種在培養(yǎng)過(guò)程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。6藻種的保藏 可接在固體培養(yǎng)基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（冰箱內(nèi)）保藏，每天接受短時(shí)間（幾個(gè)小時(shí)）弱光，可保藏23年；如不照光，只能保藏幾個(gè)

13、月。保藏藻種所用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分濃度應(yīng)比正常培養(yǎng)基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為11.5。也可在固體培養(yǎng)基上，再加培養(yǎng)液，然后接種到培養(yǎng)液中，可以避免固體培養(yǎng)基干涸，保藏效果比單用固體好。7.培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對(duì)穩(wěn)定適宜環(huán)境中大量繁殖生長(zhǎng)。要注意以下因素：1）二氧化碳濃度在開(kāi)放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱?lèi)細(xì)胞上浮獲得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內(nèi)應(yīng)維持二氧化碳濃度在0.15之間。2）光照強(qiáng)度 利用太陽(yáng)光源培養(yǎng)時(shí)，一般在室內(nèi)培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強(qiáng)直射光照射?；蚶萌斯す庠矗?0100瓦電燈或

14、日光燈），需15003000勒克斯/厘米2。3）溫度 適溫一般在1030之間，最適溫常為2025。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設(shè)法調(diào)節(jié)。在夏季，不要把藻類(lèi)培養(yǎng)物放在直射太陽(yáng)光下，而要放在涼爽的場(chǎng)所，例如向北窗臺(tái)上。在秋、冬季節(jié)，如希望藻類(lèi)保持積極生活活動(dòng)狀態(tài)，就要把培養(yǎng)物移到有人工光照處。4）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 應(yīng)不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時(shí)補(bǔ)充被藻吸收后減少了的某些元素。5）注意pH變化 如變動(dòng)過(guò)大，可用酸、堿調(diào)節(jié)。6）適當(dāng)控制培養(yǎng)物中藻細(xì)胞濃度 過(guò)高會(huì)引起光照和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)不足，并導(dǎo)致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范圍內(nèi)。7）及時(shí)觀察和檢查藻類(lèi)生長(zhǎng)情況 可以通過(guò)培養(yǎng)物呈現(xiàn)的顏色、藻類(lèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長(zhǎng)情況。藻種和中繼培養(yǎng)每半月進(jìn)行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不正?，F(xiàn)象，應(yīng)立即鏡檢，目的有兩個(gè)：了解藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并檢查有無(wú)敵害生物污染。8采收： 培養(yǎng)液中藻體的適時(shí)采